張淼　李默　丁寧

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040）

·研究報告·

蝙蝠葛活性成分抑制胃癌SGC-7901細胞轉(zhuǎn)移侵襲作用*

張淼1李默1丁寧2△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040）

目的探討蝙蝠葛活性成分對人胃癌SGC-7901細胞的運動能力及其機制。方法采用劃痕試驗、transwell遷移實驗、transwell侵襲實驗觀察蝙蝠葛活性成分對人胃癌SGC-7901細胞的運動能力、降低SGC-7901細胞轉(zhuǎn)移侵襲作用的影響。結(jié)果與對照組相比較，蝙蝠葛活性成分處理之后，細胞修復(fù)該劃痕的能力減低。蝙蝠葛活性成分作用之后人胃癌SGC-7901細胞通過聚碳酸酯膜的遷移運動能力下降，并且與對照組相比其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。蝙蝠葛活性成分作用之后，人胃癌SGC-7901細胞通過涂抹matrigel膠的聚碳酸酯膜的能力下降，并且與對照組相比其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論蝙蝠葛活性成分能夠抑制胃癌SG07901細胞的運動能力、遷移能力以及侵襲能力。

蝙蝠葛生物活性胃癌SGC-7901細胞轉(zhuǎn)移侵襲

胃癌屬于首位消化道惡性腫瘤病癥，在治療中雖然外科手術(shù)等治療手段取得了較大的進步，然而在生存率方面并不是非常顯著，患者的5年存活率仍然較低［1］。由于胃癌的轉(zhuǎn)移性較高，因此在治療中不僅需要對病灶區(qū)域進行治療，還需要對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移進行控制和治療。本次研究通過劃痕試驗，transwell遷移實驗以及transwell侵襲實驗觀察了蝙蝠葛活性成分對人胃癌SGC-7901細胞的運動能力影響，研究通過降低SGC-7901細胞轉(zhuǎn)移侵襲作用的可能機制，以期為臨床治療胃癌防止其轉(zhuǎn)移提供一定的參考。現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑蝙蝠葛活性成分（中國醫(yī)學科學院昆明植物研究所提供）。人胃癌SGC-7901細胞株（美國模式培養(yǎng)物保藏所提供）。細胞培養(yǎng)液的配制：RPMI Medium 1640（Gibco公司提供）；新生胎牛血清（Fetal calf serum，F(xiàn)CS，Gibco公司提供）；胰蛋白酶（Tripsin）；PBS緩沖液（pH：7.2～7.4，Gibco公司提供）、二甲基亞砜（DMSO）；Matrigel膠；單克隆抗體MMP-2和NM23；十二烷基硫酸鈉（SDS），N，N-亞甲雙丙烯酰胺，TEMED，丙烯酰胺，過硫酸銨（APS），甘氨酸，巰基乙醇，溴酚蘭，脫脂奶粉，甘油，PVDF膜，考馬斯亮藍，泛-actin。

1.2儀器超凈工作臺；37℃恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱；離心機；電熱干燥箱；電子天平；倒置顯微鏡；載波片和蓋玻片；制冰機；磁力攪拌器；微量加樣器（1000、200、100、20、10 μL）；搖床恒溫水浴鍋；96孔培養(yǎng)板，24孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板；光學顯微鏡；transwell小室；全波長酶標儀；SDS-PAGE電泳儀；轉(zhuǎn)膜儀。

1.3實驗方法

1.3.1劃痕試驗利用胰蛋白酶來對人胃癌進行消化，吹打SGC-7901細胞的細胞懸液濃度為5×104個/mL，同時利用均勻的直尺放置在6孔板的后面，用筆畫出橫線，每個孔都畫出4條一樣的橫線，在實驗組和對照組的細胞中放入6孔板，然后再一起放置在37℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，第2天開始使用10 μL的無菌槍頭再畫出橫線，用無菌PBS洗滌3次，去除劃痕下的殘留細胞并加入無血清的培養(yǎng)液之中，同樣要放置在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從培養(yǎng)開始分別于0、24 h后對其進行拍照，記錄下培養(yǎng)結(jié)果，此次試驗需要重復(fù)操作3次。

1.3.2transwell遷移實驗1）取出生長期對數(shù)的SGC-7901細胞，利用胰酶的作用將其消化制作出濃度為5×104個/mL的細胞懸液，最后將其放置在100 mL的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞緊貼瓶壁后方可加入蝙蝠的葛活性成分進行處理，其最終的質(zhì)量濃度分別為2.3，4.9，9.8 μg/mL，將實驗組分為1、2、3組別，再從對照組中加入相同容量的藥物溶劑放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。2）使用孔徑為8 μm聚碳酯膜中的transwell小室24孔板；3）細胞懸液的制作：用胰蛋白對細胞進行消化，停止消化后便可以進行離心試驗，然后使用PBS對其進行2次洗滌，用無血清的培養(yǎng)基來對細胞進行重懸，將其的密度調(diào)整為5×105；4）進行細胞接種的時候首先取出200 W的細胞懸液加入至transwell小室之中，然后再從24孔板下室加入600 μL含有20%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液；5）上述步驟完成后再將24孔板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后取出上室，使用棉簽將上室內(nèi)的細胞擦去；6）將500 μL含0.5 mg/mL MTT的完全培養(yǎng)基加入到24孔板之中，同時置入小室，使得膜能夠浸沒在整個培養(yǎng)基內(nèi)，溫度為37℃，放入培養(yǎng)箱后于4 h后即可取出；7）最后加入至500 μL的DMS0，使德膜完全浸沒在DMSO里，為讓甲臜在培養(yǎng)基中充分溶解振蕩20 min左右，然后取出小室，利用酶標儀對OD值進行測量。

1.3.3transwell侵襲實驗本步驟與上述transwell遷移實驗的實驗步驟基本一致，其中的區(qū)別在于本次實驗需要鋪設(shè)matrigel膠。1）融化matrigel基底膠液，用實驗槍頭吸取出約100 μL的matrigel液，將其加入至預(yù)冷無血清培養(yǎng)基中，充分攪勻，使用50 μL matrigel液將其加入至包被人工基底膜，將整個聚碳酯膜進行合理覆蓋，在4℃下進行風干，使其最終成為matrigel聚合成膠。2）把鋪設(shè)好基底膜的transwell放置入無菌的超凈臺之中，基底膜主要作用為吸出培養(yǎng)基中所剩余的液體，用紫外線對其進行消毒并過夜；3）每個孔內(nèi)加入50 μL的無血清培養(yǎng)液，對其觀察有無出現(xiàn)滲漏的現(xiàn)象，沒有滲漏則使用于侵襲的實驗當中，并在37℃的溫度條件下放置1 h，最后將殘余液體吸走，盡量不要觸碰到膜；4）細胞懸液的制作要用胰蛋白對細胞進行消化，停止消化后便可以進行離心試驗，然后使用PBS對其進行2次洗滌，用無血清的培養(yǎng)基來對細胞進行重懸，將其的密度調(diào)整為5×105/mL；5）進行細胞接種的時候首先取出200 W的細胞懸液加入至transwell小室，加600 μL含有20%的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液進入24孔板下室，去除完氣泡后再將小室放入培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；6）上述步驟完成后再將24孔板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后取出上室，使用棉簽將上室內(nèi)的細胞和基質(zhì)膠擦去；7）將500 μL含0.5 mg/mL MTT的完全培養(yǎng)基加入到24孔板之中，同時置入小室，使得膜能夠浸沒在整個培養(yǎng)基內(nèi)，溫度為37℃，放入培養(yǎng)箱后于4 h后即可取出；8）最后加入至500 μL的DMSO，使膜完全浸沒在DMSO里，振蕩20 min，使甲臜在培養(yǎng)基中充分溶解，取出小室，在酶標儀上測量OD值。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，并對數(shù)據(jù)采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1劃痕結(jié)果分析本次實驗結(jié)果表明，經(jīng)過蝙蝠葛活性成分的處理之后，與對照組相比較之下，其細胞對于劃痕的修復(fù)能力有所降低，說明該成分會抑制胃癌細胞的運動能力。

表1　蝙蝠葛活性成分對胃癌SGC-7901細胞體外遷移能力的影響

2.2tran swell遷移試驗結(jié)果見表1。結(jié)果示加入蝙蝠葛活性成分后，胃癌SGC-7901細胞通過聚碳酸酯膜時移動能力有所降低（P＜0.05），同時蝙蝠葛活性成分的濃度越高，其抑制效果就越強。2.3tran swell侵襲實驗結(jié)果見表2。結(jié)果示人胃癌SGC-7901細胞在蝙蝠葛活性成分的作用之下，通過涂抹上matrigel膠的聚碳酸酯膜時，其移動的能力也有所降低，其差異和對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究結(jié)果表明，蝙蝠葛活性成分的濃度越高，所產(chǎn)生出來的細胞抑制作用就越強，因此說明，蝙蝠葛活性成分可以有效抑制胃癌SGC-7901細胞的運動能力，同時能夠抑制胃癌細胞對人體的侵襲能力。

表2　蝙蝠葛活性成分對胃癌SGC-7901細胞體外侵襲能力的影響

3　討論

腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移主要指的是其惡性的腫瘤細胞在人體的原發(fā)部位侵襲至淋巴管之中，或者是體腔、血管等部位，而轉(zhuǎn)移到靶器官時，則會生長出與原發(fā)腫瘤組織學類型相同的腫瘤細胞［1］。腫瘤細胞在人體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移過程非常復(fù)雜，它的轉(zhuǎn)移步驟包括原發(fā)部位的腫瘤無限制性細胞的增殖，增殖后的腫瘤細胞從原發(fā)部位中脫離出去，然后浸潤在基底膜內(nèi)，透過細胞外基質(zhì)及血管基底膜，從而在血管之中慢慢游走最后進入到人體血液循環(huán)以及淋巴血管中—逃過免疫細胞的抵抗—附著于血管的內(nèi)皮細胞之中—緩慢透過血管內(nèi)皮細胞—再進一步地轉(zhuǎn)移至目標臟器之中進行增殖，轉(zhuǎn)而形成另外一個病灶［2］。癌細胞的轉(zhuǎn)移過程都需要進行失控性的增殖、侵襲、運動、黏附和血管生成等，本次實驗研究發(fā)現(xiàn)，蝙蝠葛活性的成分對于人胃癌中的細胞作用后會使得其通過聚碳酸酯膜的數(shù)量減少，也會讓其運動能力降低，有效抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移形成新病灶［3］。

近年來，關(guān)于上皮源性腫瘤和Nm23基因的關(guān)系研究非常多，許多的惡性腫瘤細胞主要有黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等，這些細胞組織中Nm23陽性表達率顯著下降，說明Nm23參與腫瘤細胞的發(fā)展過程。截止到目前，我國在人胃癌中發(fā)現(xiàn)了9個Nm23基因家族成員，其中，Nm23-H1和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移受抑制有著極為密切的關(guān)系［4］。Nm23-H1的轉(zhuǎn)移機制尚未明確，它只是中對腫瘤細胞的行為在多個層次有著一定影響，被公認的機制Nm23-Hl表達式中由152個氨基酸組成，它通過不同途徑參與細胞調(diào)節(jié)過程，干預(yù)G蛋白所產(chǎn)生的信號傳導行為［5］。在一定程度上促進了腫瘤細胞在體內(nèi)的擴散。同時，它還會影響細胞的骨架結(jié)構(gòu)從而抑制其運動能力［6］。

綜上所述，蝙蝠葛活性成分對于人胃癌中的SGC-7901細胞運動能力、侵襲能力、失控性生長等有著相當重要的作用，它參與了腫瘤細胞的整個運動過程，蝙蝠葛活性成分抑制細胞基因增殖，加強了Nm23的基因抑制作用［7］。因此，我們可以認為蝙蝠葛活性成分有著非常重要的控制胃癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移力的作用，具有非常大的開發(fā)價值及利用價值［8］。本次研究僅探討出了腫瘤細胞相關(guān)發(fā)展過程，其他的細節(jié)及體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移過程是否也保持一樣的抑制性，目前機制還未清楚，需要進一步研究。

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The Effect of Dauricum Active Ingredient on Inhibition of Invasion and Metastasis of SGC-7901 Cell in Gastric Cancer

Gastric Cancer
ZHANG Miao，LI Mo，DING Ning.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China

Objective：To investigate the dauricum active ingredient on the movement ability of SGC-7901 cells in human gastric cancer and its mechanism.Methods：scratch test，ransweII migration assay，transweII invasion experiment were used to observe dauricum active ingredient inhibit the abilities of the movement，migration and invasion of SG07901 cells in gastric cancer.Results：Compared with the control group，after dauricum active ingredient processing，the capacity of the cell to repair scratches reduced.Compared with the control group，dauricum active ingredients made the migration capacity of SGC-7901 cell through polycarbonate membrane decrease，with statistical significance（P＜0.05）.Compared with the control group，dauricum active ingredients made the migration capacity of SGC-7901 cell through polycarbonate membrane with matrigel decrease，with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：Dauricum active ingredient can inhibit the abilities of the movement，migration and invasion of SG07901 cells in gastric cancer.

Menispermum dauricum；Biological activities；Gastric cancer；SGC-7901；Cell invasion and metastasis

R730.59

A

1004-745X（2015）11-1908-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.009

2015-06-04）

黑龍江省自然科學基金面上資助項目（H201319）；黑龍江省博士后資助項目（LBH-Z12253）

（電子郵箱：13845088833@139.com）