夏婉　屠文展　程瑞動(dòng)　何蓉　蔣松鶴△

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江溫州325027；2.浙江省人民醫(yī)院，浙江杭州310024）

刮痧聯(lián)合放血對(duì)熱射病大鼠下丘腦HSP-70 mRNA及蛋白的影響*

夏婉1屠文展1程瑞動(dòng)2何蓉1蔣松鶴1△

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江溫州325027；2.浙江省人民醫(yī)院，浙江杭州310024）

目的觀察背部刮痧結(jié)合放血對(duì)熱射病模型大鼠的影響，檢測(cè)下丘腦熱休克蛋白-70（HSP-70）mRNA及蛋白表達(dá)的變化。方法雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為常溫對(duì)照組，熱應(yīng)激組，刮痧組，放血組和刮痧結(jié)合放血組，每組16只。監(jiān)測(cè)治療前后動(dòng)物心率、直腸溫度、平均動(dòng)脈壓的動(dòng)態(tài)變化及生存時(shí)間。致熱休克后20 min后蛋白印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察大鼠下丘腦HSP-70 mRNA及蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果熱應(yīng)激組大鼠存活時(shí)間為（23±2）min，刮痧組、放血組及刮痧結(jié)合放血組均延長了熱應(yīng)激大鼠的存活時(shí)間（P＜0.01），以刮痧結(jié)合放血組更顯著（P＜0.01）。與常溫對(duì)照組比較，熱應(yīng)激后下丘腦HSP-70 mRNA及蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；刮痧組、放血組、刮痧結(jié)合放血組后HSP-70 mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，與熱應(yīng)激組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；以刮痧結(jié)合放血組HSP-70 mRNA及蛋白的表達(dá)上調(diào)更顯著（P＜0.01）。結(jié)論對(duì)熱射病模型進(jìn)行背區(qū)刮痧結(jié)合放血治療可延長生存時(shí)間，可能通過上調(diào)HSP-70水平，減輕病理損傷而起到治療作用。

熱射病熱休克刮痧放血熱休克蛋白

熱射病俗稱中暑，是一種高發(fā)病率和高死亡率的急癥，主要臨床表現(xiàn)為核心體溫高于40℃，皮膚干熱及中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，重癥患者可出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征（MODS）［1］。因此，對(duì)熱射病的預(yù)防和治療非常重要。常用的治療方法是快速降溫和多器官功能支持，降溫藥物多用氯丙嗪、5-羥色胺激動(dòng)劑等，但效果并不理想［2］。中醫(yī)學(xué)“中暑”屬“痧證”［3］，除了中藥方劑對(duì)中暑有退熱和催醒作用外［4-5］，針灸、刮痧也是常用的方法。清代《痧脹玉衡》一書指出“其治之大略有兩法焉，如痧在肌膚者，刮之而愈；痧在血肉者，放之而愈”［6］。即“痧毒”尚氣分者可采用刮痧療法，重者陷于血分，應(yīng)當(dāng)用刺絡(luò)放血的方法治療。明·楊繼洲《針灸大成》亦指出“卒暴昏沉不省人事……急以三棱針，刺手指十二井穴，當(dāng)去其惡血”［7］。刮痧和刺絡(luò)放血法作為一種簡便易行的外治法，具有泄熱、排毒、祛風(fēng)的作用。在民間流傳不衰，被醫(yī)家廣泛重視［8-9］。但其機(jī)制尚不明確，國內(nèi)外相關(guān)研究較少。本課題建立大鼠熱射病模型，予刮痧、放血及刮痧聯(lián)合放血治療，監(jiān)測(cè)治療前后心率（HR）、直腸中心溫度（Tco）、平均動(dòng)脈壓（MAP）變化，測(cè)定各組大鼠生存時(shí)間及下丘腦區(qū)熱休克蛋白（HSP-70）mRNA及蛋白的表達(dá)，初步探討刮痧、放血對(duì)熱應(yīng)激大鼠的療效及相應(yīng)的病理機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量（188.1±12.4）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑與儀器智能人工氣候箱（QHX-150型，上海比朗儀器有限公司），溫州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院提供；Med-Lab生理記錄儀（RM6240C型，成都儀器廠）。兔抗大鼠HSP-70多克隆一抗（美國Millipore公司，AB5895），HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（上海碧云天公司，A0208）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7500型，美國）。

1.3分組與造模將大鼠隨機(jī)分為5組，每組16只。各組大鼠造模前予5%水合氯醛（0.6 mL/100 g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉。右股動(dòng)脈置管，連接Powlab/8 sp生理記錄儀，監(jiān)測(cè)心率、直腸溫度及中心動(dòng)脈壓變化。常溫對(duì)照組大鼠置于26℃室溫，將其余4組放入43℃仿真熱氣候動(dòng)物艙進(jìn)行熱暴露，致熱休克后，再置于26℃的室溫下，熱應(yīng)激組不予任何治療。其他3組大鼠備皮后，刮痧組：以牛角刮痧板沿膀胱經(jīng)背部第一、第二側(cè)線（平風(fēng)門至腎俞）刮30次至紫；放血組：取前肢十宣穴、大椎穴、委中穴用三棱針各放血5～6滴；刮痧結(jié)合放血組：先予上述刮痧后再行放血治療。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.4.1生理指標(biāo)記錄各組大鼠右股動(dòng)脈置管，連接Powlab/8 sp生理記錄儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心率、直腸溫度及平均動(dòng)脈壓。參照文獻(xiàn)［10-11］，以平均動(dòng)脈壓從峰值下降25 mmHg的時(shí)刻作為熱休克開始，以心率消失或血壓為零作為死亡標(biāo)準(zhǔn)。每組8只大鼠記錄熱休克后至死亡時(shí)間作為大鼠生存時(shí)間。未死亡者觀察截止至480 min。

1.4.2HSP-70檢測(cè)其余每組8只大鼠熱休克后20 min，立即腹腔注射過量10%水合氯醛麻醉，冰上迅速分離出下丘腦。1）蛋白印跡（Western blotting）法檢測(cè)下丘腦HSP-70蛋白表達(dá)。在冰上將下丘腦用組織裂解液研碎，充分裂解，4℃，12000 r/min離心5 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。各樣本按60 μg/15 μL蛋白上樣，積層膠電泳電壓為70 V，分離膠電泳電壓為120 V，電泳后300 mA濕轉(zhuǎn)45 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST漂洗3×5 min，兔抗大鼠HSP-70多克隆一抗（1∶1000）4℃孵育18 h，TBST漂洗3×10 min后室溫下HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶2000）孵育1 h，TBST漂洗3×10 min，滴加ECL顯色，DNR MicroChemi化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像。用Alpha Ease FC（Fluorchem FC 2）軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以HSP-70蛋白和內(nèi)參GAPDH平均光密度值的比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)下丘腦HSP-70 mRNA的表達(dá)。采用Trizol法，按照試劑盒說明書提取下丘腦組織RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA在260 nm和280 nm的吸光度值（OD），計(jì)算RNA的純度和濃度。用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，GAPDH引物序列：上游引物5′-ATGGTGGGTA TGGGTAGTCGA-3′，下游引物5′-ACCCTCATA GATGGGCAGAGGCAC-3′。HSP-70引物序列：上游引物5′-CTGACAAGAAGAAGGTGCTGG-3′，下游引物5′-AGCAGCCATCAAGAGTCTGTC-3′。反應(yīng)體系為20 μL，包括DEPC-H2O 8 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10 μL，上游引物（濃度0.2 μmol/L）0.5 μL，下游引物（濃度0.2 μmol/L）0.5 μL和cDNA模板1 μL。反應(yīng)體系循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性10 s，94℃變性5 s，60℃退火及延伸20 s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。使用SYBR GreenⅠ進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過RT-qPCR對(duì)HSP-70 mRNA表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法進(jìn)行分析，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)用單因素方差分析后進(jìn)行LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠生存時(shí)間觀察見表1。熱應(yīng)激組大鼠存活時(shí)間為21～25 min。刮痧組、放血組及刮痧結(jié)合放血組均延長了熱應(yīng)激大鼠的存活時(shí)間（P＜0.01），以刮痧結(jié)合放血組更顯著（P＜0.01）。

表1　各組大鼠生存時(shí)間比較（min，±s）

表1　各組大鼠生存時(shí)間比較（min，±s）

與刮痧結(jié)合放血組比較，*P＜0.01；與熱應(yīng)激組比較，△P＜0.01。下同。

組別n生存時(shí)間常溫對(duì)照組8480±3熱應(yīng)激組823±2刮痧組8170±34*△放血組856±17*△刮痧結(jié)合放血組8230±22△

2.2各組大鼠心率、直腸溫度、MAP變化見圖1。造模各組大鼠均在熱應(yīng)激60 min后左右MAP達(dá)到峰值，隨后急劇下降，以MAP從峰值下降25 mmHg的時(shí)刻作為熱休克開始，70 min后左右開始出現(xiàn)熱休克。隨著環(huán)境溫度的上升，熱應(yīng)激各組大鼠Tco、HR先顯著升高，熱應(yīng)激后70 min達(dá)到峰值，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熱休克組大鼠Tco、HR達(dá)峰值后急劇下降，出現(xiàn)循環(huán)衰竭。熱休克100 min，刮痧組、放血組及刮痧結(jié)合放血組MAP、HR下降幅度較熱應(yīng)激組小，刮痧組及刮痧結(jié)合放血組Tco下降幅度較熱應(yīng)激組快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3各組大鼠下丘腦HSP-70蛋白的表達(dá)見圖2，表2。各組中均觀察到在分子量72 kDa處有免疫陽性條帶，與已知的HSP-70蛋白相對(duì)分子量符合。與常溫對(duì)照組比較，熱應(yīng)激后大鼠下丘腦HSP-70蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.01）。刮痧組、放血組及刮痧結(jié)合放血與熱應(yīng)激組比較HSP-70蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與刮痧組及放血組相比，刮痧結(jié)合放血組HSP-70蛋白表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4各組大鼠下丘腦HSP-70mRNA的表達(dá)見表3。實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量顯示熱應(yīng)激后20 min各組大鼠下丘腦HSP-70 mRNA表達(dá)明顯高于常溫對(duì)照組（P＜0.01）；與熱應(yīng)激組比較，刮痧組、放血組和刮痧結(jié)合放血組大鼠HSP-70 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與刮痧組及放血組相比，刮痧結(jié)合放血組HSP-70mRNA表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論

刮痧是在中醫(yī)經(jīng)絡(luò)腧穴理論指導(dǎo)下，用特制的器具，在體表進(jìn)行相應(yīng)的手法刮拭，出現(xiàn)皮膚潮紅或暗紅色的血斑、血泡等出痧變化，達(dá)到活血透痧、防治疾病等的一種外治法［12］。刮痧出痧的過程是一種血管擴(kuò)張漸至毛細(xì)血管破裂，即自體溶血，形成一種新的刺激素，能加強(qiáng)局部的新陳代謝［13］。刮痧施術(shù)部位在經(jīng)絡(luò)皮部，刮痧出痧過程與絡(luò)脈密切相關(guān)［14］。軀干背部膀胱經(jīng)是刮痧療法的常用部位，此處血供主要來自肌皮穿支。刮痧出痧時(shí)，穿動(dòng)脈的分支擴(kuò)張破裂，血液外溢，由于背區(qū)體被組織厚而致密，易產(chǎn)生一個(gè)延緩的良性刺激過程［15-16］。刮痧可使血管神經(jīng)受到刺激使血管擴(kuò)張，血流及淋巴液增快，加快熱量散發(fā)。

明代張景岳的《景岳全書·雜證謨》寫道“針灸法，刺委中穴出血，或刺十指頭出血，皆是良法。今東南人有括沙之法，以治心腹急痛。蓋使寒隨血聚，則邪達(dá)于外而臟起始安，此亦出血之意也”。放血有泄熱作用［17］，熱射病最主要的治療就是迅速降低核心體溫，降溫速度與熱射病的死亡率直接相關(guān)［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刮痧聯(lián)合放血組大鼠降溫速度明顯快于其余各組，可能是由于兩種治療結(jié)合有促進(jìn)作用。

圖2　Western blotting法檢測(cè)大鼠下丘腦HSP-70蛋白的表達(dá)

表2　各組大鼠下丘腦HSP-70蛋白表達(dá)（相對(duì)光密度值，±s）

表2　各組大鼠下丘腦HSP-70蛋白表達(dá)（相對(duì)光密度值，±s）

組別nHSP-70蛋白常溫對(duì)照組80.181±0.064熱應(yīng)激組80.352±0.044刮痧組80.735±0.102*△放血組80.790±0.069*△刮痧結(jié)合放血組80.912±0.106△

圖1　環(huán)境溫度與各組大鼠心率、直腸溫度、中心動(dòng)脈壓變化

表3　各組大鼠下丘腦HSP-70 mRNA表達(dá)（相對(duì)表達(dá)量值，s）

表3　各組大鼠下丘腦HSP-70 mRNA表達(dá)（相對(duì)表達(dá)量值，s）

組別nHSP-70 mRNA常溫對(duì)照組80.46±0.12熱應(yīng)激組81.03±0.16刮痧組82.50±0.17*△放血組82.25±0.20*△刮痧結(jié)合放血組83.08±0.28△

機(jī)體受到熱應(yīng)激能夠合成或增加合成熱休克蛋白。熱應(yīng)激引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷，暴露出與熱休克蛋白結(jié)合位點(diǎn)，熱休克蛋白與受損蛋白結(jié)合釋放游離的熱休克轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄合成，熱休克蛋白對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生“分子伴侶”作用［19-20］。增多的熱休克蛋白可以幫助蛋白質(zhì)正確折疊、移位、維持和降解，促進(jìn)受損蛋白質(zhì)的修復(fù)和移除，避免細(xì)胞遭受高溫、缺血缺氧、內(nèi)毒素、炎性細(xì)胞因子等的破壞。如果機(jī)體內(nèi)熱應(yīng)激蛋白水平在應(yīng)激狀態(tài)下不能迅速顯著升高，就會(huì)發(fā)生中暑［21］。

熱休克蛋白按相對(duì)分子量大小分為以下幾個(gè)家族：HSP-100、HSP-90、HSP-70、HSP-60、小分子HSP和泛素，其中HSP-70是熱應(yīng)激蛋白家族中含量最豐富的一種。在高溫或強(qiáng)輻射熱等條件下，HSP-70基因被激活，HSP-70的表達(dá)水平升高，緩解內(nèi)毒素造成的血管通透性改變，抑制炎癥介質(zhì)TNF-α的釋放［22-23］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱損傷后給予刮痧聯(lián)合放血處理可能抑制HSP-70蛋白的表達(dá)，從而可能通過調(diào)節(jié)中暑時(shí)的急性病理生理改變、炎癥反應(yīng)及發(fā)揮分子伴侶功能、抗氧化功能及抗凋亡作用而減輕高溫對(duì)大鼠的熱損傷，因而延長大鼠熱損傷后在室溫環(huán)境中的存活時(shí)間。熱應(yīng)激后予背區(qū)刮痧結(jié)合放血治療可延長生存時(shí)間，可能通過上調(diào)HSP-70水平，減輕病理損傷而起到治療作用。

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Effect of Combination Treatment with Guasha and Blood-letting on the Expression of HSP-70 in the Hy-pothalamus of Rats during Heat Stroke

XIA Wan，TU Wenzhan，CHENG Ruidong，et al.The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Zhejiang，Wenzhou 325027，China

Objective：To assess the therapeutic effect of Guasha on the back combined with blood-letting at EX-UE11（shixuanon）on heat stroke.Methods：80 male SD rats，immediately after the onset of heatstroke，were divided into 5 groups：the control group，the heat stress group，the Guasha group，the blood letting group and the combination group of Guasha and blood-letting，with 16 rats in each.The dynamic changes of heart rate，rectal temperature，mean arterial pressure and survival time were detected before and after treatment.20 minutes after heat stoke，the expressed variation of HSP-70 protein were detected by Western blotting and measured by RT-qPCR.Results：In the heat stress group，their survival time was found to be 21 to 25 minutes.The survive time was also extended in the the Guasha group，the blood letting group and the combination group of Guasha and blood-letting，especially in the combination group of Guasha and blood-letting.Compared with the control group，there were increased expressions of HSP-70 gene and protein in the other 4 groups（P＜0.01）.There was significant difference among the other 4 groups in the expressions of HSP-70 gene and protein（P＜0.01）.Conclusion：The results indicate that the resuscitation of Guasha combined with blood-letting at the time point of onset of heat stroke may improve survival.The expressions of HSP-70 gene and protein in the hypothalamus of rats are closely related to the pathologic development of heat stroke.

Heat stroke；Heat shock；Guasha；Blood-letting；Heat shock protein

R245

A

1004-745X（2015）11-1902-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.007

2015-07-07）

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009YB023）

（電子郵箱：jshwz@126.com）