平舜，王凱，張江臨，胡福良

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

茶蜂花粉提取物BPE對LPS誘導(dǎo)的Raw 264.7細(xì)胞的體外抗炎癥作用

平舜，王凱，張江臨，胡福良*

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

以茶蜂花粉提取物（BPE）為實(shí)驗(yàn)材料，研究了其可能的抗炎活性。通過福林酚法和三氯化鋁比色法測定BPE中的總酚酸和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)評價(jià)BPE體外自由基清除能力，并采用LPS誘導(dǎo)的小鼠Raw 264.7細(xì)胞體外炎癥模型，探究BPE對炎癥因子和相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，BPE的總酚酸及總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（255.23±21.43）mg/g（綠原酸當(dāng)量）和（132.85±14.77）mg/g（蘆丁當(dāng)量）；BPE的ABTS自由基清除力的IC50值為（53.9± 5.38）μg/mL；在體外抗炎實(shí)驗(yàn)中，BPE能顯著抑制Raw 264.7細(xì)胞NO的釋放，顯著抑制iNOS、IL-1β和IL-10，增強(qiáng)HO-1基因mRNA水平的表達(dá)，并呈一定的劑量相關(guān)性。表明，BPE富含黃酮和酚酸類物質(zhì)并具有很強(qiáng)的自由基清除能力，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的抗炎癥效果。

茶蜂花粉；自由基清除；抗炎

蜂花粉中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物學(xué)活性物質(zhì)［1］，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、促進(jìn)機(jī)體免疫力、清除自由基、調(diào)節(jié)腸道功能和治療前列腺疾病等功能［2-3］。炎癥是機(jī)體組織受到病原體、受損細(xì)胞和其它刺激物等有害刺激所產(chǎn)生的一種自我保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)［4］，目前蜂產(chǎn)品中蜂膠的抗炎癥功能及其機(jī)制已得到廣泛的研究［5］，蜂花粉作為重要的蜂產(chǎn)品之一卻鮮有抗炎癥研究的報(bào)導(dǎo)。本研究中通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)評價(jià)茶（Camellia sinensis）蜂花粉提取物的抗氧化能力，并研究了其對脂多糖（Lipopolysac-charide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞（Raw 264.7）體外炎癥反應(yīng)和相關(guān)的炎癥轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的表達(dá)作用，探討了蜂花粉提取物的抗炎癥作用及其可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

茶蜂花粉，2013年10月采集自浙江安吉；小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞，由浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院夏總平教授惠贈(zèng)；脂多糖（LPS），購自美國Sigma公司；PCR引物，合成于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；SYBR○RPremix Ex TaqTM（2×）等RTPCR試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2茶蜂花粉提取物的制備

新鮮茶蜂花粉經(jīng)冷凍干燥、機(jī)械破壁后置于-20℃貯存?zhèn)溆谩⑵票诜浠ǚ凼褂谜和槊撝?，待充分提取后過濾，回收殘?jiān)?，往殘?jiān)屑尤塍w積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，超聲輔助提取，待充分提取后過濾，回收濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液，濃縮乙醇，再用乙酸乙酯提取，獲得乙酸乙酯提取液，干燥制得提取物（Camellia sinensis Bee Pollen Extract，BPE）。將BPE溶于純乙醇，制成20 mg/mL BPE儲(chǔ)備液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3總黃酮和總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

BPE的總黃酮含量測定方法參照分光光度比色法（GB/T 20574-2006），選用島津UV-2550型紫外分光光度計(jì)測定，吸收波長為415 nm。選用福林-酚法測定BPE的總酚酸含量，以沒食子酸為對照，方法參照楊磊等的研究［6］。

1.4ABTS自由基清除力測定

評價(jià)BPE的抗氧化能力選用ABTS自由基清除力，依據(jù)Shi等的方法［7］并作適當(dāng)調(diào)整。將15 mL 7 mmol/mL的ABTS水溶液與264 μL 140 mmol/mL的過硫酸鉀溶液混合后室溫下避光靜置過夜，形成ABTS+儲(chǔ)備液，使用前用無水乙醇稀釋至在734 nm吸光度為0.70±0.02。反應(yīng)在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，每孔加入50 μL相應(yīng)質(zhì)量濃度的BPE加100 μL的ABTS+反應(yīng)液，混合后室溫黑暗中孵育10 min，734 nm下測定吸光值。BPE清除力以IC50表示，即達(dá)到50%的ABTS自由基清除時(shí)的BPE質(zhì)量濃度。

1.5BPE體外抗炎活性

1.5.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活力測定小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7培養(yǎng)于100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)10%熱滅活胎牛血清混合的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BPE對RAW 264.7細(xì)胞的活性與增殖檢測采用Cell Counting Kit-8（CCK8）法，選用Dojido的CCK-8試劑盒。10×104/mL的RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育24 h后加入適當(dāng)質(zhì)量濃度的BPE，每孔加入100 μL CCK8試劑反應(yīng)2 h后利用酶標(biāo)儀在波長450 nm下測定OD值。

1.5.2Greiss反應(yīng)測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7接種于24孔板孵育24 h，再用相應(yīng)質(zhì)量濃度BPE預(yù)處理1 h，再用1 μg/mL的LPS刺激。經(jīng)24 h孵育，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。離心分裝后置于-80℃待測。細(xì)胞液中NO濃度選用碧云天NO試劑盒，酶標(biāo)儀波長550 nm下測定OD值。

1.5.3總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄選用Omega公司的E.Z.N.A總RNA試劑盒提取小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的RNA，具體步驟參照用戶手冊。Nano Drop ND-2000型分光光度計(jì)測定提取純化后的RNA濃度和純度，然后用焦碳酸二乙酯（DEPC）預(yù)處理的水稀釋后置于-80℃。以RNA為模板高效合成第一鏈cDNA的反應(yīng)體系，選用DRR037A Primpscript○R RT reagent kit試劑盒，在25 μL反應(yīng)體系中使用1μL RNA模板，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃環(huán)境備用。

1.5.4實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析實(shí)驗(yàn)中的寡核苷酸引物利用Perlprimer軟件設(shè)計(jì)并由上海生工生物技術(shù)公司合成，具體引物信息見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR選用TaKaRa的SYBR premix EX Taq試劑盒，根據(jù)文獻(xiàn)［8］方法分析檢測。GAPDH為管家基因，作為目標(biāo)基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)參照物，選用2ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)水平［9］。

表1　qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中的引物序列Table 1Primer sequences used for qRT-PCR

2　結(jié)果與討論

2.1BPE的總黃酮、總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其ABTS清除力

一些植物類天然產(chǎn)物富含酚酸、黃酮和單寧酸等，這些物質(zhì)具有強(qiáng)抗氧化和抗自由基能力［10］。BPE中總黃酮和總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果見表2?？梢?，以蘆丁為對照，BPE總黃酮質(zhì)量占干質(zhì)量的13.29%；以綠原酸為對照，其總酚酸質(zhì)量占干質(zhì)量的25.52%。

表2　BPE中總黃酮和總酚酸的含量及其ABTS清除能力Table 2Total flavonoid content，total phenolic content and ABTS free-scavenging activities of BPE

在炎癥細(xì)胞中，多形核白細(xì)胞產(chǎn)生并釋放活性氧自由基和活性氮自由基，這些自由基包括超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫和一氧化氮等［11］。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧自由基會(huì)造成核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類等生物分子的損傷，惡化炎癥程度，對細(xì)胞和組織造成嚴(yán)重?fù)p傷［12］。因此，清除自由基的能力也是評價(jià)抗炎效果的一個(gè)重要指標(biāo)。研究中測得BPE的ABTS自由基清除能力的IC50值為（53.91±5.38）μg/mL，強(qiáng)于維生素C的ABTS自由基清除能力（見表2）。表明BPE具有很強(qiáng)的自由基清除能力，這可能與其富含黃酮和酚酸類物質(zhì)有關(guān)，與前人的研究結(jié)果一致［13］。

2.2BPE對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

為選擇合適濃度的BPE，采用了CCK-8法測定不同濃度的BPE對RAW264.7細(xì)胞生長的影響，結(jié)果見圖1。質(zhì)量濃度為5～100 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞活力未出現(xiàn)顯著性變化，表明該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)BPE處理無明顯細(xì)胞毒性。而高于此質(zhì)量濃度時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的活力顯著降低。因此，后續(xù)研究將100 μg/mL設(shè)為質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)上限。

2.3BPE對RAW264.7細(xì)胞的體外抗炎作用

2.3.1BPE對NO釋放的作用NO是由NO合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）催化L-精氨酸（LArgine）而生成。炎癥發(fā)生過程，NO是一種重要的跨膜信息分子，激活的巨噬細(xì)胞可以大量分泌NO，導(dǎo)致周圍組織損傷［14］。本研究中評價(jià)了不同質(zhì)量濃度BPE對1 μg/mL LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞釋放NO能力的影響，結(jié)果見圖2。在刺激的RAW264.7細(xì)胞液中NO濃度為（6.52±1.21）μmol/L，在未刺激且以100 μg/mL BPE處理，則其濃度亦處較低水平，為（5.20±0.24）μmol/L，表明在未受LPS刺激的Raw 264.7細(xì)胞中，細(xì)胞液的NO濃度處于較低水平且BPE并不影響NO釋放。LPS刺激24 h后，其濃度增加到（35.70±0.94）μmol/L。而在刺激前1 h加入不同質(zhì)量濃度BPE預(yù)處理Raw 264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對其NO的釋放能力具有一定抑制，并呈質(zhì)量濃度依賴性。在BPE質(zhì)量濃度為80、100 μg/mL時(shí)對NO釋放的抑制作用極顯著。由此可推測，BPE可以通過抑制NO的釋放來起到抗炎作用。

圖1　BPE對Raw 264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1Effects of BPE on the cell viability of Raw 264.7 cells

圖2　BPE對Raw 264.7細(xì)胞釋放NO能力的影響Fig.2Effects of BPE on nitric oxide（NO）production in Raw 264.7 cells

2.3.2BPE對炎癥調(diào)節(jié)因子mRNA水平表達(dá)的作用在炎癥過程中，細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型NO合酶（induced Nitric Oxide Synthase，iNOS）會(huì)高表達(dá)［15］。NO測定結(jié)果表明，BPE可抑制炎癥過程中NO產(chǎn)生，且呈劑量相關(guān)性。已有蜂膠研究表明，巴西綠蜂膠醇提取液能通過影響核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，從而抑制iNOS基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而減少iNOS產(chǎn)生，抑制iNOS催化合成NO的能力［16-17］。本研究中，iNOS基因mRNA的水平表達(dá)定量結(jié)果見圖3。4個(gè)給藥質(zhì)量濃度均極顯著抑制iNOS基因mRNA水平的表達(dá)，且也具有質(zhì)量濃度相關(guān)性，與對NO的抑制效果一致，可推測BPE可能存在與巴西綠蜂膠醇提取液相同的作用機(jī)制，即抑制NO合成。在劑量上，20μg/mL的BPE對iNOS基因mRNA水平的表達(dá)抑制效果非常顯著，但此后隨著質(zhì)量濃度的增加抑制效果趨于平緩，這可能與20 μg/mL給藥質(zhì)量濃度后iNOS表達(dá)已處于較低水平相關(guān)。

圖3　BPE對Raw 264.7細(xì)胞中iNOS的mRNA水平表達(dá)的影響Fig.3Effects of BPE on the mRNA expression of iNOS in LPS stimulated Raw 264.7 cells

白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是重要的炎癥相關(guān)因子，在炎癥反應(yīng)中它會(huì)高表達(dá)［15］。在激活的巨噬細(xì)胞中，IL-1β是一種重要的促炎癥因子，它可加劇炎癥反應(yīng)，造成組織和器官的損傷［18］。本研究中，在20 μg/mL的BPE處理并未表現(xiàn)出對IL-1β的抑制作用，而隨著質(zhì)量濃度的升高顯著性地抑制IL-1β的表達(dá)，結(jié)果見圖4，但其抑制作用弱于同質(zhì)量濃度的BPE對iNOS的表達(dá)。

IL-10是一種重要的抗炎癥因子，陳紅光利用含氫培養(yǎng)液試驗(yàn)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7的炎癥模型，發(fā)現(xiàn)LPS刺激可誘導(dǎo)IL-10的高表達(dá)，而含氫培養(yǎng)液可以增強(qiáng)IL-10的表達(dá)并具有濃度依賴性［19］。而王慧研究了白藤梨多糖對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7炎癥模型的免疫調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)LPS刺激同樣可誘導(dǎo)IL-10的高表達(dá)，但白藤梨多糖處理均抑制了IL-10的表達(dá)。在表達(dá)量上隨著白藤梨多糖劑量增加，IL-10表達(dá)量在增強(qiáng)［20］。本研究中LPS刺激同樣可誘導(dǎo)IL-10的高表達(dá)，但BPE的處理顯著性地抑制了IL-10的表達(dá)，且具有一定的質(zhì)量濃度相關(guān)性，結(jié)果見圖5。BPE質(zhì)量濃度在80、100 μg/mL時(shí)，IL-10的表達(dá)量已處于較低水平，BPE對IL-10表達(dá)的抑制作用趨緩。因此，推測BPE可能是通過緩解炎癥反應(yīng)而抑制了抗炎癥因子IL-10的表達(dá)。

圖4　BPE對Raw 264.7細(xì)胞中IL-1β的mRNA水平表達(dá)的影響Fig.4Effects of BPE on the mRNA expression of IL-1β in LPS stimulated Raw 264.7 cells

圖5　BPE對Raw 264.7細(xì)胞中IL-10的mRNA水平表達(dá)的影響Fig.5Effects of BPE on the mRNA expression of IL-10 in LPS stimulated Raw 264.7 cells

血紅素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)，可有效調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，從而起到抗氧化作用［21］。HO-1的高表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞抵抗凋亡刺激的能力［22］。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)了HO-1基因mRNA水平的表達(dá)，而BPE預(yù)處理極顯著地增強(qiáng)了HO-1基因mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果見圖6，100 μg/mL的BPE處理時(shí)HO-1的表達(dá)量接近LPS刺激時(shí)的4倍，并呈現(xiàn)出隨著劑量的增加HO-1的表達(dá)也不斷增強(qiáng)。因此可以推斷，BPE在LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型中是一種強(qiáng)有效的抗氧化劑，從而發(fā)揮對細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。Park等研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的HO-1可有效抑制TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)［22-25］，因此可推測BPE可能是通過增強(qiáng)HO-1的表達(dá)來抑制iNOS、IL-1β和IL-10的表達(dá)，從而起到抗炎作用。

圖6　BPE對Raw 264.7細(xì)胞中HO-1的mRNA水平表達(dá)的影響Fig.6Effects of BPE on the mRNA expression of HO-1 in LPS stimulated Raw 264.7 cells

3　結(jié)語

茶蜂花粉提取物BPE含有豐富的酚酸和黃酮類物質(zhì)，并且具有極強(qiáng)的清除自由基的能力。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，BPE可以有效地抑制NO的產(chǎn)生，同時(shí)增強(qiáng)HO-1的表達(dá)，抑制iNOS、IL-1β和IL-10炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到良好的體外抗炎癥效果。但是，本研究結(jié)果只是論證了BPE具有的體外抗炎癥功效，仍需有進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以便充分開發(fā)茶蜂花粉的抗炎癥活性。

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In Vitro Anti-Flammatory Effects of Camellia Sinensis Bee Pollen Extract（BPE）on LPS-Induced Inflammation in RAW 264.7 Macrophage Cells

PINGShun，WANGKai，ZHANGJianglin，HUFuliang*
（College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

This study intended to evaluate the anti-inflammatory activity of Camellia sinensis bee pollen extract（BPE）.Total phenolic content and total flavonoid content of BPE were determined by the Folin-Ciocalteu method and AlCl3colorimetry，respectively.Meanwhile，ABTS free-radical scavenging methods were used to evaluate its free-radical scavenging capacity.On the other hand，the anti-inflammatory effect of BPE was investigated in vitro by evaluating its modulating effects on the key inflammatory cytokines and the mRNA expression of inflammatory-mediators and cytokine genes in LPS stimulated Raw 264.7 cells.The results showed that the total phenolic content and total flavonoid content of BPE were 255.23±21.43 mg/g and 132.85±14.77 mg/g，respectively.BPE exhibited strong ABTS free-radical scavenging capacity and its IC50value was 53.9±5.38 μg/mL. In vitro，BPE exhibited significantly to inhibit NO release and the mRNA expression of iNOS，IL-1βand IL-10，and to increase the mRNA expression of HO-1.The results indicated BPE was rich in phenolic compounds and had strong free-radical scavenging capacity，and showed a good anti-inflammatory effects in vitro.

Camellia sinensis bee pollen extract，free radical scavenging capacity，anti-inflammation

S 896

A

1673—1689（2015）12—1302—06

2014-11-07

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-45）；浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目（2013R401287）。

胡福良（1964—），男，浙江東陽人，理學(xué)博士，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事蜜蜂科學(xué)及功能性食品科學(xué)的研究。E-mail：flhu@zju.edu.cn