甘昌勝，尹彬彬，張靖華，高婭華，趙珍珍

（1.合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009；2.安徽省澤平制藥有限公司，安徽合肥230088）

艾葉精油蒸餾制取對相應(yīng)水提液活性成分的影響及其抑菌性能比較

甘昌勝1，尹彬彬1，張靖華2，高婭華2，趙珍珍1

（1.合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009；2.安徽省澤平制藥有限公司，安徽合肥230088）

艾葉中富含精油以及多糖、黃酮等多種功能性成分。采用水蒸氣蒸餾法提取艾葉精油，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化水蒸氣蒸餾提取精油的工藝條件；GC-MS分析精油成分，同時(shí)考察了對應(yīng)水提液中多糖和黃酮的含量變化，并通過菌落計(jì)數(shù)法比較艾葉精油和水提液的抑菌效果。結(jié)果表明，精油抑菌能力強(qiáng)，水提液抑菌能力一般。

艾葉；精油；多糖；黃酮；抑菌

艾葉（Folium Artemisia argyi）為菊科蒿屬草本植物艾（Artemisia argyi）的葉（干燥），全國大部分地區(qū)均產(chǎn)，具有驅(qū)邪凈化之功效，溫經(jīng)活絡(luò)、驅(qū)寒止痛、美容養(yǎng)顏、延緩衰老之功能［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，艾葉有抗菌抗病毒、鎮(zhèn)咳平喘、護(hù)肝利膽、抗過敏、增強(qiáng)免疫力等作用［2-5］，艾葉還可作“艾葉茶”、“艾葉湯”、“艾葉粥”等飲食，以增強(qiáng)人體對疾病的抵抗力。

艾葉中富含精油以及多糖、黃酮、鞣質(zhì)等多種功效成分，艾葉的藥用功能與其活性成分密切相關(guān)［6］。精油又稱揮發(fā)油，大多具有芳香味，廣泛應(yīng)用于香料、化妝品等工業(yè)。艾葉精油是艾葉特有的藥用活性物質(zhì)，具有止咳平喘、消炎、鎮(zhèn)痛、解熱等功效［7］。目前，對于艾葉揮發(fā)性油的化學(xué)成分及其生物活性已有一些報(bào)道，但對其精油提取工藝優(yōu)化研究的報(bào)道較少。同時(shí)，艾葉經(jīng)水蒸氣蒸餾后生成大量的水提液，其中含有豐富的多糖、黃酮等重要生物活性物質(zhì)［8］，目前尚缺乏對這部分水提液的研究。因而，為提高艾葉的綜合利用價(jià)值，有必要研究熱水浸提下它們的含量變化。本文作者采用水蒸氣蒸餾法，優(yōu)化了艾葉揮發(fā)油的提取工藝，并分析了艾葉水提液中黃酮和多糖的含量變化，研究了艾葉揮發(fā)油和水提液的抗菌活性，為艾葉的綜合開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1材料與設(shè)備

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料艾葉，產(chǎn)地為湖北蘄春，蘄春李時(shí)珍地道中藥材有限公司提供；蘆丁，純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所提供；其他試劑均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC27664，腸炎沙門氏菌SalmonellaenteritidisCICC21482，大腸桿菌Escherichia coli ATCC11246，合肥工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2儀器設(shè)備UV-1600型紫外/可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司制造；中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司制造；Clarus 600型GC-MS聯(lián)用儀，美國Perkin Elmer公司制造。

1.2提取方法

準(zhǔn)確稱取30 g粉碎的艾葉，置于1 000 mL的圓底燒瓶中，按一定的料液比加入超純水，浸泡相應(yīng)時(shí)間后，根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，采用中國藥典一部附錄中的水蒸氣蒸餾法，以艾葉精油的主要影響因素：料液比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間為實(shí)驗(yàn)條件，選用L9（33）正交實(shí)驗(yàn)（見表1），以精油得率、水提液中多糖及黃酮的含量為考察指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。平行實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算精油得量、水提液中多糖及黃酮的含量。

表1　正交實(shí)驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)Table 1Orthogonal experiment with 3 factors and 3 levels

1.3定量分析方法

1.3.1苯酚-硫酸法測多糖含量參照文獻(xiàn)［9］，取不同濃度的葡萄糖溶液，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚和濃硫酸。用蒸餾水作空白對照，在486 nm處測定其吸光度值，得回歸方程

1.3.2NaNO2-Al（NO3）3法測黃酮含量參照文獻(xiàn)［10］，取不同量0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%Al（NO3）3和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaOH溶液，再用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容，搖勻。以體積分?jǐn)?shù)30%乙醇為空白參比，在505 nm處測定吸光度，得回歸方程

1.3.3氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析精油成分將提取的艾葉精油以1∶6的體積比溶于乙酸乙酯，用0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣量0.5 μL，分流比1∶10，載氣He，體積流量1 mL/min。進(jìn)樣口溫度220℃，色譜柱初始溫度50℃，保持3 min后以3℃/min升溫至250℃并保持15 min。質(zhì)譜條件：EI，溫度290℃，電子能量70 eV，溶劑延遲1 min。

1.4抑菌實(shí)驗(yàn)方法

菌種活化實(shí)驗(yàn)：在無菌條件下，分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌接種到營養(yǎng)肉湯中，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，備用。將活化的實(shí)驗(yàn)用菌稀釋，使其濃度達(dá)108cfu/mL，備用。

以大腸桿菌為例，在無菌條件下，取4個培養(yǎng)皿，吸取0.5 mL菌懸液加入1號培養(yǎng)皿中，0.5 mL菌懸液和0.5 mL體積分?jǐn)?shù)75%乙醇加入2號培養(yǎng)皿中，0.5 mL菌懸液和0.5 mL水提液加入3號培養(yǎng)皿中，0.5 mL菌懸液和0.5 mL精油（體積分?jǐn)?shù)75%乙醇稀釋）加入4號培養(yǎng)皿中。然后在各培養(yǎng)皿中加入經(jīng)高壓滅菌并冷卻至46℃的瓊脂培養(yǎng)基，搖勻冷卻后在37℃下恒溫培養(yǎng)，觀察計(jì)數(shù)。金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)方法同上。詳見文獻(xiàn)［11］。

2　結(jié)果與討論

2.1提取工藝

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，首先分析精油得率，通過直觀分析，比較極差，得出各因素的影響順序?yàn)锳> C>B，料液比對揮發(fā)油得率的影響最大，其次為提取時(shí)間，最后是浸泡時(shí)間。得出最優(yōu)化組合為A3B1C3，即料液比1∶20，浸泡時(shí)間3 h，提取時(shí)間6 h，提取率達(dá)0.73%。

艾葉精油的提取因素中料液比影響最大，由于在整個水蒸氣蒸餾過程中，物料的稀釋程度直接影響到水與艾葉表面的接觸面積，一定比例的水浸入后，在高溫下將油帶出。實(shí)驗(yàn)表明，料液比1∶20能最大化地提取精油。

表2　提取正交試驗(yàn)Table 2Orthogonal experiments of the extraction procedure

浸泡時(shí)間由于設(shè)置區(qū)間較短，且在常溫下浸泡，影響較小。提取過程中提取時(shí)間越長，出油率越高，但超過一定時(shí)間后出油量增加不明顯，說明可能此時(shí)精油已基本被蒸出。

由于水蒸氣蒸餾時(shí)會產(chǎn)生大量的水提液，而水提液中亦含有較多的多糖、黃酮等活性物質(zhì)，作者對其中的這兩類主要活性物質(zhì)也進(jìn)行了考察。多糖含量分析，比較各因素的影響順序?yàn)锳>B>C，即料液比對提取艾葉多糖含量的影響最大，其次為浸泡時(shí)間，較優(yōu)組合為A2B2C1，即料液比1∶10，浸泡時(shí)間5 h，提取時(shí)間3 h。黃酮含量通過比較極差，得出各因素的影響順序A>C>B，即料液比影響最大，其次為提取時(shí)間，最后是浸泡時(shí)間。較優(yōu)組合為A3B2C2，即料液比1∶20，浸泡時(shí)間5 h，提取時(shí)間4.5 h。

多糖是一類水溶性較高的化合物，高溫下易降解氧化，需控制適當(dāng)?shù)牧弦罕群吞崛r(shí)間。而黃酮類化合物水溶性不高，熱水可提取部分黃酮苷，適當(dāng)提高料液比和提取時(shí)間有利于黃酮的提取，但黃酮也存在著高溫下易氧化的問題。

2.2精油成分分析

如圖1所示。經(jīng)GC-MS分析，艾葉精油中可鑒別出50余種化合物。

圖1　精油的GC-MS分析總離子流圖Fig.1Total ionic chromatogram of GC-MS analysis of the essential oil

按面積歸一法計(jì)算各組分的含量（面積分?jǐn)?shù)），其中面積分?jǐn)?shù)較高的有桉油精（10.66%）、側(cè)柏酮（2.4%）、左旋樟腦（3.2%）、馬鞭烯醇（6.5%）、反式石竹烯（12.1%）、氧化石竹烯（10.2%）、3，3，6-三甲基-1，4-庚二烯-6-醇（2.1%）、4-萜品醇（4.0%）、藍(lán)桉醇（6.7%）。其中桉油精、石竹烯等可能發(fā)揮較強(qiáng)的抑菌效果［12-13］。

2.3抑菌活性

采用菌落計(jì)數(shù)法比較了艾葉精油和水提液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌效果，結(jié)果如表3所示。

表3　艾葉精油及水提液的抑菌效果1）Table 3Antibacterial effect of the essential oil and water extraction from Folium Artemisiae argyi

試驗(yàn)結(jié)果表明，艾葉精油對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的抑制能力最強(qiáng)，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇次之，艾葉水提液較差。

艾葉精油導(dǎo)致微生物死亡的可能機(jī)理是：由于破壞了細(xì)胞膜的通透性，從而阻礙了細(xì)菌的呼吸作用［14］。

3　結(jié)語

利用水蒸氣蒸餾法，采用正交試驗(yàn)，分析了料液比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間等因素對艾葉揮發(fā)油以及水提液中多糖和黃酮含量的影響，并得出了優(yōu)化組合。當(dāng)料液比1∶20，浸泡時(shí)間3 h，提取時(shí)間6 h時(shí)，艾葉揮發(fā)油得率最高。

論文還對艾葉經(jīng)水蒸汽蒸餾后水提液中多糖和黃酮的含量變化進(jìn)行了研討。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，艾葉精油對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的抑制效果都很好，而水提液的抑菌效果一般。推測可能的原因是水提液中既含有抑菌成分，又含有對細(xì)菌生長有利的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致總體抑菌效果較差［15］。

本研究成果為艾葉的進(jìn)一步綜合開發(fā)利用提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：82-83.

［2］蔡平.艾葉的藥理作用及應(yīng)用［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2001，12（12）：1137-1139.

CAI Ping.The pharmacological action and application of Artemisiae argyi［J］.Lishizhen Medicine and Materia MedicaResearch，2001，12（12）：1137-1139.（in Chinese）

［3］Adams M，Efferth T，Bauer R.Activity-guided isolation of scopoletin and isoscopoletin，the inhibitory active principles towards CCRF-CEM leukaemia cells and multi-drug resistant CEM/ADR5000 cells，from Artemisia argyi［J］.Planta Medica，2006，72：862-864.

［4］Zeng K W，Wang S，Dong X，et al.Sesquiterpene dimer（DSF-52）from Artemisia argyi inhibits microglia-mediated neuroinflammation via suppression of NF-kappa B，JNK/p38 MAPKs and Jak2/Stat3 signaling pathways［J］. Phytomedicine，2014，21（3）：298-306.

［5］Seo J M，Kang H M，Son K H，et al.Antitumor activity of flavones isolated from Artemisia argyi［J］.Planta Medica，2003，69：218-222.

［6］Lao A，F(xiàn)ujimoto Y，Tatsuno T.Studies on the constituents of Artemisia argyi LEVL et VANT［J］.Chem Pharm Bull，1984，32：723-727.

［7］Huang H C，Wang H F，Yih K H，et al.Dual bioactivities of essential oil extracted from the leaves of Artemisia argyi as an antimelanogenic versus antioxidant agent and chemical composition analysis by GC/MS［J］.Int J Mol Sci，2012，13：14679-14697.

［8］Bao X，Yuan H，Wang C，et al.Antitumor and immunomodulatory activities of a polysaccharide from Artemisia argyi［J］. Carbohydrate Polymers，2013，98：1236-1243.

［9］DuBios M，Gilles K A，Hamilton J K，et al.Colormetric method for the determination of sugars and related substances［J］. Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

［10］周華生，張連龍，成恒嵩，等.保健食品中黃酮含量三種測定方法研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25（11）：1358-1362.

ZHOU Huasheng，ZHANG Lianlong，CHENG Hengsong，et al.A comparison of three methods for determination of flavonids in health foods［J］.Modern Food Science and Technology，2009，25（11）：1358-1362.（in Chinese）

［11］黃曉冬，劉劍秋.赤楠葉精油的化學(xué)成分及其抗菌活性［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2004，12（3）：233-236.

HUANG Xiaodong，LIU Jianqiu.Chemical composition and antibacterial activities of the essential oil from the leaves of syzygium buxifolium［J］.Journal of Tropical and Subtropical Botany，2004，12（3）：233-236.（in Chinese）

［12］張麗佳，薛銀，張岑容，等.桉油精的抗菌抗炎作用研究［J］.中國獸藥雜志，2013，47（3）：21-24.

ZHANG Lijia，XUE Yin，ZHANG Cenrong，et al.Antibacterial and antiinflammatory effects of eucalyptol［J］. Chinese Journal of Veterinary Drug，2013，47（3）：21-24.（in Chinese）

［13］凌瑋瑋，張正竹，凌鐵軍，等.牡荊揮發(fā)油的組成及其抑菌活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（12）：75-79.

LING Weiwei，ZHANG Zhengzhu，LING Tiejun，et al.Constituents in the essential oil of Vitex negundo Linn.var.cannabifolia（Sieb et Zucc）Hand.-Mazz.and their antibacterial activities［J］. Science and Technology of Food Industry，2010，31（12）：75-79.（in Chinese）

［14］Lv F，Liang H，Yuan Q P，et al.Combination of essential oils for the application in antimicrobial food packaging［C］//Proceedings of the 17thIAPRI World Conference on Packaging.IRVIN：［s.n.］，2010：77-85.

［15］劉萍，劉巍，袁銘.艾葉與復(fù)方艾葉水提液體外抗菌作用比較［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，26（5）：484-485.

LIU Ping，LIU Wei，YUAN Ming.Comparison in vitro antibacterial activities of water extracts of Artemisia argyi［J］.Herald of Medicine，2007，26（5）：484-485.（in Chinese）

Effects of the Extraction Essential Oil from Folium A.argyi on the Activity Components of the Related Water Extraction and the Comparison of Their Antibacterial Activity

GAN Changsheng1，YIN Binbin1，ZHANG Jinghua2，GAO Yahua2，ZHAO Zhenzhen1
（1.Engineering Research Center of Bio-process of Ministry of Education，Hefei University of Technology，Hefei 230009；2.Anhui Zeping Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hefei 230088）

Folium Artemisiae argyi is rich in essential oil and various functional components，such as polysaccharides and flavones.The essential oil was extracted from Folium Artemisiae argyi using steam distillation.The extraction conditions were optimized by orthogonal analysis.The essential oil components were analyzed by GC-MS.The changes of polysaccharides and flavones contents in the water extraction were also investigated.The antibacterial activity of the essential oil and water extraction was compared using colony-counting method.The results indicated that the antibacterial activity of the essential oil was quite strong，while the water extraction was just an ordinary bacteria inhibitor.

folium Artemisiae argyi，essential oil，polysaccharide，flavone，antibacterial effect

Q 946.887

A

1673—1689（2015）12—1327—05

2014-10-12

安徽省教育廳產(chǎn)學(xué)研重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2012A236）。

甘昌勝（1972—），男，安徽合肥人，工學(xué)博士，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工和天然藥物化學(xué)研究。E-mail：gancs7894@163.com