黃華佗等

【摘要】 目的 研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 （TGFβ1）基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)多態(tài)性各等位基因及基因型在廣西人群中的分布頻率，對(duì)比不同種族之間的分布差異。

方法 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRRFLP）技術(shù)和DNA測(cè)序法檢測(cè)210例廣西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)多態(tài)性，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，比較其在不同種族間的分布差異。

結(jié)果 廣西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)表現(xiàn)為T(mén)T、TC、CC三種基因型，頻率分別為25.2%、50.5%和24.3%。T、C等位基因頻率分別為50.5%和49.5%。其基因型和等位基因頻率在不同性別間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但與埃及人和英國(guó)人比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)論 在廣西人群中存在TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)多態(tài)性，其基因多態(tài)性的分布頻率在不同性別間比較差異不顯著，但與其他種族人群比較存在顯著差異。

【關(guān)鍵詞】 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；基因多態(tài)性；種族

中圖分類號(hào)：R446.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.05.001

A study on genetic polymorphism of TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） of Guangxi crowd

[HJ2][HJ]

HUANG Huatuo，XIANG Yang，LUO Hongcheng，CHEN Jianming，WU Chengjiang，WEI Yesheng▲

（Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】 Objective To study allele and genotype frequencies in polymorphisms of TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） in Guangxi crowd，so as to analyze the distributions of it among different ethnic groups.

Methods The TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） polymorphisms of 210 people in Guangxi were examined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism（PCRRFLP） method and DNA sequencing.And distribution disparity between different ethnic groups were compared combing with related documents.

Results The TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） showed three genotypes：TT，TC and CC，and the frequencies were 25.2%，50.5% and 24.3%，respectively.Allele frequencies of T and C were 50.5% and 495%，respectively.The allele frequencies and genotype distribution of TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） had no statistically significant difference between men and women （P>0.05），but difference was statistically significant when comparing with the Egyptians and the British （P<0.05）.

Conclusion There are TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） polymorphisms in Guangxi crowd，and difference of its distributions is not significant between men and women，but the difference is significant when comparing with other races.

【Key words】 TGFβ1；polymorphism；race

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）為1984年Tucker等發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的多肽，后被證明為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的一員[1]。后期研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1在體內(nèi)多種細(xì)胞中都有表達(dá)，如淋巴細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞等。TGFβ1是由兩條含有112個(gè)氨基酸的分子量為11 KD的單鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合而成的多肽。人類基因組中，用于編碼TGFβ1的基因位于第19號(hào)染色體長(zhǎng)臂（19q13.2）上，總共包含6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子。該基因目前已發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)有十多個(gè)，而常見(jiàn)的與疾病有密切聯(lián)系的有7個(gè)，869T/C（Leu10Pro）是其中一個(gè)重要的突變位點(diǎn)。相關(guān)研究表明[2～7]，TGFβ1基因單核苷酸多態(tài)性與纖維硬化性疾病、腫瘤性疾病、免疫性疾病和糖尿病等疾病的發(fā)病密切相關(guān)。因此，我們采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRRFLP）技術(shù)和DNA測(cè)序法檢測(cè)廣西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)，同時(shí)探討其基因多態(tài)性在不同種族和地區(qū)正常人群間的分布差異，為與TGFβ1基因相關(guān)疾病的預(yù)防醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)等方面的研究提供一些前瞻性基礎(chǔ)資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

本次課題研究對(duì)象共210例，均為無(wú)血緣關(guān)系的廣西人群。其中男139例，女71例，平均年齡（47.9±10.1）歲，選自2013年6月至2014年4月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢人群的隨機(jī)個(gè)體，血常規(guī)及其他生化指標(biāo)均在參考范圍之內(nèi)，排除心血管疾病及癌癥家族史，排除腎臟、肝臟和內(nèi)分泌疾病。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

用EDTAK2抗凝的采血管采集以上健康體檢者靜脈血3 ml，參照已建立的方法[8]提取白細(xì)胞基因組DNA，放于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)多態(tài)性及已知的DNA序列，利用引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http：//www.yeastgenome.org/cgibin/webprimer）設(shè)計(jì)PCR引物，委托上海天昊生物科技有限公司合成。用于本次PCR特異性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的引物，上游引物序列為：5CCTCCCCACCACACCAG3，下游引物序列為：5CGGCA CCTCCCCCTGGCTCG3。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

TGFβ1 869T/C（Leu10Pro）的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中含10×PCR 緩沖液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，用滅菌雙蒸水補(bǔ)充其余不足體積至20 μL。TGFβ1 869T/C（Leu10Pro）的循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性反應(yīng)5 min；94℃變性40 s，66℃復(fù)性50 s，72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切

TGFβ1 869T/C（Leu10Pro）的擴(kuò)增產(chǎn)物用2 U MspA1I于37℃酶切2 h；PCR產(chǎn)物限制性酶切所用內(nèi)切酶來(lái)自英國(guó)Biolabs有限公司。TGFβ1 869T/C（Leu10Pro）酶切產(chǎn)物于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，染色后在紫外燈下觀察結(jié)果，并用BioRad自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行成像和分析。為進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果，我們將PCR產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，各組間基因型及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)計(jì)算和比較均在SPSS 130軟件上完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果

本次PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的片段大小為268 bp，依據(jù)限制性內(nèi)切酶MspA1I酶切片段情況，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型有3種，TT型（103，67，58和40 bp 4條帶），TC型[103，91，67，58，40和12 bp （跑出膠外，沒(méi)有顯示） 6條帶]，CC型（91，67，58，40和12 bp 5條帶）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1和圖2所示。后續(xù)的DNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了我們的結(jié)果（如圖3所示）。

2.2 廣西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型和等位基因在不同性別間分布頻率的比較

經(jīng)χ2檢驗(yàn)法計(jì)算，廣西健康人群TGFβ1基因的基因型和等位基因頻率分布符合HardyWeinberg遺傳平衡（哈迪溫伯格平衡），表明本次研究所選的樣本具有良好的群體代表性。廣西人群中，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)包含TT、TC和CC基因型，以TC（50.5%）型頻率最高，TT基因型次之。等位基因頻率中以T（50.5%）最高。廣西人群中，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布在不同性別間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。

圖2 TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）酶切產(chǎn)物8%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，2，8：TT基因型；3，6，9：TC基因型；4，5，7：CC基因型。

圖3 TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）測(cè)序圖：A、B、C分別表示CC、TC、TT基因型；箭頭所示為基因突變位點(diǎn)。

2.3 不同種族及地區(qū)人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較

廣西人群中，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與英國(guó)人[9]和埃及人[10]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但與日本人[11]、包頭漢族人[12]、寧夏漢族人[13]、廣東漢族人[14]和青島漢族人[15]比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

3 討 論

長(zhǎng)期的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在人類基因組中存在普遍的基因多態(tài)現(xiàn)象。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的日新月異，人們對(duì)基因多態(tài)性的認(rèn)識(shí)有了突破性的進(jìn)展，基因多態(tài)性的研究逐漸成為解釋人體對(duì)某些疾病或毒物的易感性與耐受性及疾病臨床表現(xiàn)的多樣性和對(duì)藥物治療的反應(yīng)性等現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制。然而，研究正常人群基因多態(tài)性分布是我們進(jìn)一步研究致病基因多態(tài)性分布的前提和基礎(chǔ)。正常人群基因多態(tài)性分布的研究，將為我們探索致病基因及易感基因的分布特點(diǎn)、疾病的發(fā)病機(jī)制提供前瞻性資料。

TGFβ1是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的一員，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞，包括活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和多數(shù)腫瘤細(xì)胞等表面。研究表明，TGFβ1通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖、分化及抑制NK細(xì)胞的增殖和殺傷等方式起到免疫抑制作用，這對(duì)于維持機(jī)體免疫系統(tǒng)穩(wěn)定有著重要作用。然而，在病理情況下，TGFβ1通過(guò)其免疫抑制作用損傷機(jī)體的免疫監(jiān)督功能，使機(jī)體失去對(duì)自身抗原、外來(lái)抗原及腫瘤相關(guān)抗原等抗原異物的正常免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致自身免疫性疾病或腫瘤的發(fā)生[16]。人類編碼TGFβ1的基因位于第19號(hào)染色體長(zhǎng)臂（19q13.2）上，分子生物學(xué)研究表明，TGFβ1基因存在869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，這些多態(tài)性位點(diǎn)的存在可能影響TGFβ1基因的功能，從而可能導(dǎo)致與之相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。TGFβ1基因存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[2～7]發(fā)現(xiàn)，這些多態(tài)性位點(diǎn)與纖維硬化性疾病、腫瘤性疾病、免疫性疾病和糖尿病等疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系，而869T/C（Leu10Pro）是其中一個(gè)重要位點(diǎn)。因此，正常人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)多態(tài)性分布的研究顯得很有必要，其研究成果將為與TGFβ1基因相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供一些基礎(chǔ)理論依據(jù)。

為此，我們運(yùn)用PCRRFLP技術(shù)和DNA測(cè)序法檢測(cè)廣西地區(qū)正常人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布情況。結(jié)果顯示，在廣西人群中，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)表現(xiàn)為T(mén)T、TC、CC三種基因型，頻率分別為25.2%、50.5%和24.3%；等位基因T、C頻率分別為50.5%和49.5%。其基因型和等位基因頻率分布在不同性別間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。進(jìn)一步將檢測(cè)結(jié)果同英國(guó)人[9]、埃及人[10]、日本人[11]、包頭漢族人[12]、寧夏漢族人[13]、廣東漢族人[14]和青島漢族人[15]比較發(fā)現(xiàn)，廣西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與英國(guó)人和埃及人比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但與日本人、包頭漢族人、寧夏漢族人、廣東漢族人和青島漢族人比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。通過(guò)本次研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在不同種族間比較存在較大差異，但與同一種族不同人群比較差異較小。這一結(jié)果符合“親緣關(guān)系越近的，其基因型的分布差異越小，反之則差異越大”的遺傳學(xué)規(guī)律。

總之，研究我國(guó)廣西地區(qū)正常人群TGFβ1基因單核苷酸多態(tài)性的分布特征，將有助于我們更深入地了解這些疾病在廣西人群的基因背景，為相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。同時(shí)，將其多態(tài)性分布與不同種族和地區(qū)人群比較，將為群體遺傳學(xué)和人類學(xué)研究提供基礎(chǔ)性參考資料。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2015-08-05 修回日期：2015-10-22）

（編輯：潘明志）