董世瑞，劉立增，居　陽(yáng)，林旭輝，連喜軍，*

（1.天津商業(yè)大學(xué)，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，天津300134；3.天津商業(yè)大學(xué)體育衛(wèi)生部，天津300134）

玉米直、支鏈淀粉回生對(duì)含羥基紅曲紅色素護(hù)色機(jī)理探討

董世瑞1，劉立增2，居陽(yáng)3，林旭輝1，連喜軍1，*

（1.天津商業(yè)大學(xué)，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，天津300134；3.天津商業(yè)大學(xué)體育衛(wèi)生部，天津300134）

以測(cè)定殘留紅曲紅色素方法研究了玉米直鏈淀粉、支鏈淀粉的回生和色素添加方式對(duì)含羥基紅曲紅色素護(hù)色的效果，并利用紅外光譜、核磁共振和X-射線衍射分析了淀粉護(hù)色機(jī)理。結(jié)果表明，玉米直鏈和支鏈淀粉的回生對(duì)紅曲紅色素具有明顯的護(hù)色作用，15h紫外光照可使紅曲紅色素的保留率由38.3%提高到70%以上。在淀粉回生的糊化、高壓和老化三個(gè)階段中，高壓后添加色素所得回生淀粉護(hù)色效果最好。核磁、紅外和X-射線結(jié)果表明，回生淀粉與色素在C1、C6上發(fā)生了結(jié)合；直鏈淀粉結(jié)合色素更多，所以護(hù)色效果更好。

回生玉米淀粉，紅曲紅色素，護(hù)色，機(jī)理

紅曲色素在我國(guó)食用已經(jīng)有上百年歷史，主要分紅、橙、黃三種色素，其中起呈色作用的主要是紅曲紅色素。紅曲紅色素具有對(duì)pH穩(wěn)定，耐熱性強(qiáng)，蛋白質(zhì)著色性好等特點(diǎn)，在我國(guó)廣泛用于酒、飲料、香腸、火腿等食品中［1-5］。與所有天然色素一樣，紅曲紅色素最大的缺點(diǎn)是在各種光輻射條件下會(huì)發(fā)生光褪色反應(yīng)［6-9］。淀粉中含有大量羥基，在回生過(guò)程羥基之間形成氫鍵并進(jìn)一步生成回生淀粉晶體。晶體可使光線發(fā)生折射從而減少紅曲紅色素吸收光能，進(jìn)而延長(zhǎng)其光褪色時(shí)間。本文以測(cè)定殘留紅曲紅色素方法研究了玉米直鏈淀粉、支鏈淀粉的回生和色素添加方式對(duì)含羥基紅曲紅色素護(hù)色的效果，并利用紅外光譜、核共振磁和X-射線衍射分析了其護(hù)色機(jī)理。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉米淀粉市售；紅曲紅山東中惠食品有限公司；薄層層析硅膠板GF254（20cm×20cm） 青島海洋化工有限公司；柱層析硅膠（200～300目） 青島海洋化工有限公司；甲醇、無(wú)水乙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氯化碳（分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；Lambda25紫外分光光度計(jì)美國(guó)PerkinElmer公司；KER3100-08S型精密恒溫工作臺(tái)南京凱爾儀器有限公司；FES135型紅外分光光度計(jì)美國(guó)Bio-Rad公司；D-500型X-射線衍射掃描儀Siemens，Madison，WI，USA。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1紅曲紅色素提純稱取市售紅曲紅色素30g裝入紙包，放置于索氏提取器中。分別用200mL正己烷、乙酸乙酯、甲醇作為索氏提取溶劑，按先后順序分別進(jìn)行3次索氏提取。將正己烷和乙酸乙酯提取液棄掉，將所得甲醇提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（50℃、55r/min）、干燥（65℃）至恒重。將0.5g色素溶解于5mL甲醇中，吸取0.05mL滴于薄層色譜板（20cm×20cm），用乙醇/石油醚（3∶7）做展開(kāi)劑展開(kāi)10cm后，層析板轉(zhuǎn)90°后用甲醇/二氯甲烷（1∶1）做展開(kāi)劑繼續(xù)展開(kāi)10cm。使用刮刀將紅色色帶刮下，甲醇溶解、過(guò)濾，自然干燥得純紅曲紅色素。

1.2.2玉米直鏈和支鏈淀粉的制備取10g淀粉溶于100mL蒸餾水中，90℃糊化20min，放入高壓鍋中120℃高壓（0.1磅/cm2）30min，取出冷卻后放冰箱4℃老化48h。取出老化后淀粉添加0.6mL高溫淀粉酶（200000U/mL）在95℃水解20min后離心（3050×g）得到沉淀為回生淀粉。用4mol/L KOH溶解回生淀粉至飽和溶液，再用6mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至中性。之后添加3倍體積正丁醇攪拌、離心（3050×g）后得到玉米直鏈淀粉。上清液中添加5倍體積無(wú)水乙醇攪拌、離心（3050×g）后得到玉米支鏈淀粉［10-11］。

1.2.3含紅曲紅色素玉米回生淀粉制備加9mg左右色素于10mL水中，使整個(gè)溶液中色素的吸光度為1.0。色素液分別在淀粉糊化前、糊化后、高壓后三個(gè)階段添加。所得含紅曲紅色素的回生淀粉于60℃干燥至恒重后經(jīng)研磨過(guò)120目篩子。

1.2.4紫外光輻射樣品將樣品置于平皿中攤平后，在距離紫外燈（45W）15cm處分別照射0、3、6、9、12、15h，取樣添加甲醇溶出其中色素，加水定容至10mL，測(cè)定490nm下吸光度，計(jì)算色素殘留率：

色素殘留率（%）=（溶出色素吸光度/1.0）×100

1.2.5紅外光譜分析將5mg淀粉用研缽研成細(xì)粉，在120℃干燥箱干燥30min，與200mg KBr混合后壓片，在27℃下采用Bio-Rad FES135紅外分光光度計(jì)掃描［10-11］。

1.2.6核磁氫譜分析干淀粉樣品用氘代水于60℃振蕩下溶解至澄清，用Mercury Vx-300 MHz（Varian，USA）核磁共振儀進(jìn)行分析，氫譜分析頻率300.07MHz，碳譜分析頻率75.45MHz，旋轉(zhuǎn)角45°，豫延遲時(shí)間1s，化學(xué)位移以tetramethylsilane（TMS）的化學(xué)位移（0）為參考［10-11］。

1.2.7X-射線衍射用銅箔和鎳箔包裹淀粉采用X-射線衍射儀掃描（D-500 Siemens，Madison，WI，USA）。掃描電流和電壓分別為27mA和50kV。掃描衍射角（2θ）從4°到40°，步長(zhǎng)為0.05°，間隔時(shí)間為2s。

表1　不同輻照時(shí)間色素殘留率（%）的變化Table 1　The variation of residual pigment（%）at different radiation time

2　結(jié)果與討論

2.1紅曲紅色素添加方式對(duì)回生玉米直鏈、支鏈淀粉護(hù)色效果的影響

表1為紅曲紅色素以不同方式添加于玉米直、支鏈回生淀粉前后淀粉對(duì)色素的光護(hù)色效果。由表1可知，經(jīng)15h輻照，對(duì)照組的色素殘留率降低為38.3%，而其他實(shí)驗(yàn)組都在46%以上，最高為糊化前色素加入玉米支鏈淀粉中所得回生淀粉，殘留率達(dá)到79.0%。輻照6h高壓后添加色素組中直鏈淀粉組的殘留率最高達(dá)到91.8%，輻照12h該組色素殘留率仍能達(dá)到81.6%，顯示該組具有很強(qiáng)的護(hù)色作用。這是因?yàn)樗弥?、支鏈淀粉均是從回生淀粉中分離出，鏈長(zhǎng)分布范圍較窄，鏈長(zhǎng)更短，所形成的淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)更不穩(wěn)定，這樣有利于淀粉鏈游離出來(lái)與色素結(jié)合。二者結(jié)合后，當(dāng)紫外光照射時(shí)，色素吸附的光能部分通過(guò)淀粉分散，從而降低了紅曲紅色素光降解的比率。對(duì)照組中色素主要以物理方式吸附于大豆蛋白、多肽等物質(zhì)上，不能轉(zhuǎn)換色素吸附的光能，因而光照后色素分解比較快。

2.2玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生及紫外光輻射的紅外圖譜

圖1為玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生及紫外光輻射的紅外光譜。

由圖1a可知，紅曲紅色素在波數(shù)為3309cm-1處有明顯紅外吸收，此處吸收為羥基伸縮振動(dòng)，說(shuō)明色素結(jié)構(gòu)中確實(shí)含有羥基。波數(shù)1541cm-1處吸收峰為C-N伸縮振動(dòng)，可能來(lái)源于色素結(jié)合的氨基酸。當(dāng)色素與淀粉混合回生時(shí)，如圖1c和圖1f所示，此處吸收消失。說(shuō)明回生過(guò)程淀粉和氨基酸競(jìng)爭(zhēng)色素的結(jié)合部位已將氨基酸替換。波數(shù)2930cm-1為亞甲基的C-H伸縮振動(dòng)，由圖1可知，紅曲紅色素和淀粉均有亞甲基存在，二者混合回生后該處吸收發(fā)生微小變化，說(shuō)明二者之間發(fā)生了結(jié)合。

由圖1b和圖1e可知，玉米回生淀粉中的直鏈和支鏈淀粉再次回生時(shí)，二者的紅外吸收基本沒(méi)有差異，這與文獻(xiàn)不同［12］。這主要與本次實(shí)驗(yàn)所用直、支鏈淀粉鏈長(zhǎng)和分子量分布范圍比較窄有關(guān)，根據(jù)文獻(xiàn)［12］，只有聚合度（DP）為10～60的淀粉才能參與回生，這次所用直、支鏈淀粉來(lái)自回生玉米淀粉，所以當(dāng)二者分子量差異減小到一定程度，回生過(guò)程淀粉鏈聚合方式就會(huì)接近。當(dāng)?shù)矸叟c色素混合回生時(shí)（圖1c和f），所得回生淀粉紅外圖譜中明顯具有色素的結(jié)構(gòu)吸收。對(duì)比圖1b、e和c、f可知，含色素回生淀粉在3340cm-1附近處的吸收由平滑變尖銳，說(shuō)明色素添加使回生淀粉中氫鍵形成量減?。?3］。這樣的回生淀粉在堿液中更容易分散和溶解。圖1中1618～1636cm-1處吸收峰是水的O-H彎曲振動(dòng)［14-15］，含色素回生淀粉中這些峰強(qiáng)度更大，說(shuō)明色素使回生淀粉中含水量增大。這可能是色素羥基與淀粉C6形成氫鍵時(shí)，阻礙了淀粉其他部位羥基間形成氫鍵，這些羥基可以和水形成氫鍵，這部分水在干燥過(guò)程不會(huì)被除去。

對(duì)比圖1d、g和c、f可知，紫外光輻射含色素回生直鏈和支鏈淀粉前后，淀粉的紅外吸收沒(méi)有發(fā)生變化。光照使淀粉在1401cm-1處的吸收增強(qiáng)，該處吸收是淀粉羥基相連碳原子上C-H彎曲振動(dòng)，該結(jié)構(gòu)中的氫原子可能是色素羥基形成氫鍵的一部分，當(dāng)色素吸收紫外光能量增大時(shí)，氫鍵振動(dòng)增強(qiáng)引起C-H彎曲振動(dòng)也增強(qiáng)了。

圖1　玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生及其紫外光輻照的紅外光譜Fig.1　IR spectra of retrograded maize amylose/amylopectin mixed with or without monascus red pigments and those samples radiated by ultraviolet light

2.3玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的核磁氫譜

圖2為玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的核磁氫譜。由圖2可知，色素的核磁氫譜化學(xué)位移范圍為0.7～4.7ppm，玉米直鏈淀粉的為3.3～5.0ppm。其中4.70ppm處的化學(xué)位移代表水分子，色素與淀粉混合形成結(jié)合物中仍然含有水［16］。色素中含羥基碳原子上氫原子化學(xué)位移為3.4～3.7ppm，而淀粉中5.05ppm是C1和C6碳原子上的氫的化學(xué)位移，3.69、3.38、3.31ppm分別代表C2、C3、C4、C5上氫的化學(xué)位移，其中C3、C2上氫的化學(xué)位移可能重疊在一起［16-18］。色素與淀粉結(jié)合后，淀粉的核磁氫譜最大的變化是5.05ppm處的化學(xué)位移轉(zhuǎn)移到4.94ppm，說(shuō)明色素與淀粉可能通過(guò)C1和C6碳原子形成氫鍵。

2.4玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的X-射線衍射

圖3為玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的X-射線衍射。由圖3a可知，含羥基紅曲紅色素晶體衍射峰出現(xiàn)在2θ 27°、31°、45°、56°、66°和75°。圖3b、c、d中尖銳峰2θ 28°、40°、50°、58°、66°、73°是KCl面心立方晶格的衍射峰［19］，這些氯化鉀是溶解玉米直、支鏈淀粉所用氫氧化鉀和中和溶液添加鹽酸反應(yīng)后產(chǎn)生的。對(duì)比圖3b和c，色素與玉米直鏈淀粉結(jié)合回生后，直鏈淀粉晶體衍射峰（衍射角為19°）衍射強(qiáng)度變?nèi)酰瑳](méi)有色素衍射峰，而氯化鉀衍射峰增強(qiáng)，說(shuō)明色素與氯化鉀可能競(jìng)爭(zhēng)玉米直鏈淀粉的羥基，結(jié)合色素的淀粉不容易形成淀粉回生晶體規(guī)則衍射峰。圖3e中出現(xiàn)了色素的衍射峰，說(shuō)明色素與玉米支鏈淀粉結(jié)合少，吸附色素在淀粉干燥過(guò)程重新結(jié)晶析出。結(jié)合紅外和核磁分析，玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素結(jié)合部位應(yīng)該在C1、C6原子上。色素與淀粉結(jié)合后色素光褪色減慢的原因可能跟回生淀粉阻光、阻自由基產(chǎn)生、穩(wěn)定色素結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖2　玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的核磁氫譜圖Fig.2　1H NMR spectra of retrograded maize amylose mixed with or without monascus red pigments

圖3　玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生X射線衍射Fig.3　X-ray diffraction of retrograded maize amylose/amylopectin mixed with or without monascus red pigments

3　結(jié)論

含羥基紅曲紅色素可產(chǎn)生類似金屬鹽晶體的X-射線衍射。玉米直、支鏈淀粉在回生過(guò)程可以與含羥基的紅曲紅色素發(fā)生氫鍵結(jié)合，將色素固定在回生淀粉中，直鏈淀粉比支鏈淀粉固定色素量多。固定色素后的玉米直、支鏈淀粉可結(jié)合更多的水。紅曲紅色素與玉米直鏈和支鏈淀粉結(jié)合后，盡管淀粉沒(méi)有形成規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu)，但色素與淀粉的結(jié)合對(duì)紅曲紅色素起到了很好的光護(hù)色作用。本文研究結(jié)果揭示回生淀粉可以被用作所有含羥基天然色素的光護(hù)色劑。

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Discussion of mechanism on monascus red pigments with hydroxyls protected by retrograded maize amylose and amylopectin

DONG Shi-rui1，LIU Li-zeng2，JU Yang3，LIN Xu-hui1，LIAN Xi-jun1，*
（1.The Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Department of Biological technology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.School of Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；3.School of Sports and Health，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

The effect of the retrogradation of maize amylose，amylopectin and the adding method of monascus red pigment on the color protection were studied by determining the rest monascus red pigment.The protection mechanism of starch was analyzed by IR，NMR and X-ray diffraction.The results showed that the protective effects of retrogradation of maize amylose and amylopectin on the monascus red pigment were obvious and the retention percentage of monascus red pigment was raised from 38.3%to more than 70%under the 15h of the UV irradiation.In three stages of starch retrogradation such as pasting，autoclaving and retrogradation，addition of monascs red pigment after autoclaving got the best results.The results of NMR，IR and X-ray diffractions indicated that the pigment was combined with the retrograded starch at the C1 and C6 during the retrogradation and the retrogradation of amylose got the better protective effects because amylose could combine with more pigments.

retrograded maize starch；monascus red pigment；color-protection；mechanism

TS231

A

1002-0306（2015）12-0302-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.055

2014－12－03

董世瑞（1973-），男，博士，研究方向：食品科學(xué)。

連喜軍（1972-），男，博士，主要從事回生淀粉方面的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271935）資助。