姜啟興，陳雪姣，許兆濱，許艷順，劉富俊，于沛沛，夏文水，*

（1．江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2．遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司，遼寧大連116113）

植物乳桿菌L-45發(fā)酵南極磷蝦殼的影響因素研究

姜啟興1，陳雪姣1，許兆濱2，許艷順1，劉富俊2，于沛沛1，夏文水1，*

（1．江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2．遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司，遼寧大連116113）

本文對植物乳桿菌L-45發(fā)酵南極磷蝦殼進行了研究。研究了外加碳源、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等因素對發(fā)酵過程中植物乳桿菌L-45產乳酸的變化及蝦殼脫鈣率的影響。確定了較好的發(fā)酵條件為：發(fā)酵周期48h，發(fā)酵溫度37℃，葡萄糖添加量為10%，料液比為1∶1，接種量為6%，此條件下脫鈣率為84.6%，得到的甲殼素與傳統(tǒng)化學法相比，性質相近，且對環(huán)境污染小。

植物乳桿菌，南極磷蝦殼，pH，脫鈣率

南極磷蝦分布在南大洋輻合區(qū)以南的水域，屬甲殼動物綱磷蝦目，其成體雖小，但生物量龐大，科學家最新的估計是6.5～10億噸，是人類可以利用的最大蛋白資源，具有較高的開發(fā)價值［1］。南極水域的磷蝦種類很多，常見的是南極大磷蝦（Euphausia superb），南極磷蝦的開發(fā)利用始于上世紀60年代［2］，是人類重要的后備蛋白庫［3］，除富含蛋白外，還富含亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸及鈣、鉀、鎂、鍶等多種礦物質元素，且類胡蘿卜素色素含量高［4-5］。目前，國內外研究更多的是南極磷蝦肉中蛋白、脂溶性成分等的分離和應用［6］，對磷蝦殼資源的研究較少。

蝦殼大多作為廢棄物丟棄，亟需有效的開發(fā)利用，例如利用蝦殼廢棄物制備甲殼素，但是目前的技術存在明顯不足：如一般采用強酸脫鈣和強堿脫蛋白，不僅對甲殼素的分子鏈有一定的破壞，且能耗高，對環(huán)境污染較嚴重，而且其中的蛋白、鈣質等礦物質均無法回收［7］。國外已有利用微生物發(fā)酵，對蝦蟹等廢棄物進行生物發(fā)酵制備甲殼素的研究，Zakaria［8］使用副干酪乳桿菌發(fā)酵蝦殼，蛋白質去除率為77.5%。Jung［9］使用了副干酪乳桿菌發(fā)酵蟹殼，最終脫蛋白率達到52%。該方法比傳統(tǒng)的酸堿法反應更溫和、甲殼素結構更穩(wěn)定，成本低，是一種節(jié)能環(huán)保的清潔生產方法，發(fā)酵殘渣即為粗甲殼素，可以實現(xiàn)對資源全面有效的利用，并且易于實現(xiàn)工業(yè)化生產［10］。

從上述可見關于干酪乳桿菌發(fā)酵蝦蟹殼國內外已有研究報道，本研究以實驗室篩選出的高產乳酸的植物乳桿菌L-45發(fā)酵南極磷蝦殼，利用發(fā)酵產生的乳酸脫除蝦殼中的碳酸鈣，研究發(fā)酵過程中磷蝦殼的pH及脫鈣率的變化情況，優(yōu)化發(fā)酵脫鈣條件。

1　材料與方法

1.1材料與設備

南極磷蝦（Euphausia superb） 遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司提供，于-18℃凍藏，冷凍南極磷蝦自然解凍，經(jīng)采肉機采肉三次后得南極磷蝦殼，于-18℃凍藏備用；植物乳桿菌L-45（Lactobacillus plantarum）

為食品學院食品加工與配料中心實驗室保藏菌種，活化后備用。

JB 5374-91電子天平、FE20實驗室pH計梅特勒-托利多（上海）有限公司；YCR-180采肉機上海華夏漁業(yè)機械儀器工貿公司；501型超級恒溫器上海市實驗儀器廠；90-2恒溫磁力攪拌器上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫水槽上海一恒科學儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠；UV1000紫外-可見分光光度計上海天美科學儀器有限公司；4K-15高速冷凍離心機Sigma公司；THZ-D恒溫振蕩器太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1外加碳源對植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘渣25g，分別添加等量碳源（葡萄糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、淀粉、麥芽糊精），添加量均為10%；接種5%植物乳桿菌菌液，于37℃發(fā)酵12、24、36、48、60、72h，測發(fā)酵液pH；每個樣品平行3次，確定最合適的碳源。

1.2.2發(fā)酵時間對植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘渣25g，接種5%植物乳桿菌菌液，料液比為1∶2，10%的葡萄糖，于37℃發(fā)酵12、24、36、48、60、72h后分別測發(fā)酵液pH，灰分變化；每個樣品平行3次，確定最合適的發(fā)酵時間。

1.2.3葡萄糖添加量對植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘渣25g，接種5%植物乳桿菌菌液，料液比為1∶2，葡萄糖添加量分別為5%、10%、15%、20%、25%，于37℃發(fā)酵48h測發(fā)酵液pH，灰分變化；每個樣品平行3次，確定最合適的葡萄糖添加量。

1.2.4發(fā)酵溫度對植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘渣25g，接種5%植物乳桿菌菌液，料液比為1∶2，葡萄糖添加量為10%，分別于30、35、37、40、45℃發(fā)酵48h測發(fā)酵液pH，灰分變化；每個樣品平行3次，確定最合適的發(fā)酵溫度。

1.2.5接種量對植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取已經(jīng)脫蛋白的下腳料殘渣25g，料液比為1∶2，葡萄糖添加量為10%，接種量分別為1%、2%、4%、6%、8%、10%，于37℃發(fā)酵48h測發(fā)酵液pH，灰分變化；每個樣品平行3次，確定最合適的接種量。

1.2.6料液比對植物乳桿菌發(fā)酵蝦殼發(fā)酵產酸和蝦殼脫鈣率的影響稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘渣25g，葡萄糖添加量為10%，接種量分別為5%，料液比分別為1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，于37℃發(fā)酵48h測發(fā)酵液pH，灰分變化；每個樣品平行3次，確定最合適的料液比。

1.2.7傳統(tǒng)酸堿法與生物發(fā)酵法制備的甲殼素基本成分比較分析生物發(fā)酵法：稱取經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫蛋白后的蝦殼殘渣25g，植物乳桿菌接種量6%，料液比為1∶1，葡萄糖添加量10%，于37℃發(fā)酵48h后，過濾酶解液得甲殼素濾渣，蒸餾水沖洗至中性，烘干后測定基本成分。傳統(tǒng)酸堿法：稱取50g南極磷蝦殼，用500mL 5%鹽酸浸泡24h，每4h攪拌一次，紗布過濾后水洗至中性，用6%氫氧化鈉溶液煮沸1h，紗布過濾，濾渣水洗至中性后烘干測定其基本成分。

1.3分析方法

1.3.1脫鈣率的測定脫鈣率的測定參照Aytekin［11］，按照以下公式計算：

1.3.2甲殼素得率的測定甲殼素得率［12］（%）=甲殼素的質量/加工下腳料的質量×100

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件；數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.0軟件。

2　結果與分析

2.1不同實驗因素對發(fā)酵產酸及脫鈣率的影響

2.1.1碳源的選擇對植物乳桿菌產酸的影響由圖1可以看出，以葡萄糖作為碳源時，發(fā)酵液的pH最低。此外，可以發(fā)現(xiàn)以淀粉為碳源的發(fā)酵液pH最高，且難以抑制腐敗菌生長，從而使發(fā)酵液發(fā)生腐敗。雖然蔗糖和果糖作為碳源時，植物乳桿菌的產酸效果也很好，但其成本較高，綜合考慮，最終選擇葡萄糖作為碳源。

圖1　碳源的選擇對發(fā)酵產酸的影響Fig.1　pH trends during fermentation with different carbon source

2.1.2發(fā)酵時間對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響由圖2可見，在12～72h內，發(fā)酵液的pH迅速降低，pH達到3.5左右，此后變化趨緩；此外，蝦殼發(fā)酵脫鈣率在12～48h內呈急劇增高趨勢，之后增長速度趨于平緩，產生此結果的原因可能是植物乳桿菌在48h前碳源、氮源等充足，微生物代謝旺盛，但超過48h后，隨著營養(yǎng)物質的減少以及產物的反饋抑制，從而產酸變緩，pH下降不顯著。較高的酸度有利于蝦殼中鈣的脫除和抑制腐敗現(xiàn)象的發(fā)生，而超過48h后發(fā)酵液的pH下降已不顯著，因此，發(fā)酵時間選擇48h左右比較合適。

圖2　發(fā)酵時間對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.2　pH trends and DM rate during fermentation with different fermentation time

2.1.3葡萄糖添加量對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響在乳酸菌脫鈣的研究中，添加葡萄糖更有助于乳酸的產生［13-15］，由圖3可以看出，隨著葡萄糖添加量的增加，pH呈現(xiàn)下降趨勢，且當添加量大于15%時，發(fā)酵液中pH無明顯變化，蝦殼的脫鈣率也無明顯變化。而對于脫鈣率而言當葡萄糖添加量達到10%～15%，基本達到最大值，考慮葡萄糖添加量增大產生的生產成本增加，而且發(fā)酵液對于菌體的滲透壓也隨之增加，這時菌體的生長可能會受到抑制，對發(fā)酵造成傷害［10］，因此葡萄糖糖添加量確定為10%。發(fā)酵過程中添加的葡萄糖一部分被當作碳源，還有一部分被轉化成乳酸，乳酸與蝦殼中的碳酸鈣反應，鈣被溶解形成乳酸鈣，因此，在發(fā)酵的開始階段，植物乳桿菌不斷消耗葡萄糖，乳酸不易積累，直到發(fā)酵時間的增加才產生更多的乳酸，因此，發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗較大［16］。

圖3　葡萄糖添加量對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.3　pH trends and DM rate during fermentation with different glucose concentration

2.1.4發(fā)酵溫度對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響植物乳桿菌的最佳生長溫度為30～38℃［17］，由圖4可以看出，在30～37℃溫度范圍內發(fā)酵液的產酸量較高，pH較低，且37℃時達到最大，pH達到最低，脫鈣率較高。因此，選用37℃為最優(yōu)發(fā)酵溫度。

圖4　發(fā)酵溫度對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.4　pH trends and DM rate during fermentation with different temperature

2.1.5接種量對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響圖5可以看出，隨接種量提高pH降低，但當接種量超過6%以后，pH反而有輕微上升，產生這種現(xiàn)象可能是當接種量增大到一定量時，因為菌種的快速生長導致營養(yǎng)很快耗盡，發(fā)酵后期代謝產物的產生受到影響，不能累積足夠的酸，因此pH反而上升；同時，接種量為6%時，蝦殼脫鈣率也達到最大值?？紤]實際操作的成本，所以除首次發(fā)酵時接種6%用培養(yǎng)基活化的菌種之外，接下來的發(fā)酵過程可以用上一次發(fā)酵的發(fā)酵液進行接種，這種生產上不僅可行而且更節(jié)約的方法值得推崇。

圖5　接種量對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.5　pH trends and DM rate during fermentation with different inoculum quanity

圖6　料液比對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響Fig.6　pH trends and DM rate during fermentation with different solid-liquid ratio

2.1.6料液比對植物乳桿菌產酸及蝦殼脫鈣率的影響由圖6可以看出，當料液比小于1∶1時，蝦殼的脫鈣率呈上升趨勢，在液料比為1∶1時，蝦殼的脫鈣率達到最大值，而當料液比達到1∶2以后時，蝦殼的脫鈣率明顯的急劇下降，發(fā)酵液pH隨料液比的增加而降低；在料液比1∶2時下降趨勢趨于平緩，且過大的料液比對副產物（乳酸鈣）濃縮等后續(xù)工藝操作不利。綜合考慮，最佳料液比為1∶1。

2.2生物發(fā)酵法與傳統(tǒng)酸堿法制備的甲殼素基本成分比較分析

在上述單因素研究初步確定的較好的發(fā)酵條件即：發(fā)酵周期48h，發(fā)酵溫度37℃，葡萄糖添加量為10%，料液比為1∶1，接種量為6%下發(fā)酵，進行發(fā)酵制備甲殼素，并與傳統(tǒng)化學法制備的甲殼素進行比較，結果見表1，由表1可以看出，在此條件下脫鈣率達到84.6%，略低于傳統(tǒng)酸堿法。傳統(tǒng)酸堿法與生物發(fā)酵法制備的成品甲殼素含量、水分等指標均相近，且甲殼素中的灰分已經(jīng)很少，只有0.3g/100g左右，根據(jù)食品級甲殼素的要求［18］，簡單的處理后即可成為商品甲殼素，不需要再經(jīng)酸堿處理，基本無廢水、廢渣產生，并且以傳統(tǒng)的酸堿法制備甲殼素，強酸和強堿對甲殼素的分子結構有一定的破壞［19］，而且能耗高，下腳料污染環(huán)境。

表1　傳統(tǒng)酸堿法與生物發(fā)酵法制備的甲殼素基本成分及性質Table 1　Compositions and properties of krill waste，residues after chemical treatments and fermentation

3　結論

比較了葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖及可溶性淀粉等碳源對植物乳桿菌發(fā)酵南極磷蝦殼的影響，表明以葡萄糖為碳源發(fā)酵效果好，體系pH最低。研究發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長體系pH逐漸降低，脫鈣率逐漸增高，到48h后趨于平緩，初步確定較好的發(fā)酵時間為48h。隨著葡萄糖添加量的增大體系pH逐漸降低，而鈣脫除率則先增大，后降低趨勢，在10%～15%達到最大，綜合考慮成本問題，選擇添加量10%。隨著發(fā)酵溫度、接種量、料液比的增大，體系pH呈先下降后增大趨勢，而鈣脫除率則呈先增大后降低趨勢，最適發(fā)酵溫度為37℃左右，最適接種量為6%，最適料液比為1∶1。通過單因素實驗確定的發(fā)酵條件：發(fā)酵周期48h，發(fā)酵溫度37℃，葡萄糖添加量10%，料液比1∶1，接種量6%下發(fā)酵制備甲殼素，脫鈣率達到84.6%，與傳統(tǒng)酸堿化學法制得的甲殼素相比各指標相近，表明利用本方法生產甲殼素具有一定的開發(fā)應用前景。

［1］王榮，孫松.南極磷蝦漁業(yè)現(xiàn)狀與展望［J］.海洋科學，1995（4）：28-32.

［2］謝營梁.南極磷蝦（Euphausia superba）開發(fā)利用的現(xiàn)狀和趨勢［J］.現(xiàn)代漁業(yè)信息，2004，19（4）：18-20.

［3］Tou J C，J Jaczynski，Y C Chen.Krill for human consumption：nutritionalvalueandpotentialhealthbenefits［J］.Nutrition Reviews，2007，65（2）：63-77.

［4］Yoshitomi B.Utilization of Antarctic krill for food and feed［J］.Developments in Food Science，2004（42）：45-54.

［5］.孫雷，周德慶，盛曉風.南極磷蝦營養(yǎng)評價與安全性研究［J］.海洋水產研究，2008，29（2）：57-64.

［6］任艷.南極磷蝦蛋白加工利用的初步研究［D］.青島：中國海洋大學，2009.

［7］劉斯雅，林瑞君，莊澤娟，等.植物乳桿菌發(fā)酵蝦頭，蝦殼回收蛋白質和甲殼素的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27（4）：408-411.

［8］Z Zakaria，GM Hall，G Shama.Lactic acid fermentation of scampi waste in a rotating horizontal bioreactor for chitin recovery［J］.Process Biochemistry，1998，33（1）：1-6.

［9］WJ Jung，GH Jo，JH Kuk，et al.Production of chitin from red crab shell waste by successive fermentation with Lactobacillus paracasei KCTC-3074 and Serratia marcescens FS-3［J］. Carbohydrate Polymers，2007，68（4）：746-750.

［10］林瑞君，莊澤娟，劉斯雅，等.以嗜酸乳桿菌發(fā)酵蝦頭蝦殼回收蛋白質和甲殼素的研究［J］.農產品加工，2010，2010（11B）：14-18.

［11］O Aytekin，M Elibol.Cocultivation of Lactococcus lactis and Teredinobacter turnirae for biological chitin extraction from prawn waste［J］.Bioprocess and Biosystems Engineering，2010，33（3）：393-399.

［12］Gigliotti J C，Davenport M P，Beamer S K，et al.Extraction and characterisation of lipids from Antarctic krill（Euphausia superba）［J］.Food Chemistry，2011，125（3）：1028-1036.

［13］黃瓃.微生物發(fā)酵蝦殼制備甲殼素的研究［D］.武漢：湖北工業(yè)大學，2012.

［14］Bhaskar N，Suresh PV，Sakhare PZ，et al.Shrimp biowaste fermentation with Pediococcus acidolactici CFR2182：opimization of fermentation conditions by response surfacemethodology and effect of optimised conditions on deproteination/demineralization and carotenoid recovery［J］.Enzyme Microb Technol，2007（40）：1427-1434.

［15］Shirai K，Guerrero I，Huerta S，et al.Effect of initial glucose concentration andinoculation level of lactic acid bacteria in shrimp waste ensilation［J］.Enzyme Microb Technol，2001（28）：446-452.

［16］段杉，張影霞，陸婷婷，等.利用乳酸菌發(fā)酵協(xié)同自溶作用回收蝦頭、蝦殼中的蛋白質［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（2）：80-83.

［17］李丹，崔春，王婭琴，等.高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中蛋白質降解規(guī)律的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010（9）：24-28.

［18］中華人民共和國農業(yè)部全國水產標準化委員會.SC/T 3403-2004.甲殼質與殼聚糖［S］.北京：中國標準出版社，2005.

［19］NgC H，S Chandrkrachang，W F Stevens.Effect of the rate of deacetylation on the physico-chemical properties of cuttlefish chitin［J］.Adv Chitin Science，2000（4）：50-54.

Study on the influencing factors of fermentation of Antarctic krill shells with Lactobacillus plantarum L-45

JIANG Qi-xing1，CHEN Xue-jiao1，XU Zhao-bin2，XU Yan-shun1，LIU Fu-jun2，YU Pei-pei1，XIA Wen-shui1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Liaoning Province Dalian Ocean Fishery Group，Dalian 116113，China）

In this study Lactobacillus plantarum L-45 was used as start strains to ferment Antarctic krill shells. The effects of carbon source，the fermentation time，the fermentation temperature and other factors on acid production of L-45 the variation and demineralization rate of krill shell were studied.The optimum fermentation conditions were as follows：fermentation time 48h，temperature 37℃，inoculums quantity 6%，glucose added 10%，and the ratio of material to liquid 1∶1.Under these conditions the demineralization rate was 84.6%.The obtained chitin was similar in nature and friendly to environment compared with the traditional chemical method. Key words：Lactobacillus plantarum L-45；krill shell waste；pH；decalcification rate

TS254.9

A

1002-0306（2015）14-0212-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.035

2014－09－26

姜啟興（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品加工與保藏。

夏文水（1958-），男，教授，研究方向：食品加工與保藏。

“十二五”國家“863”計劃項目（2011AA090801）。