趙振廣，潘樹義，李航

（1.中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院，北京100853；2.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院高壓氧醫(yī)學(xué)中心，北京100048）

大鼠激素性股骨頭壞死的2種造模方法比較*

趙振廣1，2，潘樹義1，2，李航2

（1.中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院，北京100853；2.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院高壓氧醫(yī)學(xué)中心，北京100048）

目的比較不同地塞米松用藥方案腹腔注射建立大鼠激素性股骨頭壞死模型的可靠性及成功率，為大鼠激素性股骨頭壞死模型的建立方法提供基本數(shù)據(jù)。方法將30只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為A組、B組、C組，各10只。A組給予地塞米松磷酸鈉注射液20 mg/（kg·d）腹腔注射，1次/周；B組給予地塞米松磷酸鈉注射液10 mL/（kg·d）腹腔注射，2次/周；C組給予0.9%氯化鈉注射液20 mL/（kg·d）腹腔注射，1次/周；均持續(xù)8周。于首次給藥8周末攝雙髖正位X線檢查，次日處死取雙側(cè)股骨頭標(biāo)本，行組織形態(tài)學(xué)檢查。結(jié)果A、B、C 3組大鼠股骨頭雙髖正位X線檢查均未發(fā)現(xiàn)異常，但在病理切片上可發(fā)現(xiàn)顯著性差異，證實(shí)激素性股骨頭壞死造模成功，而B組股骨頭壞死改變較A組明顯嚴(yán)重。結(jié)論腹腔注射地塞米松20 mg/（kg·d），1次/周，持續(xù)8周的方案和地塞米松10 mL/（kg·d），2次/周，持續(xù)8周的方案均能成功建立大鼠激素性股骨頭壞死的早期模型，但后一種造模方案更優(yōu)。

股骨頭壞死；激素；地塞米松；大鼠；動(dòng)物試驗(yàn)

隨著糖皮質(zhì)激素在臨床工作中的大量應(yīng)用，目前激素性股骨頭缺血性壞死（SANFH）已成為非創(chuàng)傷型股骨頭壞死的首要病因［1-2］，該病進(jìn)展迅速，如不能采取有效干預(yù)手段，將很快進(jìn)入不可逆的病理進(jìn)程，且缺乏有效根治方法［3］。有關(guān)激素引起股骨頭壞死的學(xué)說很多，然而其確切機(jī)制和始動(dòng)環(huán)節(jié)仍未明了，因此，建立理想的股骨頭壞死的動(dòng)物模型，是研究SANFH發(fā)病機(jī)制和早期診治的重要手段。本研究中擬采用長(zhǎng)期地塞米松小劑量腹腔注射的方法，比較不同地塞米松用藥方案的造模效果，為大鼠早期SANFH模型的成功建立提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試藥

健康雄性4月齡Wistar大鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，合格證編號(hào)：SCXK-＜軍＞2012-004）30只，體重（0.21±0.01）kg，將大鼠分6籠，每籠5只，飼養(yǎng)于海軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)條件一致，所喂養(yǎng)的顆粒飼料由海軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。地塞米松磷酸鈉注射液（國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H41020036）；水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673）；多聚甲醛及10%EDTA脫鈣液（自配）。AXIOM Aristos MX型西門子X線攝影成像系統(tǒng)（海軍總醫(yī)院影像科提供）；動(dòng)物固定架（自制）；RM2235石蠟切片機(jī)、LEICA DM500三目生物顯微鏡及圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作及分組

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，電子稱稱重并編號(hào)，采取隨機(jī)數(shù)字表法將35只大鼠分為3組，各10只。A組給予地塞米松磷酸鈉注射液20 mg/（kg·d）腹腔注射，1次/周；B組給予地塞米松磷酸鈉注射液10 mL/（kg·d）腹腔注射，2次/周；C組為空白對(duì)照組，給予0.9%氯化鈉注射液20 mL/（kg·d）腹腔注射，1次/周；均持續(xù)8周。

1.2.2 大體觀察X線檢查

主要觀察試驗(yàn)動(dòng)物體重變化、步態(tài)、毛發(fā)光澤度及動(dòng)物股骨頭大體形態(tài)。于距首次注射8周末，全部動(dòng)物水合氯醛麻醉，攝雙髖正位X線片。

1.2.3 病理組織學(xué)檢查

X線檢查后1 d，采用放血處死法，固定動(dòng)物，取雙側(cè)股骨頭，將所取標(biāo)本按動(dòng)物編號(hào)分別置多聚甲醛溶液中固定2 d，然后置10%EDTA緩沖液中脫鈣，每周更換脫鈣液1次，持續(xù)2個(gè)月后通過探針檢測(cè)判斷脫鈣完全。將脫鈣后的股骨頭常規(guī)脫水、透明、包埋制成蠟塊，沿縱面剖開，切片行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓組織、骨小梁、成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的形態(tài)數(shù)量變化，并計(jì)算空骨陷窩率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用CHISS 7.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步分析采用SNK-q檢驗(yàn)法，如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或組間方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

3組動(dòng)物均無意外死亡，未見明顯步態(tài)異常。A組及B組可見毛發(fā)雜亂，缺少光澤并伴有明顯消瘦，且B組消瘦更明顯（表1），C組大鼠體型正常。3組動(dòng)物股骨頭外觀均晶瑩光滑，肉眼觀察無明顯差異。

2.2 X線檢查結(jié)果

3組動(dòng)物行髖關(guān)節(jié)正位X線檢查，結(jié)果均無異常，見圖1。

2.3 病理組織學(xué)觀察

選取股骨頭軟骨下區(qū)域作為主要觀察視野。C組標(biāo)本骨小梁排列規(guī)整，連續(xù)性好，骨髓組織含量豐富，正常形態(tài)骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞在視野中多見，骨細(xì)胞空陷窩罕見；B組標(biāo)本均出現(xiàn)骨小梁稀疏、變細(xì)，甚至斷裂或被疏松結(jié)締組織包繞分解成云片狀，結(jié)構(gòu)紊亂，骨髓組織壞死多見，視野中成骨細(xì)胞稀少，骨細(xì)胞核固縮、邊聚甚至消失形成空骨陷窩；A組標(biāo)本亦出現(xiàn)輕微股骨頭壞死征象，骨髓組織有壞死，但總體含量較B組豐富，骨小梁亦有稀疏、變細(xì)現(xiàn)象，但明顯輕于B組，可見成骨細(xì)胞，空骨陷窩少見。見圖2。在高倍鏡下任意選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)形態(tài)完全正常的骨細(xì)胞數(shù)量和空骨陷窩細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算空骨陷窩率，以判斷股骨頭壞死程度，結(jié)果見表2?？梢?，3組間正常形態(tài)骨細(xì)胞數(shù)量及空骨陷窩率兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 3組大鼠喂養(yǎng)8周后體重大小比較

圖1 大鼠雙髖正位X線片

圖2 病理組織學(xué)觀察（HE×100）

表2 3組股骨頭切片正常形態(tài)骨細(xì)胞數(shù)量對(duì)比（±s）

表2 3組股骨頭切片正常形態(tài)骨細(xì)胞數(shù)量對(duì)比（±s）

組別A組B組C組切片數(shù)（張）20 20 20正常形態(tài)骨細(xì)胞數(shù)量（個(gè)）17.5±2.24*▲11.7±2.30*31.0±5.15空骨陷窩率（%）12.0±2.16*▲16.5±2.53*7.3±1.25

3 討論

關(guān)于如何獲得一個(gè)經(jīng)濟(jì)可靠的SANFH動(dòng)物模型，學(xué)術(shù)界進(jìn)行的研究很多，然而想得到3期以上的激素性股骨頭壞死模型卻十分困難，分析主要有以下2個(gè)原因：其一，動(dòng)物對(duì)激素的耐受性與人類不同，如白兔對(duì)激素耐受性差，大鼠則相反，注射劑量小易導(dǎo)致造模失敗，而劑量大又會(huì)引起試驗(yàn)動(dòng)物大量死亡；其二，四足動(dòng)物與人類股骨頭解剖上區(qū)別明顯，激素之所以在人類容易引起股骨頭壞死不僅是因?yàn)榫植垦芙馄室蛩?，作為?fù)重關(guān)節(jié)，機(jī)械應(yīng)力的原因亦不可忽視，而在四足動(dòng)物，股骨頭處的負(fù)重顯然要小得多，此類模型一般僅出現(xiàn)股骨頭壞死的早期表現(xiàn)，且壞死區(qū)域在股骨頭少見，反而干骺端更多見［4］。理論上，早期SANFH的動(dòng)物模型更易獲得，但實(shí)際造模成功率并不高。

Kuribayashi等［5］嘗試用肌肉注射甲基強(qiáng)的松龍的方式建立兔SANFH模型，注射劑量為20 mg/（kg·d）。結(jié)果顯示，1個(gè)月后股骨頭壞死的發(fā)生率為70%，但有20%的試驗(yàn)動(dòng)物在肌肉注射甲基強(qiáng)的松龍后死亡；Takao等［6］使用同樣的劑量造模，卻以失敗告終，僅觀察到股骨近端干骺端的骨髓壞死；Zhang等［7］則采用皮下注射的方式給予家兔甲基強(qiáng)的松龍，劑量為21 mg/（kg·d），1個(gè)月后，有80%的家兔可觀察到股骨頭壞死發(fā)生。Yang等［8］在建立鼠SANFH模型中使用了2種不同方案，給藥方式為在飲水中加入地塞米松，2種方案均在第1周加入地塞米松4 mg/（L·d）。持續(xù)給藥組從第2周起給藥劑量改為2 mg/（L·d），間斷給藥組則僅在每周中的后3.5 d給予4 mg/（L·d），2種方法總給藥量相同，持續(xù)12周后的觀察結(jié)果提示，持續(xù)給藥組骨壞死的發(fā)生率為45%，顯著高于間斷給藥組的8%。Kerachian等［9］將潑尼松緩釋微丸植入大鼠皮下，平均釋放劑量相當(dāng)于1.82～2.56 mg/（kg·d），為期90 d，成功觀察到骨細(xì)胞的凋亡。

根據(jù)以上研究可推測(cè)，在總激素量不變的情況下，增加給藥頻率，激素所產(chǎn)生的不良反應(yīng)更明顯，因而股骨頭壞死發(fā)生率及壞死程度更重，符合臨床上所行“激素間斷性給藥”方案研究結(jié)果［10］。本研究中采取了2種給藥模式進(jìn)行造模來驗(yàn)證這一推測(cè)，參考前文提及的Yang等［8］試驗(yàn)中的總給藥劑量，本研究中同樣采用地塞米松進(jìn)行造模，給藥方式為腹腔注射，A組和B組總注射劑量相同。參考大量學(xué)者的試驗(yàn)研究，選定8周作為時(shí)間節(jié)點(diǎn)來判定造模效果。結(jié)果顯示，A、B兩組大鼠均有明顯消瘦，且B組大鼠體重減輕更明顯，推測(cè)更高的給藥頻率產(chǎn)生的不良反應(yīng)更強(qiáng)。病理切片結(jié)果提示，雖然A、B兩組大鼠均有骨髓壞死，正常形態(tài)骨細(xì)胞數(shù)量減少等早期骨壞死改變，但B組在股骨頭組織病理切片上損害更嚴(yán)重，骨髓壞死的面積也有更大趨勢(shì)。

一般認(rèn)為，骨壞死的病理改變主要為骨髓組織壞死并伴有骨小梁中空骨陷窩增多，可見彌散性的骨細(xì)胞核固縮［11］，本試驗(yàn)中A、B兩組的病理結(jié)果均與之相符。根據(jù)目前應(yīng)用最廣泛的激素性股骨頭缺血性壞死國(guó)際骨循環(huán)研究學(xué)會(huì)1991分期，其中0期的表現(xiàn)為，X線片、核磁共振、骨掃描檢查均無異常，但在行病理學(xué)檢查時(shí)可發(fā)現(xiàn)股骨頭內(nèi)組織壞死；Ⅰ期表現(xiàn)為，X線片正常，但核磁共振和骨掃描可發(fā)現(xiàn)異常，此期股骨頭形態(tài)無異常，病理切片上可觀察到壞死灶與正?；罟墙缦廾黠@。本試驗(yàn)中未行核磁共振及骨掃描檢查，但根據(jù)X線檢查及病理切片結(jié)果認(rèn)為，A、B兩組大鼠均符合0期SANFH的改變，且B組造模方案空骨陷窩率更高，骨細(xì)胞壞死更明顯，較A組更優(yōu)。此外，二者在病理上的結(jié)果均提示早期SANFH中已存在骨細(xì)胞死亡，成骨細(xì)胞減少的現(xiàn)象。成骨細(xì)胞是參與骨修復(fù)的最主要細(xì)胞，已有研究表明，激素對(duì)成骨細(xì)胞有明顯的抑制作用。Smith等［12］曾報(bào)道激素可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來影響成骨細(xì)胞增殖，還有研究發(fā)現(xiàn)激素可促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡［13］，可推測(cè)激素在破壞股骨頭骨細(xì)胞的同時(shí)還通過抑制成骨細(xì)胞減慢其修復(fù)反應(yīng)，使得激素性股骨頭壞死中的修復(fù)反應(yīng)非常微弱。因此，打破壞死、修復(fù)之間的平衡可能是激素導(dǎo)致早期骨壞死發(fā)生的機(jī)制之一，也正是由于修復(fù)速度趕不上破壞速度，使得骨壞死不斷進(jìn)展，最終發(fā)展到晚期的股骨頭塌陷。

本研究的不足之處在于，所得到的動(dòng)物模型僅有早期骨壞死改變，造模方案操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，動(dòng)物均無死亡，且組內(nèi)大鼠在病理切片的表現(xiàn)上呈均一性反應(yīng)，其中B組方案的動(dòng)物模型骨壞死改變更明顯，將該動(dòng)物模型應(yīng)用于試驗(yàn)研究中效果更佳，可對(duì)深入研究SANFH的發(fā)病機(jī)制及早期干預(yù)措施起到積極的推動(dòng)作用，值得在科研中推廣運(yùn)用。

［1］朱振安，嚴(yán)孟寧.成人股骨頭壞死的病因和發(fā)病機(jī)制［J］.中華骨科雜志，2010，30（1）：6-9.

［2］JonesLC，HungerfordDS.Osteonecrosis：etiology，diagnosis，andtreatment［J］. Curr Opin Rheumatol，2004，16（4）：443-449.

［3］Weinstein RS.Glucocorticoid-Induced Bone Disease［J］.N Engl J Med，2011，365（1）：62-70.

［4］Fan M，Peng J，Qin L.Experimental animal models of osteonecrosis［J］. Rheumatol Int，2011，31（8）：983-994.

［5］Kuribayashi M，F(xiàn)ujioka M，Takahashi KA，et al.Vitamine prevents steroid-induced osteonecrosis in rabbits［J］.Acta Orthop，2010，81（1）：154-160.

［6］Takao M，Sugano N，Nishii T，et al.Different magnetic resonance imaging features in two types of nontraumatic rabbit osteonecrosis models［J］.Magn Reson Imaging，2009，27（2）：233-239.

［7］Zhang X，Liu Y，Ren K，et al.Secondary total hip arthroplasty for osteonecrosis of femoral head after failed internal fixation of femoral neck fracture［J］.Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi，2010，24（3）：257-261.

［8］Yang L，Boyd K，Kaste SC，et al.A mouse model for glucocorticoid-induced osteonecrosis：effect of a steroid holiday［J］.J Orthop Res，2009，27（2）：169-175.

［9］Kerachian MA，Harvey EJ，Cournoyer D，et al.A rat model of early stage osteonecrosis induced by glucocorticoids［J］.Journal of Orthopaedic Surgery and Research，2011，6：62.

［10］Frediani B，F(xiàn)alsetti P，Bisogno S，et al.Effects of high dose methylprednisolone pulse therapy on bone mass and biochemical markers of bone metabolism in patients with active rheumatoid arthritis：a 12 months randomized prospective controlled study［J］.J Rheumatol，2004，31（6）：1 083-1 087.

［11］Sugano N，Kubo T，Takaoka K，et al.Diagnostic criteria for non-traumatic osteonecrosis of the femoral head A multi-centre study［J］.J Bone Joint Surg Br，1999，81（4）：590-595.

［12］Smith E，Redman RA，Logg CR，et al.Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle.Dissociation of cyclin A-cyclin-dependent kinase 2 from E2F4-p130 complexes［J］.J Biol Chem，2000，275（26）：19 992-20 001.

［13］Calder JD，Buttery L，Revell PA.Apoptosis-a significant cause of bone cell death in osteonecrosis of the femoral head［J］.J Bone Joint Surg Br，2004，86（8）：1 209-1 213.

Comparison of 2 Rat Modelling Methods of Glucocorticoid-Induced Avascular Necrosis

Zhao Zhenguang1,2,Pan Shuyi1,2,Li Hang2
（1.Medical School of PLA,Beijing,China100853；2.Department of Hyperbaric Oxygen,The Navy General Hospital of PLA, Beijing,China100048）

ObjectiveTo compare the reliability and success rate of the different intraperitoneal injection of dexamethasone regimen in glucocorticoid-induced avascular necrosis in rats model，and provide the basic data for setting up rat models of steroid-induced avascular necrosis of femoral head.Methods30 male Wistar rats were randomly divided into group A（10）and group B（10），group C（10）.Group A was given dexamethasone sodium phosphate injection 20 mg/（kg·d），1 time/week for 8 weeks；group B was given dexamethasone sodium phosphate injection 10 mL/（kg·d），2 times/week for 8 weeks；group C was given 0.9%chloride 20 mL/（kg·d），1 time/week for 8 weeks.ResultsNo abnormalities were found in double hip X-ray examination of the three groups，but significant differences can be found on pathological section，the differences confirmed that building hormone osteonecrosis is successful and the degree of femoral head necrosis of Group B is more serious than group A.ConclusionBoth methods（intraperitoneal injection of dexamethasone，20 mg/（kg·d），1 time/week，for 8 weeks andintraperitoneal injection of dexamethasone，10 mL/（kg·d），2 times/ week，for 8 weeks）can successfully established early stage rat models of glucocorticoid-induced avascular，and the latter method is better than the previous one.

femoral head necrosis；glucocorticoid；dexamethasone；rat；animal experiment

R965；R332

A

1006-4931（2015）20-0016-03

趙振廣，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楦邏貉踽t(yī)學(xué)；潘樹義，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楦邏貉踽t(yī)學(xué)，本文通訊作者，（電子信箱）psy9992011@163.com。

2015-03-30）

*北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：7154241；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：13qnp075。