閆龍　來毅

（浙江省杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院，浙江杭州311200）

·研究報告·

痰熱清注射液對急性肺損傷大鼠的肺組織核因子-κB表達的影響*

閆龍來毅

（浙江省杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院，浙江杭州311200）

目的通過建立急性肺損傷（ALI）大鼠模型，研究痰熱清注射液對ALI治療作用及可能機制，為其臨床應(yīng)用于感染所致的ALI提供理論參考。方法將SD大鼠隨機分為正常對照組、模型2、4、6 h組、痰熱清2、4、6 h組，每組8只。尾靜脈注射脂多糖（LPS）造模，痰熱清組在造模后從另一尾靜脈注射痰熱清注射液1 mL。在相應(yīng)時間段取肺組織，觀察肺病理形態(tài)學(xué)、組織損傷程度，通過免疫組化檢測NF-κB p65的表達變化。結(jié)果（1）LPS模型組肺組織有明顯的形態(tài)、病理學(xué)改變；各時間段模型組NF-κB p65的陽性指數(shù)值較正常對照組升高（P＜0.01）。（2）痰熱清2 h組NF-κB p65陽性指數(shù)與模型2 h組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；痰熱清4 h與6 h組陽性指數(shù)值較同時間點模型組明顯降低（P＜0.01），且與正常對照組無明顯差異。結(jié)論痰熱清注射液對ALI大鼠有保護作用，可以減輕其組織形態(tài)學(xué)改變，通過抑制肺組織NF-κB信號傳導(dǎo)通路的活化，阻斷炎癥的級聯(lián)式反應(yīng)，從而減輕肺組織損傷，阻斷ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展。

痰熱清注射液急性肺損傷NF-κBp65

全身性感染、創(chuàng)傷、休克、燒傷、急性重癥胰腺炎等多種病因可引起急性肺損傷（ALI），其終末階段或危重型稱為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。以往的研究認為ALI的發(fā)病主要與機體過度的炎癥反應(yīng)有關(guān)，被致病因子激活后，炎癥細胞大量聚集在肺中，生成大量的炎癥介質(zhì)和細胞因子，反饋并放大和加強炎癥信號，最終導(dǎo)致肺泡上皮和肺毛細血管內(nèi)皮通透性增加，肺泡水腫，構(gòu)成低氧血癥的病理基礎(chǔ)。近年研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其參與了多種細胞因子及炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是炎性介質(zhì)的上游調(diào)控基因，在炎癥反應(yīng)的細胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起重要作用。由于ALI與炎癥反應(yīng)的關(guān)系密切，NF-κB在炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此NF-κB很可能在ALI中起著關(guān)鍵的作用［1］。同時被認為是極具潛力的新型抗炎靶點［2］。本研究中采用尾靜脈注射脂多糖（LPS）制備大鼠ALI模型，并用痰熱清注射液進行治療，觀察肺病理形態(tài)學(xué)、組織損傷程度及NF-κB p65的表達變化。

1　材料與方法

1.1動物SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±10）g，清潔動物，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，自由攝食、飲水、室溫18～24℃，相對濕度40%～70%，每日12 h光照維持，晝夜循環(huán)。

1.2試藥與儀器痰熱清注射液，上海凱寶藥業(yè)有限公司提供10 mL/支；脂多糖E.coli內(nèi)毒素；購自Sigma公司。

1.3分組與造模將大鼠隨機分為正常對照組、模型2 h組、模型4 h組、模型6 h組、痰熱清2 h組、痰熱清4 h組、痰熱清6 h組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后。正常對照組1組，尾靜脈注射生理鹽水1 mL。模型組及痰熱清組予尾靜脈注射LPS注射液5 mg/kg造模。痰熱清組造模后予另一尾靜脈注射痰熱清注射液1 mL（按人和動物體表面積折算的等效劑量比值）。

1.4標本采集與檢測動物分別在2、4、6 h予水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后開胸。觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，后以10%甲醛溶液固定，行免疫組織化學(xué)染色后觀察NF-κB p65的表達差異。HE染色切片在顯微鏡放大400倍下直接觀察組織病理變化。免疫組化切片每張切片所要分析的部位顯微鏡下拍攝3～5張照片，采用圖像分析軟件：Carl Zeiss Imaging Systems進行分析。計算Area實際面積，平均光密度（Density）為陽性表達區(qū)域的光密度平均值，反映表達部位的陽性強度?？偣饷芏龋↖OD）=∑Area（陽性表達部位）×Density（該部位的平均光密度），IOD表示照片內(nèi)所有陽性表達部位的Area×Density的和。陽性指數(shù)：即IOD/肺泡實質(zhì)面積（μm2），用DAB顯色的免疫組化切片陽性區(qū)域為棕黃色，陽性指數(shù)表示總光密度均分到該照片的值，以此對NF-κB p65蛋白表達進行定量分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，均進行正態(tài)性檢驗，多樣本均數(shù)比較進行方差齊性分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1組織病理學(xué)改變正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡內(nèi)無水腫、炎癥，肺泡腔清晰。模型各組不同程度肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺內(nèi)單核巨噬細胞侵潤及肺泡腔內(nèi)紅細胞明顯增多，呈時間依賴性。痰熱清各組肺泡組織結(jié)構(gòu)較完整，輕度水腫，雖有不同程度的單核巨噬細胞浸潤，紅細胞漏出，但損傷程度相比同時間段模型組病變減輕。見圖1。

2.2肺組織NF-κB p65蛋白表達肺組織免疫組織化學(xué)NF-κB p65蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色。正常對照組可見少量散在的NF-κB p65陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物，主要位于胞漿中，組織結(jié)構(gòu)尚清晰。模型各組可見較多NF-κB p65陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物，主要位于細胞核中。痰熱清各組陽性表達率較模型組同時間點明顯減輕。見圖1。

圖1　各組肺組織免疫組化切片（DAB顯色，400倍）

模型各組NF-κB p65的陽性指數(shù)值較正常對照組升高（P＜0.01）。痰熱清2 h組NF-κB p65陽性指數(shù)較模型2 h組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；痰熱清4 h與6 h組陽性指數(shù)值較相應(yīng)時間點模型組明顯降低（P＜0.01），與正常對照組無明顯差異。見表1。

3　討論

ALI的發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，目前多從炎性細胞和細胞因子、氧化抗氧化系統(tǒng)失衡、凝血纖溶系統(tǒng)失衡及肺泡毛細血管膜損害這幾方面進行闡述，目前尚未完全明了。注射LPS不僅可成功復(fù)制ALI模型，而且可以很好地模擬臨床嚴重感染引發(fā)的ALI/ARDS［3］。NF-κB是調(diào)節(jié)細胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，活化后的NF-κB在機體的炎癥、免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮直接重要作用，與內(nèi)毒素型ALI的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系。近年國內(nèi)多項研究結(jié)果表明，中醫(yī)藥可通過調(diào)控NF-κB的活化，抑制炎癥因子的趨化、表達等，較好干預(yù)多種疾病的臨床治療。本文通過大鼠尾靜脈注射LPS誘導(dǎo)ALI，再予尾靜脈注射痰熱清注射液進行治療，探討痰熱清注射液對ALI大鼠的保護作用及可能的機制。

表1　各組肺組織NF-κB p65陽性指數(shù)比較（±s）

表1　各組肺組織NF-κB p65陽性指數(shù)比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與同時間段模型組比較，△P＜0.01。

組別n正常對照組8模型2 h組8模型4 h組8陽性指數(shù)（×10-2）2.23±0.25 5.35±0.36*8.53±0.67*模型6 h組85.27±0.03*痰熱清2 h組86.84±0.57*痰熱清4 h組83.49±0.29△痰熱清6 h組82.58±0.69△

肺損傷的作用機制中，眾多細胞因子錯綜復(fù)雜，而NF-κB、AP-1的活化、激活起到了關(guān)鍵作用。NF-κB典型的結(jié)構(gòu)為p50/p65異源二聚體，幾乎存在于所有真核細胞。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的三聚體形式存在于細胞漿。當細胞受到多種細胞內(nèi)外信號刺激時，IκB發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB與IκB發(fā)生解離并活化，活化的NF-κB迅速從細胞漿移位到細胞核，并與相應(yīng)基因上的κB位點相結(jié)合而發(fā)揮作用。研究表明，許多因素包括前炎性細胞因子（如TNF-α，IL-1β）、內(nèi)毒素、氧自由基（ROS）、病毒等可以激活NF-κB［4］。而NF-κB被激活后又參與諸多因子如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、氮自由基（NOS）及生長因子、黏附分子等的誘導(dǎo)性調(diào)控轉(zhuǎn)錄表達過程［5］。也就是說致病因素激活NF-κB后，引起ROS，炎癥因子等釋放，ROS及炎癥因子又可以正反饋激活NF-κB、造成炎癥級聯(lián)放大，加重肺損傷。因此，NF-κB的轉(zhuǎn)移并活化是全身炎癥反應(yīng)和急性肺損傷的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)之一［4］。有研究護津方可通過降低內(nèi)毒素致急性肺損傷大鼠的NF-κB蛋白及NF-κB mRNA的表達，而對大鼠起到保護作用［6］。同樣有類似研究證實抗炎合劑聯(lián)合西醫(yī)治療能夠明顯減低膿毒癥患者NF-κB水平［7］。總之各種炎癥介質(zhì)、氧化因子及血管通透性障礙、肺組織細胞損傷之間相互誘生、激活并正反饋性不斷增加最終導(dǎo)致全身損害，導(dǎo)致MODS。因此，ALI/ARDS不是孤立的疾病，而是MODS的重要組成部分。在本組資料中研究結(jié)果顯示LPS模型各組可見大量NF-κB p65陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物，主要位于細胞核中，并且各時間點NF-κB p65的陽性指數(shù)值也較正常組升高（P＜0.01）。提示LPS大鼠尾靜脈注射可造成大量的NF-κB的活化、激活，從胞漿轉(zhuǎn)移入細胞核，參與ALI的發(fā)生、發(fā)展。

中醫(yī)并無“急性肺損傷”這一病名的記載。根據(jù)臨床表現(xiàn)，一般認為多歸屬于“喘證”、“暴喘”、“喘脫”等范疇。痰、熱、瘀、閉是ALI/ARDS的主要病理因素，在臨床上ALI/ARDS根據(jù)病程?？煞痔禑巅辗?、氣滯血瘀、肺熱腑實、邪熱閉竅、肺腎氣虛等證候。中醫(yī)藥應(yīng)該對ALI/ARDS的治療從整體出發(fā)，辨證論治：早期多以標實為主，宜急去其實，可給予清熱化痰、活血化瘀、通腑瀉下等；晚期若標證緩解，可兼顧其虛則予益氣扶正。本資料通過LPS尾靜脈誘導(dǎo)大鼠ALI，導(dǎo)致大鼠30 min即出現(xiàn)萎靡，紫紺，呼吸困難進行性加重，甚或鼻翼煽動，腹瀉，甚至死亡。

痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹組成，具有平肝息風(fēng)、清熱解毒、宣肺解表等作用。黃芩的主要有效成分漢黃芩素有抑制炎癥的作用，其抗炎效用與前列腺素E2水平呈正相關(guān)［8］。熊膽凍干粉針劑可輕度提高內(nèi)毒素休克大鼠血漿IL-10水平，減輕內(nèi)皮細胞損傷，發(fā)揮抗炎和免疫防御的作用［9］。金銀花其主要有效成分綠原酸能抑制脂多糖增加肺中髓過氧化物酶（MPO）活性和中性粒細胞向BALF遷移；減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織的水腫、出血、血管和肺泡的結(jié)構(gòu)破壞［10］。連翹的有效成分連翹苷（木脂素）能抑制花生四烯酸級聯(lián)酶激活等而發(fā)揮抗炎作用［11］?，F(xiàn)代藥理研究亦證實痰熱清注射液可明顯抑制采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備的膿毒癥大鼠的NF-κB活性及IL-6水平，提高膿毒癥大鼠的生存率［12］。本實驗結(jié)果證實了，痰熱清注射液治療急性肺損傷的機理可能與抑制肺組織NF-κB信號傳導(dǎo)通路的活化，阻斷炎癥的級聯(lián)式反應(yīng)，從而減輕肺組織損傷，阻斷ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

［1］羅真春，黃燕.核轉(zhuǎn)錄因子-κB在急性肺損傷小鼠中的動態(tài)表達［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2009，38（16）：2005.

［2］Lee JQ，Matthew RJ，Benjamin TS，et al.Functions and regulation of NF-kappa B Rela during pneumococcal pneumonia［J］.The Journal of Immunology，2007，178：1896-1903.

［3］侯一峰，周艷春，周永雙.全身炎性反應(yīng)綜合征-急性肺損傷大鼠模型的研究［J］.中國實驗動物學(xué)報，2003，11（3）：147-150.

［4］Victor VM，Rocha M，Dela Fuente M.Immune cells：free radicals and antioxidants in sepsis［J］.Int Immunopharmacol，2004，4：327-347.

［5］Altavilla D，Saitta A，Squadrito G，et al.Evidence for a role of nuclear factor-kappa B in acute hypovolemic hemorrhagic shock［J］.Surgery，2002，131：50-258.

［6］楊愛東，李文雯，汪東穎，等.護津方對急性肺損傷大鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB mRNA表達的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2009，10（18）：1645-1647.

［7］李越華，李海濤.抗炎合劑對膿毒癥患者核因子NF-κB及炎癥因子的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2012，5（21）：692-693.

［8］Kaneko T，Chiba H，Horie N，et al.Inhibition of prostaglandin-e2 production by flavone and its related compounds［J］.In Vivo，2010，24（1）：55-58.

［9］金京春，樸英實，馬天澤，等.熊膽凍干粉針劑對內(nèi)毒素休克大鼠血漿NOx及IL-10水平的影響［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，26（1）：37-38.

［10］Zhang X，Huang H，Yang T，et al.Chlorogenic acid protects mice against lipopolysaccharide-induced acute lung injury［J］.Injury，2010，12：52-54.

［11］Díaz Lanza AM，Abad Martínez MJ，F(xiàn)ernández Matellano L，et al.Lignan and phenylpropanoid glycosides from Phillyrea latifolia and their in vitro anti-inflammatory activity［J］.Planta Med，2001，67（3）：219-223.

［12］劉德紅，鄧哲，魏剛，等.痰熱清注射液對膿毒癥大鼠核因子-κB活性及生存率的影響［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2008，13（24）：2208-2210.

Effects of Tanreqing Injection on NF-κB of Acute Lung Injury Induced by Endotoxin in Rats Lung Tissue

YAN Long，LAI Yi.The First People Hospital of Xiaoshan District，Hangzhou City，Zhejiang Province，Zhejiang，Hangzhou 311200，China

Objective：To investigate the infects and mechanisms of Tanreqing Injection on lipopolysaccharide（LPS）-induced acute lung injury（ALI）in rats.Methods：56 SD rats were randomly divided into 7 groups：normal control group，LPS model of 2 h，4 h，6 h group and Tanreqing Injection treatment of 2 h，4 h，6 h group. LPS was injected into tail vein in LPS model group and Tanreqing Injection treatment group.1 mL Tanreqing Injection was injected into another tain veil in Tanreqing Injection treatment group.The rats were killed at each observation time point.The pathological changes of lung were observed，and the expression of NF-κB P65 in lung tissue were detected with immunohistochemisty.Results：Compared with the control group，the pathological changes of lung in LPS model group were significant.Compared with the control group，the expression of NF-κB P65 in lung tissue was significantly up-regulated in LPS model group.Compared with LPS model group，the expression of NF-κB p65 in lung tissue in Tanreqing Injection treatment group were significantly downregulatedat 4 h and 6 h（P＜0.01）.Conclusion：Tanreqing Injection shows a protective effect on LPS-induced acute lung injury rats.The mechanism may be related to its ability of inhibiting the activation of the signal pathway of NF-κB and inflammatory cascade

Tanreqing Injection；Acute lung injury；NF-κB；p65

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0038-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.013

2014-03-12）

浙江省中醫(yī)藥普通課題研究計劃（2009CA021）