李文莉，繆冶煉，陳介余，花衛(wèi)俊，邵慧麗，許 琳

（1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.日本秋田縣立大學(xué) 生物資源學(xué)部，秋田010-0195，日本；3.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

木質(zhì)素降解物對釀酒酵母的毒性

李文莉1，繆冶煉1，陳介余2，花衛(wèi)俊1，邵慧麗1，許 琳3

（1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.日本秋田縣立大學(xué) 生物資源學(xué)部，秋田010-0195，日本；3.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

木質(zhì)素降解物是影響木質(zhì)纖維素水解液乙醇發(fā)酵效率的主要原因之一。為探明木質(zhì)素降解物對釀酒酵母的毒性，通過釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.1429的液體培養(yǎng)，測定木質(zhì)素制劑及酚類化合物（香草醛、紫丁香醇和對羥基苯甲醛）對細(xì)胞的毒性，同時分析酚類化合物的聯(lián)合作用類型，最后以果糖-1，6-二磷酸（FDP）為指標(biāo)來分析木質(zhì)素制劑及酚類化合物酵母細(xì)胞膜通透性的變化。結(jié)果表明：木質(zhì)素制劑、紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的半致死質(zhì)量濃度分別為10.96、5.37、6.17和7.08 g/L。隨著各酚類化合物濃度和種類的增加，它們對細(xì)胞的毒性隨之增加，呈正協(xié)同作用。在培養(yǎng)液中，F(xiàn)DP濃度隨各酚類化合物濃度的增加呈線性增加，當(dāng)各酚類化合物的質(zhì)量濃度從1.58 g/L增加到10.00 g/L時，F(xiàn)DP質(zhì)量濃度從49.7 mg/L增加到134.4 mg/L。木質(zhì)素降解物對釀酒酵母的毒性作用與細(xì)胞膜通透性的改變密切相關(guān)。

生物乙醇；木質(zhì)素；釀酒酵母；毒性；果糖-1，6-二磷酸（FDP）

農(nóng)業(yè)秸稈、廢棄木材等木質(zhì)纖維素材料來源廣泛、成本低廉、可以再生，因此，以木質(zhì)纖維素材料為原料的生物乙醇生產(chǎn)技術(shù)具有巨大的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展?jié)摿Γ?］。

以木質(zhì)纖維素材料為原料的生物乙醇生產(chǎn)過程一般包括原料預(yù)處理、酶解、乙醇發(fā)酵和乙醇精制等主要步驟［2］。在預(yù)處理以及酶解過程中，木質(zhì)素會降解成相對分子質(zhì)量不同的物質(zhì)，其一部分殘留在酶解液中。木質(zhì)素降解產(chǎn)物主要有阿魏酸、香草酸、對羥基苯甲醛及香草醛等酚類化合物［3］。當(dāng)發(fā)酵液中各酚類化合物的質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，阿魏酸對假絲酵母（C.beijerinckii）BA10的致死率為70%，香草酸為64%，對羥基苯甲醛為66%，香草醛為22%。當(dāng)阿魏酸的質(zhì)量濃度為0.3 g/L時，假絲酵母（C.beijerinckii）BA10發(fā)酵過程中只產(chǎn)生很少量的丙酮丁醇乙醇（ABE），甚至不產(chǎn)生ABE［4］。由此可知，酚類化合物對微生物的毒性是影響木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵的主要原因之一［3-6］。去除木質(zhì)素降解物毒性的方法有2種：一是對木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行脫毒處理，二是培育木質(zhì)素耐受性菌株。酚類化合物對微生物，特別是對釀酒酵母的毒性大小及其作用機(jī)制目前尚不清楚。

木質(zhì)素是由愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)、紫丁香基結(jié)構(gòu)和對羥苯基結(jié)構(gòu)等3種單體組成的［7］。在木質(zhì)纖維素預(yù)處理及酶解過程中，木質(zhì)素會分解成由3種單體組成、相對分子質(zhì)量不同的化合物。因為香草醛、紫丁香醇、對羥基苯甲醛分別與3種木質(zhì)素組成單體的結(jié)構(gòu)相類似，所以本研究中筆者選用紫丁香醇、對羥基苯甲醛及香草醛作為模型酚類化合物來研究木質(zhì)素降解物對酵母細(xì)胞的毒性。圖1為紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的結(jié)構(gòu)。

圖1 紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的結(jié)構(gòu)示意Fig.1 Molecular structure diagram of lilac alcohol，p-hydroxy benzaldehyde and vanilla aldehyde

本文旨在探明木質(zhì)素降解物對釀酒酵母的毒性及作用機(jī)制，為開發(fā)木質(zhì)素脫毒技術(shù)以及培育木質(zhì)素耐受酵母提供理論和技術(shù)依據(jù)。通過釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.1429的液體培養(yǎng)，測定木質(zhì)素制劑及酚類化合物（香草醛、紫丁香醇、對羥基苯甲醛）的毒性，分析酚類化合物的聯(lián)合作用類型。然后在此基礎(chǔ)上，討論酵母細(xì)胞膜通透性的變化。

1 材料與方法

1.1 菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.1429購自中國普通微生物保藏中心。菌種的活化方法：用無菌水溶解凍干菌種制成菌懸液，接種至平板活化培養(yǎng)基（葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH），在30℃、180 r/min下培養(yǎng)12 h。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06；pH 4.8。

1.3 木質(zhì)素制劑及酚類化合物

木質(zhì)素制劑，日本關(guān)東化學(xué)株式會社；對羥基苯甲醛（純度＞98%）、香草醛（純度＞98%），阿拉丁化學(xué)有限公司；紫丁香醇（純度＞98%），東京化成工業(yè)株式會社。

1.4 試劑與儀器

醋酸鋇（純度＞99%），上海泗聯(lián)化工有限公司；間苯二酚（純度＞99.5%）、硫脲（純度＞99%）、冰醋酸（純度＞99.5%）、FDP（純度＞99.5%），阿拉丁化學(xué)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

752S型紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；BMX-30R型高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-D型恒溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠；DLL.203XP型透射式偏光顯微鏡，南京市東利來光電有限責(zé)任公司；TGL-18C-C型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.5 木質(zhì)素制劑及酚類化合物的毒性測定

1.5.1 木質(zhì)素制劑及單一酚類化合物的毒性測定

將活化后的菌株接入100 mL培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)20 h至細(xì)胞生長穩(wěn)定期。取0.1 mL的培養(yǎng)液，稀釋40倍，用血球計數(shù)板測定培養(yǎng)液中的活菌數(shù)A。然后，分別加入一定濃度的木質(zhì)素制劑、紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定活菌數(shù)A*。按照式（1）計算細(xì)胞死亡率D。

木質(zhì)素制劑、紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的質(zhì)量濃度按照對數(shù)間距設(shè)定為 100.2、100.4、100.6、100.8、101.0和101.1g/L。每個濃度設(shè)置2個平行組，每個樣品測定3次，取平均值。在本實驗的濃度范圍內(nèi)，木質(zhì)素制劑、紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛都是可溶的。

1.5.2 混合酚類化合物的毒性測定

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，按照等質(zhì)量濃度比配將紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛制成三組二元混合物和一組三元混合物，溶解在培養(yǎng)基中。各成分的質(zhì)量濃度設(shè)定為 100.1、100.2、100.4、100.6和 100.8g/L。每個濃度設(shè)置2個平行組，每個樣品測定3次，取平均值。

1.6 培養(yǎng)液中果糖-1，6-二磷酸（FDP）的測定

培養(yǎng)液中果糖-1，6-二磷酸（FDP）濃度采用間苯二酚法［8］測定。按照混合酚類化合物毒性測定方法培養(yǎng)酵母細(xì)胞。

2 結(jié)果與討論

2.1 木質(zhì)素制劑的毒性

通過凝膠滲透色譜法測定得知：該木質(zhì)素制劑的相對分子質(zhì)量分布為350～34 000，相對分子質(zhì)量5 000的累積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.3%［9］。木質(zhì)素制劑中的小分子為單一酚類化合物，如阿魏酸、對香豆酸［4］、香草醛［10］、對羥基苯甲醛、丁香醛（3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸）和紫丁香醇［11］等。木質(zhì)素制劑中的大分子為這些酚類化合物的聚合物。

圖2表示細(xì)胞死亡率隨培養(yǎng)液中木質(zhì)素制劑濃度的變化。細(xì)胞死亡率（D）隨木質(zhì)素制劑濃度的增加呈線性增加，其回歸方程式見式（2）。

式中：ρL為木質(zhì)素制劑質(zhì)量濃度，g/L。

當(dāng)木質(zhì)素制劑質(zhì)量濃度從1.58 g/L增加到12.59 g/L時，細(xì)胞死亡率從7.8%上升到53.2%。從回歸方程式（2）可知，當(dāng)細(xì)胞死亡率為50%時，lg［ρL/（g·L-1）］=1.04，即木質(zhì)素制劑的半致死質(zhì)量濃度（LC50）為10.96 g/L。由此可知，木質(zhì)素降解物對酵母細(xì)胞的毒性作用是多種單一酚類化合物及其聚合物共同作用的結(jié)果。

圖2 細(xì)胞死亡率隨培養(yǎng)液中木質(zhì)素制劑質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Change of cell death rate with the mass concentration of lignin preparation in culture medium

2.2 單一酚類化合物的毒性

圖3為細(xì)胞死亡率隨培養(yǎng)液中紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛濃度的變化。圖3中培養(yǎng)液僅僅含有單一酚類化合物。細(xì)胞死亡率隨培養(yǎng)液中紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛濃度的增加呈線性增加，其回歸方程式分別如下見式（3）～式（5）。

式中：DLA、DHB和DVA分別表示培養(yǎng)液中紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛對應(yīng)的細(xì)胞死亡率；ρLA、ρHB和ρVA分別為紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的質(zhì)量濃度，g/L。

圖3 細(xì)胞死亡率隨培養(yǎng)液中紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛質(zhì)量濃度的變化Fig.3 Changes of cell death rate with the mass concentration of lilac alcohol，p-hydroxy benzaldehyde and vanilla aldehyde in culture medium

當(dāng)紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛質(zhì)量濃度從1.58 g/L增加到10.00 g/L時，紫丁香醇使得細(xì)胞的死亡率從13.8%上升到68.8%，對羥基苯甲醛使得細(xì)胞的死亡率從7.2%上升到65.2%，香草醛使得細(xì)胞的死亡率從7.4%上升到59.9%。此外，從回歸方程式（3）～（5）可知，當(dāng)細(xì)胞死亡率 D= 50%時，lg ρLA=0.73，lg ρHB=0.79，lg ρVA=0.85，即紫丁香醇、對羥基苯甲醛、香草醛的半致死質(zhì)量濃度（LC50）分別為5.37、6.17和7.08 g/L。3種酚類化合物中，紫丁香醇對酵母的毒性最大，對羥基苯甲醛次之，香草醛最弱。

決定酚類化合物毒性的主要因素有2個。首先，酚類化合物對酵母細(xì)胞的毒性與其自身的疏水性密切相關(guān)［12-13］。酚類化合物的疏水基團(tuán)與細(xì)胞膜的疏水成分相互作用，從而改變了細(xì)胞膜中各成分比例，破壞細(xì)胞膜的完整性，這是其對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的主要原因。另外，酵母細(xì)胞自身對酚類化合物的分解作用也是決定其毒性大小的重要因素。在一定的濃度范圍內(nèi)，酵母細(xì)胞可以將酚類化合物分解為毒性較弱酸或醇［14-15］。有些酵母細(xì)胞中還含有芳香酸脫羧酶（PAD），它可以將對香豆酸、肉桂酸、阿魏酸等酚類化合物分解，從而降低它們的毒性［16］。

由于醛基是親水性基團(tuán)，因此不含醛基的酚類化合物的疏水性比含醛基的酚類化合物的疏水性強(qiáng)［17］。疏水性較強(qiáng)的酚類化合物更容易與酵母細(xì)胞膜結(jié)合，并與細(xì)胞膜上的疏水性成分相互作用，從而更大程度上破壞細(xì)胞膜的完整性。香草醛和對羥基苯甲醛的分子結(jié)構(gòu)中都有醛基連接在苯環(huán)上，而紫丁香醇的苯環(huán)結(jié)構(gòu)上沒有醛基，也就是說在3種酚類化合物中，紫丁香醇的疏水性最強(qiáng)，毒性也最大。這與實驗值相一致。

另外，與香草醛相比，對羥基苯甲醛毒性較大的原因可能是由于酵母細(xì)胞分解香草醛的能力較強(qiáng)，而分解對羥基苯甲醛的能力較弱。將一定濃度的香草醛、對羥基苯甲醛加入到含有假絲酵母C.athensensis SB18的液體培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min下培養(yǎng)48 h，定時取樣來測定培養(yǎng)液中香草醛、對羥基苯甲醛的殘留量。當(dāng)香草醛、對羥基苯甲醛的初始質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，連續(xù)培養(yǎng)39 h后，對羥基苯甲醛和香草醛幾乎完全被假絲酵母分解掉，但是酵母細(xì)胞分解對羥基苯甲醛的速度小于分解香草醛的速度［18］。因此，在相同時間內(nèi)，對羥基苯甲醛首先在細(xì)胞內(nèi)部積累，并且積累量大于香草醛，從而使得對羥基苯甲醛對酵母細(xì)胞的毒性大于香草醛。

2.3 混合酚類化合物的聯(lián)合作用

圖4表示培養(yǎng)液含有二元酚類化合物時細(xì)胞死亡率隨各酚類化合物濃度的變化。圖5表示培養(yǎng)液含有三元酚類化合物時細(xì)胞死亡率隨各酚類化合物濃度的變化。細(xì)胞死亡率隨各酚類化合物濃度的增加呈線性增加，其回歸方程式見式（6）～式（9）。

式中：DLH表示含有紫丁香醇和對羥基苯甲醛的培養(yǎng)液對應(yīng)的細(xì)胞死亡率；ρLH表示含有紫丁香醇和對羥基苯甲醛的培養(yǎng)液中各酚類化合物的質(zhì)量濃度，g/L；DLV表示含有紫丁香醇和香草醛的培養(yǎng)液對應(yīng)的細(xì)胞死亡率；ρLV表示含有紫丁香醇和香草醛的培養(yǎng)液中各酚類化合物的質(zhì)量濃度，g/L；DHV表示含有對羥基苯甲醛和香草醛的培養(yǎng)液對應(yīng)的細(xì)胞死亡率；ρHV表示含有對羥基苯甲醛和香草醛的培養(yǎng)液中各酚類化合物的質(zhì)量濃度，g/L；DLHV表示含有紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的培養(yǎng)液對應(yīng)的細(xì)胞死亡率；ρLHV表示含有紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的培養(yǎng)液中各酚類化合物的質(zhì)量濃度，g/L。

圖4 培養(yǎng)液含有二元酚類化合物時細(xì)胞死亡率隨各酚類化合物質(zhì)量濃度的變化Fig.4 Change of cell death rate with the mass concentration of each phenolic compound when the culture medium contains two phenolic compounds

圖5 培養(yǎng)液含有三元酚類化合物時細(xì)胞死亡率隨各酚類化合物質(zhì)量濃度的變化Fig.5 Change of cell death rate with the mass concentration of each phenolic compound when the culture medium contains three phenolic compounds

各酚類化合物質(zhì)量濃度從1.00 g/L增加到6.31 g/L時，含有紫丁香醇和對羥基苯甲醛的培養(yǎng)液中，細(xì)胞死亡率從35.3%上升到88.7%，含有紫丁香醇和香草醛、對羥基苯甲醛和香草醛的培養(yǎng)液中，細(xì)胞死亡率分別從 31.1%、26.7%上升到84.2%、75.9%；含有三元混合物的培養(yǎng)液中，細(xì)胞死亡率從 45.1%上升到 100%。從回歸方程式（6）～（9）可知，細(xì)胞死亡率為50%時，lg ρLH=0.29， lg ρLV=0.35，lg ρHV=0.43，lg ρLHV=0.16，含有紫丁香醇和對羥基苯甲醛、紫丁香醇和香草醛、對羥基苯甲醛和香草醛的培養(yǎng)液中，各酚類化合物的半致死質(zhì)量濃度（LC50）分別為1.95、2.24和2.69 g/L；含有三元混合物的培養(yǎng)液中，各酚類化合物的半致死質(zhì)量濃度（LC50）為1.44 g/L。

培養(yǎng)液中酚類化合物的聯(lián)合作用類型采用相加指數(shù)法（addition index，AI）進(jìn)行判別［19-20］

式中：Am、Bm和Cm分別表示培養(yǎng)液中各酚類化合物聯(lián)合作用時的LC50（等濃度配比時，Am=Bm=Cm）；Ai、Bi和Ci分別表示不同酚類化合物單獨作用時的LC50；S表示毒性相加作用。

由S來求相加指數(shù)AI：當(dāng)S≥1時，AI=-S+1；當(dāng)S＜1時，AI=1/S-1。

根據(jù)AI的值來判別混合酚類化合物的作用類型：AI＞0時，聯(lián)合作用的類型為協(xié)同作用；AI=0時，為簡單相加作用；AI＜0時，為拮抗作用。

表1表示培養(yǎng)液中酚類化合物的聯(lián)合作用類型。紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛單獨作用時的半致死質(zhì)量濃度分別為5.37、6.17和7.08 g/L；含有紫丁香醇和對羥基苯甲醛、紫丁香醇和香草醛、對羥基苯甲醛和香草醛組的培養(yǎng)液中各酚類化合物的半致死質(zhì)量濃度分別為1.95、2.24和2.69 g/L；含有紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的培養(yǎng)液中各酚類化合物的半致死質(zhì)量濃度為1.44 g/L。半致死濃度越小，表示該酚類化合物的毒性越大。由此可知，各酚類化合物在聯(lián)合作用時的毒性比在單獨作用時要大得多。含有紫丁香醇與對羥基苯甲醛、紫丁香醇與香草醛、對羥基苯甲醛與香草醛的培養(yǎng)液AI值分別為0.47、0.37和0.22，由上述判定方法可知，其聯(lián)合毒性的作用類型均為協(xié)同作用。此外，含有紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的培養(yǎng)液AI值為0.43，其聯(lián)合作用類型也是協(xié)同作用。目前，關(guān)于酚類化合物毒性的研究大都只分析了其單獨作用時的毒性，本文中筆者對培養(yǎng)液中混合酚類化合物聯(lián)合毒性類型進(jìn)行了判別，為開發(fā)木質(zhì)纖維素水解液的高效脫毒技術(shù)和木質(zhì)素耐受菌株的誘變與篩選提供了依據(jù)。

表1 培養(yǎng)液中酚類化合物的聯(lián)合作用類型Table 1 Combined effect of phenolic compounds in culture medium

2.4 木質(zhì)素降解物對酵母的毒性作用機(jī)制

圖6表示細(xì)胞死亡率、培養(yǎng)液中胞內(nèi)果糖-1，6-二磷酸（FDP）濃度隨各酚類化合物濃度的變化。在含有紫丁香醇、對羥基苯甲醛、香草醛的培養(yǎng)液中，當(dāng)各酚類化合物的質(zhì)量濃度在1.58～6.31 g/L時，細(xì)胞死亡率和培養(yǎng)液中FDP濃度均隨其濃度呈線性增加。當(dāng)各酚類化合物的質(zhì)量濃度為1.58 g/L時，細(xì)胞死亡率、FDP的質(zhì)量濃度分別為52.7%和49.7 mg/L；當(dāng)各酚類化合物質(zhì)量濃度為6.31 g/L時，細(xì)胞死亡率達(dá)到100%，F(xiàn)DP的質(zhì)量濃度增加到112.2 mg/L。此外，當(dāng)各酚類化合物的質(zhì)量濃度從6.31 g/L增加到10.00 g/L時，細(xì)胞死亡率維持在100%，而FDP的質(zhì)量濃度從112.2 mg/L進(jìn)一步增加到了134.4 mg/L。

圖6 細(xì)胞死亡率和培養(yǎng)液中FDP質(zhì)量濃度隨各酚類化合物質(zhì)量濃度的變化Fig.6 Changes of cell death rate and FDP concentration in culture medium with the logarithmic concentration of each phenolic compound

細(xì)胞死亡的原因有2種。一是細(xì)胞壞死，它是指細(xì)胞受到環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程。二是細(xì)胞凋亡，即細(xì)胞發(fā)生主動的、由基因控制的自我消亡過程。細(xì)胞死亡伴隨著細(xì)胞膜通透性改變、代謝停止、結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失等不可逆性變化。本研究中酵母細(xì)胞的液體培養(yǎng)時間為44 h，酵母細(xì)胞生長處于穩(wěn)定期，并且針對含有毒性成分的培養(yǎng)液設(shè)定了對照組，避免了細(xì)胞凋亡，因此可以認(rèn)為細(xì)胞死亡是由于木質(zhì)素降解物對細(xì)胞的毒性作用而導(dǎo)致的。

正常的酵母細(xì)胞中，果糖-1，6-二磷酸（FDP）不斷參與代謝反應(yīng)，并且由于細(xì)胞膜的選擇透過性，F(xiàn)DP不能滲透到細(xì)胞外。然而，當(dāng)細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，或者細(xì)胞膜被破壞時，F(xiàn)DP會流到細(xì)胞外，從而使得培養(yǎng)液中FDP的濃度升高［21］。盧群等［22］在研究超聲波對酵母細(xì)胞膜通透性的影響時，用FDP濃度的增加量來直觀反映細(xì)胞膜通透性的改變。實驗過程中利用不同強(qiáng)度的超聲波對發(fā)酵液進(jìn)行處理，測定細(xì)胞死亡率及FDP濃度的增加量。400、500和600 W超聲波處理225 s后，細(xì)胞死亡率分別為12%、15%和36%，F(xiàn)DP的濃度分別增加了30%、55%和120%。隨著酵母細(xì)胞死亡率的增加，培養(yǎng)液中FDP的濃度也逐漸增加，即細(xì)胞膜的通透性逐漸增大。本研究中，從圖6可以看出，培養(yǎng)液中FDP的濃度與細(xì)胞死亡率呈正相關(guān)。這表明，木質(zhì)素降解物對酵母細(xì)胞的毒性作用與細(xì)胞膜通透性的改變密切相關(guān)。

3 結(jié)論

通過釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，CGMCC 2.1429）的液體培養(yǎng)，測定了木質(zhì)素制劑及酚類化合物（香草醛、紫丁香醇和對羥基苯甲醛）對酵母細(xì)胞的毒性，分析了酚類化合物的聯(lián)合作用類型，討論了細(xì)胞膜通透性的改變。木質(zhì)素制劑、紫丁香醇、對羥基苯甲醛和香草醛的半致死質(zhì)量濃度分別為10.96、5.37、6.17和7.08 g/L。酚類化合物具有協(xié)同作用。培養(yǎng)液中，果糖-1，6-二磷酸（FDP）濃度隨酚類化合物濃度的增加呈線性增加。當(dāng)各酚類化合物的質(zhì)量濃度從1.58 g/L增加到10.00 g/L時，F(xiàn)DP質(zhì)量濃度從 49.7 mg/L增加到 134.4 mg/L。木質(zhì)素降解物對釀酒酵母的毒性作用與細(xì)胞膜通透性的改變密切相關(guān)。

［1］Cheng J J，Timilsina G R.Status and barriers of advanced biofuel technologies：a review［J］.Renew Energ，2011，36：3541-3549.

［2］Chen H Z，Qiu W H.Key technologies for bioethanol production from lignocellulose［J］.Biotechnol Adv，2010，28：552-556.

［3］Palmqvist E，Hahn-H?gerdal B.Fermentation of lignocellulosic hydrolysates：inhibition and detoxification［J］.Bioresour Technol，2000，74：17-24.

［4］Ezeji T，Qureshi N，Blaschek H P.Butanol production from agricultural residues：impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation［J］. Biotechnol Bioeng，2007，97：1460-1469.

［5］Qureshi N，Ezeji T C，Ebener J，et al.Butanol production by Clostridium beijerinckii.Part I：use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber［J］.Bioresour Technol，2008，99（13）：5915-5922.

［6］Zaldivar J，Martinez A，Ingram L O.Effect of selected aldehydes on the growth and fermentation of ethanologenic Escherichia coli［J］.Biotechnol Bioeng，1999，65：24-33.

［7］吳玉峰.木質(zhì)素及其衍生物負(fù)載型催化劑的制備及其對C-C偶聯(lián)反應(yīng)的催化性能研究［D］.鄭州：河南大學(xué)，2009.

［8］范貴增，熊戰(zhàn)，熊國珍，等.發(fā)酵液中1，6-二磷酸果糖含量的測定［J］.科學(xué)，1998，16（1）：21-25.

［9］黃洲，繆冶煉，陳介余，等.溶液中木質(zhì)素和葡萄糖的超濾分離［J］.生物加工過程，2014，12（2）：56-62.

［10］Cho D H，Lee Y J，Um Y，et al.Detoxification of model phenolic compounds in lignocellulosic hydrolysates with peroxidase for butanolproduction from Clostridium beijerinckii［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，83：1035-1043.

［11］潘進(jìn)權(quán)，劉耕.酸解纖維素酒精發(fā)酵的毒性問題［J］.生物技術(shù)，2002，12（1）：45-47.

［12］Beltrame P，Beltrame P L，Carniti P，et al.Inhibiting action of chlorophenols on biodegradation of phenol and its correlation with structural properties of inhibitors［J］.Biotechnol Bioeng，1988，31：821-828.

［13］Sierra-Alvarez R，Lettinga G.The effect of aromatic structure on the inhibition of acetoclastic methanogenesis in granular sludge［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1991，34：544-550.

［14］Tanaka M，Hirokane Y.Oxidation of aromatic aldehyde to aromatic carboxylic acid by Burkholderia cepacia TM1 isolated from humus［J］.Biosci Bioeng，2000，90：341-343.

［15］Cortez D V，Roberto I C.Individual and interaction effects of vanillin and syringaldehyde on the xylitol formation by Candida guilliermondii［J］.Biores Technol，2009，101：1858-1865.

［16］Almeida J R M，Modig T，Petersson A，et al.Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae［J］.Chem Technol Biotechnol，2007，82：340-349.

［17］楊潔，李炳志，李霞，等.酵母耐受抑制劑的解耦與功能模塊抽提研究進(jìn)展［J］.生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2012，4（7）：7-12.

［18］Zhang J，Geng A，Yao C，et al.Effects of lignin-derived phenolic compounds on xylitol production and key enzyme activities by a xylose utilizing yeast Candida athensensis SB18［J］.Bioresour Technol，2012，121：369-378.

［19］Marking L L.Method for assessing additive toxicity of chemical mixtures［J］.Aquatic Toxicol Hazard Eval，1977，634：99-105.

［20］修瑞琴，許永香，高世榮，等.砷與鎘、鋅離子對斑馬魚的聯(lián)合毒性實驗［J］.中國環(huán)境科學(xué)，1998，18（4）：349-352.

［21］王鏡巖，朱圣更，徐長法.生物化學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2002：63-65.

［22］盧群，劉曉艷，丘泰球，等.超聲對酵母細(xì)胞膜通透性的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（9）：14-17.

（責(zé)任編輯 管 珺）

Inhibition of lignin degradation products on Saccharomyces cerevisiae

LI Wenli1，MIAO Yelian1，CHEN Jieyu2，HUA Weijun1，SHAO Huili1，XU Lin3
（1.College of Food and Light Industrial Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；2.Faculty of Bioresource Science，Akita Prefectural University，Akita 010-0195，Japan；3.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

Lignin degradation products are main inhibitors that restrain the ethanol production by fermentation of lignocellulosic hydrolysate.The objective of the present study was to clarify the inhibition of lignin degradation products on Saccharomyces cerevisiae.The toxicity of lignin preparation and phenolic compounds such as vanilla aldehyde，lilac alcohol，and p-hydroxy benzaldehyde was measured by culturing Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.1429.Then，the change of cell membrane permeability was evaluated by the concentration of fructose-1，6-diphosphate（FDP）.Results show that the 50%lethal concentration（LC50）of lignin preparation，vanilla aldehyde，lilac alcohol，and p-hydroxy benzaldehyde was 10.96，5.37，6.17 and 7.08 g/L，respectively.All the phenolic compounds acted synergistically on yeast cells. Fructose-1，6-diphosphate（FDP）concentration in culture medium increased linearly with increasing logarithmic concentration of each phenolic compound.When the concentration of each phenolic compound increased from 1.58 g/L to 10.00 g/L，F(xiàn)DP concentration increased from 49.7 mg/L to 134.4 mg/L.The toxicity of lignin degradation products on Saccharomyces cerevisiae closely related to the change of cell membrane permeability.

ethanol；lignin；Saccharomyces cerevisiae；toxicity；fructose-1，6-diphosphate（FDP）

TQ352.78

A

1672-3678（2015）01-0082-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.014

2013-06-04

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CBA00807）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA022101）

李文莉（1988—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，研究方向：生物能源；繆冶煉（聯(lián)系人），教授，E-mail：ylmiao@njtech.edu.cn