文立　徐鳳州　何曉曉　王柯敏何定庚　卿太平　鄒振

摘 要 作為工具酶重要成員之一的核酸外切酶是一類無(wú)嚴(yán)格堿基序列依賴性的水解酶。近年來(lái)，通過(guò)利用核酸外切酶水解方式的差異性與納米技術(shù)、酶切循環(huán)效應(yīng)、核酸適配體技術(shù)、金屬離子穩(wěn)定的非沃森-克里克堿基配對(duì)系統(tǒng)、核酸熒光染料探針技術(shù)、電化學(xué)方法等相結(jié)合，發(fā)展了一系列核酸外切酶輔助的信號(hào)放大技術(shù)，對(duì)于提高生化分析檢測(cè)方法與技術(shù)的靈敏度起到了非常關(guān)鍵的作用，已廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、離子和小分子等物質(zhì)的高靈敏檢測(cè)。為了更好地理解和應(yīng)用核酸外切酶輔助的信號(hào)放大策略，本文對(duì)核酸外切酶發(fā)展的信號(hào)放大策略在生化分析中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 分析檢測(cè)；工具酶；信號(hào)放大；核酸外切酶；評(píng)述

1 引 言

快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)生化樣品中的離子、分子、核酸、蛋白等對(duì)疾病的預(yù)防診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品監(jiān)控等具有十分重要的意義。通常，實(shí)際生化分析樣品中僅存在痕量靶物質(zhì)，因此高靈敏度和高準(zhǔn)確性一直是分析檢測(cè)方法的改進(jìn)目標(biāo)。針對(duì)這一需求，除了直接發(fā)展高靈敏的方法外，放大檢測(cè)法能降低分析方法或傳感器的設(shè)計(jì)難度以及對(duì)專業(yè)大型儀器的依賴。根據(jù)放大的對(duì)象，放大檢測(cè)法可以簡(jiǎn)單分為三類：靶標(biāo)放大策略、探針?lè)糯蟛呗院托盘?hào)放大策略[1]。靶標(biāo)放大策略通常是通過(guò)一定的手段特異性復(fù)制靶標(biāo)，使其達(dá)到常規(guī)方法可以檢測(cè)的水平。如經(jīng)典的靶標(biāo)放大策略——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）可以實(shí)現(xiàn)108～109倍的靶標(biāo)放大[2]；探針?lè)糯蟛呗裕袠?biāo)的量不變，探針序列被不斷放大，如滾環(huán)放大技術(shù)（Rolling circle amplification， RCA），它可以實(shí)現(xiàn)103～104倍左右的信號(hào)增強(qiáng)[3]。

相對(duì)于靶標(biāo)放大策略和探針?lè)糯蟛呗?，信?hào)放大策略有更多的可選性，如近年來(lái)發(fā)展的通過(guò)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、工具酶、酶聯(lián)催化反應(yīng)、納米材料等生物及化學(xué)方法放大分析與傳感器界面的響應(yīng)信號(hào)，可特異性地提高檢測(cè)信號(hào)，降低背景及噪音信號(hào)，對(duì)于提高生化分析檢測(cè)方法與技術(shù)的靈敏度起到了非常關(guān)鍵的作用[4～9]。在這些信號(hào)放大策略中，基于工具酶（如聚合酶、連接酶、限制性內(nèi)切酶、切割內(nèi)切酶、核酸外切酶、核糖核酸酶等）輔助的信號(hào)放大技術(shù)，由于具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度和特異性高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較短等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在生化分析方面的得到了迅速發(fā)展。尤其是利用核酸酶水解方式的差異性與納米技術(shù)、酶切循環(huán)效應(yīng)、核酸適配體技術(shù)、金屬離子穩(wěn)定的非沃森-克里克堿基配對(duì)系統(tǒng)、核酸熒光染料探針技術(shù)、電化學(xué)方法等相結(jié)合發(fā)展的一系列核酸酶輔助的信號(hào)放大技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、離子和小分子等物質(zhì)的檢測(cè)[10～14]?；诤怂崦篙o助的信號(hào)放大策略主要有兩大類，一是序列依賴性的限制性內(nèi)切酶或切割內(nèi)切酶輔助的信號(hào)放大策略，另一類是無(wú)序列依賴性的核酸外切輔助的信號(hào)放大策略。從核酸酶輔助的信號(hào)放大策略的通用性來(lái)講，沒(méi)有序列依賴性的核酸外切酶在探針設(shè)計(jì)和靶標(biāo)分析方面更加簡(jiǎn)便易行，因而顯示了更廣的應(yīng)用前景。本文即在簡(jiǎn)單概括核酸外切酶的分類以及基本特性的基礎(chǔ)上，著重介紹核酸外切酶輔助的信號(hào)放大策略在核酸、蛋白質(zhì)、小分子及離子分析檢測(cè)中的研究進(jìn)展，并展望其發(fā)展趨勢(shì)。

2 核酸外切酶的分類及其基本特性

核酸外切酶簡(jiǎn)稱外切酶（Exonuclease），是一類從多核苷酸鏈的一端開(kāi)始按序催化水解3，5-磷酸二酯鍵，獲得單個(gè)的核苷酸為最終產(chǎn)物（DNA為dNMP，RNA為NMP）的酶。根據(jù)其作用底物的特異性可將核酸外切酶分為單鏈的核酸外切酶和雙鏈的核酸外切酶，如大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ（Exo Ⅰ）和核酸外切酶Ⅶ（Exo Ⅶ）屬于單鏈的核酸外切酶，而雙鏈的核酸外切酶則包括了大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）、λ噬菌體核酸外切酶（λ exo）以及T7核酸外切酶（T7 exo）等。盡管不像核酸內(nèi)切酶那樣具有對(duì)催化水解底物存在較強(qiáng)的堿基序列依賴性，不同的核酸外切酶存在不同的水解條件，可以區(qū)別出從分子鏈的3′末端或5′末端開(kāi)始切斷和對(duì)單鏈DNA或雙鏈DNA具有特異性作用。為了更好地理解和應(yīng)用核酸外切酶輔助的信號(hào)放大策略，本文總結(jié)了在生物分析研究中應(yīng)用較多的幾種核酸外切酶，如表1和圖1所示。以核酸外切酶Ⅲ為例，該酶的切割底物為雙鏈DNA，切割方向?yàn)?′→5′，且要求3′端為平齊或者凹陷末端，切割后產(chǎn)物為5′-單核苷酸。

3 核酸外切酶輔助的信號(hào)放大策略在生化分析中的應(yīng)用

3.1 核酸檢測(cè)

核酸是組成生命體的最主要生物大分子之一，是細(xì)胞內(nèi)攜帶遺傳信息的物質(zhì)，它控制著蛋白質(zhì)的合成和有機(jī)體細(xì)胞的機(jī)能，在生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳和變異等生命活動(dòng)中占有極其重要的地位[16～18]。核酸序列中如果出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入等微小的改變，都將引起基因突變或多態(tài)性，導(dǎo)致遺傳病或其他疾病的出現(xiàn)[19，20]。因此，對(duì)人體的血液、組織及體液等樣品中特定基因序列和與遺傳疾病相關(guān)的單堿基突變的檢測(cè)分析，在分子生物學(xué)、疾病早期診斷與治療、發(fā)病機(jī)理研究以及藥物篩選等方面都具有重大意義[21～25]。

最早的核酸檢測(cè)方法是基于核酸雜交原理的分析方法，主要包括有Southern印跡雜交、Northern印跡雜交和原位雜交等[26～28]。然而當(dāng)靶標(biāo)序列濃度很低時(shí)，這種直接雜交技術(shù)的檢測(cè)效果比較差，靈敏度低，大大限制了其廣泛應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新型的放大檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)。如體外擴(kuò)增技術(shù)[29～31]、酶聯(lián)催化反應(yīng)[32，33]、脫氧核酶催化[34，35]、核酸酶輔助等[36～39]。其中，核酸外切酶輔助的靶標(biāo)循環(huán)技術(shù)應(yīng)用尤為廣泛[40～44]。

2010年，Zuo等[41]使用分子信標(biāo)作為信號(hào)探針，發(fā)展了一種核酸外切酶Ⅲ輔助的靶標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)用于DNA的高靈敏檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)原理如圖2所示，在分子信標(biāo)的5′端標(biāo)記熒光團(tuán)，與5′端平齊的3′端中間位置標(biāo)記淬滅基團(tuán)（分子信標(biāo)3′端有7個(gè)堿基的突出序列用于抵抗核酸外切酶Ⅲ的水解），形成發(fā)夾后，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離非常近，從而使熒光基團(tuán)的熒光被淬滅。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，分子信標(biāo)被打開(kāi)形成能被核酸外切酶Ⅲ水解的3′平末端，核酸外切酶Ⅲ沿雙鏈的3′→5′方向逐步切除單核苷酸，并釋放出熒光基團(tuán)。而同時(shí)釋放的目標(biāo)DNA能與另一個(gè)分子信標(biāo)雜交，引起酶切循環(huán)信號(hào)放大，這種方法對(duì)DNA的檢出限達(dá)到20 amol/L。endprint

相比昂貴的核酸探針標(biāo)記，免標(biāo)記的方法更簡(jiǎn)便、廉價(jià)?；陬愃频脑?，Xu等[42]利用λ核酸外切酶輔助的信號(hào)放大作用設(shè)計(jì)了一種超靈敏的電化學(xué)傳感器。通過(guò)鐵氰根離子在靶標(biāo)存在與否情況下與電極的遠(yuǎn)近，表現(xiàn)出不同的電化學(xué)阻抗來(lái)特異性檢測(cè)乳腺癌基因BRCA1。此外，Kong等[43]將核酸外切酶輔助的靶標(biāo)循環(huán)與金納米顆粒聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)雙重放大免標(biāo)記檢測(cè)DNA，該方法檢出限可以達(dá)到0.6 pmol/L。

除了對(duì)樣品中DNA的檢測(cè)外，RNA尤其是microRNA （miRNA）（被視為一種新型的腫瘤標(biāo)志物）的檢測(cè)也非常重要。Wang等[44]利用電化學(xué)方法，結(jié)合T7核酸外切酶的循環(huán)放大作用，設(shè)計(jì)了一種超靈敏檢測(cè)miRNA的方法。其原理如圖3所示：首先將能與miRNA互補(bǔ)的DNA探針的3′端修飾于金電極表面，此時(shí)由于表面覆蓋有大量DNA使得阻抗信號(hào)較大。當(dāng)加入miRNA之后，miRNA與DNA探針形成雙鏈，在T7核酸外切酶的作用下，修飾在金電極上的DNA探針從5′端開(kāi)始被水解，同時(shí)釋放出的靶標(biāo)miRNA能與下一個(gè)捕獲探針雜交，實(shí)現(xiàn)循環(huán)放大。最后，金電極表面的DNA探針被剪切掉，導(dǎo)致電化學(xué)阻抗信號(hào)降低，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)miRNA的高靈敏檢測(cè)。

圖3 基于T7核酸外切酶輔助的信號(hào)循環(huán)放大方法檢測(cè)miRNA的原理圖[44]

Fig.3 Schematic illustration of T7 exo-assisted signal amplification system for miRNA detection[44]

此外，核酸序列中如果出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的改變，都將引起基因突變，導(dǎo)致遺傳或其它疾病的出現(xiàn)。其中單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms， SNPs）占所有多態(tài)性的90%以上，是頻率最高、信息含量最多的一種變異，也是最多見(jiàn)的遺傳變異類型[45，46]， 如鐮刀形紅細(xì)胞貧血、β-地中海貧血、囊性纖維化病以及腫瘤等[47，48]。由于單核苷酸多態(tài)性通常只是核酸序列中一個(gè)核苷酸改變，類似非靶標(biāo)核酸的存在，因此針對(duì)核酸檢測(cè)的一些方法也被用于與遺傳疾病相關(guān)度較高的單堿基突變的檢測(cè)分析。2014年，Wu等[49]利用分別標(biāo)有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分子探針來(lái)特異性檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性。最近，Wu等[50]為了避免分子探針雙標(biāo)效率低，費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，結(jié)合金顆粒和核酸外切酶Ⅲ設(shè)計(jì)了一種比色方法， 用于區(qū)分單堿基錯(cuò)配。

3.2 蛋白質(zhì)檢測(cè)

蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，是細(xì)胞內(nèi)各類代謝和調(diào)控等生命功能的執(zhí)行者，也是致病因子、藥物對(duì)機(jī)體作用的最重要的靶標(biāo)分子。人類的絕大多數(shù)疾病都是由蛋白質(zhì)表達(dá)異常引起的，蛋白的表達(dá)指示了細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)，揭示了藥物及環(huán)境因素對(duì)生命體的影響。因此，系統(tǒng)性的蛋白質(zhì)研究和分析對(duì)理解生命現(xiàn)象、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程和藥物作用等方面都具有非常重要的意義[51，52]。

基于傳統(tǒng)的免疫分析是常規(guī)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，通常在抗原或抗體上標(biāo)記放射性物質(zhì)、酶或熒光素等，然后利用抗原-抗體間的特異性反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的靈敏特異性檢測(cè)[53～59]。雖然免疫分析可以對(duì)蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)，但以上技術(shù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，操作繁瑣，效率低，不適合系統(tǒng)化、大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，且功能化修飾可能影響抗原抗體間的親和力。因此，發(fā)展一些簡(jiǎn)單、快速、靈敏的蛋白質(zhì)分析新方法顯得尤為重要。

近年來(lái)，基于蛋白與核酸的作用以及核酸與工具酶的作用，發(fā)展了一系列新型的蛋白質(zhì)分析方法[60～64]。這些方法不僅避免了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法中操作復(fù)雜，常需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，不易保持其生物活性等缺點(diǎn)，還有效地提高了蛋白質(zhì)檢測(cè)的效率與靈敏度。2010年，Ou等[60]基于TATA結(jié)合蛋白（TBP）與含有TATA序列的DNA的特異結(jié)合能有效抵抗核酸外切酶的作用，設(shè)計(jì)了一種核酸外切酶Ⅲ輔助的信號(hào)放大比色檢測(cè)蛋白質(zhì)的新方法。如圖4所示，首先在不同的金納米顆粒上分別修飾上能互補(bǔ)的單鏈DNA，當(dāng)兩種金納米顆粒按一定比例混合后，互補(bǔ)DNA之間的堿基作用力使得金納米顆粒相互靠近，從而產(chǎn)生金納米顆粒團(tuán)聚效應(yīng)，肉眼看到金納米顆粒溶液由酒紅色變成暗紫色。然后，加入核酸外切酶Ⅲ，當(dāng)TBP存在時(shí)，因TBP與含有TATA序列DNA特異性結(jié)合，能對(duì)DNA 3′端有保護(hù)作用（空間位阻效應(yīng)），使得核酸外切酶Ⅲ不能切割DNA鏈，從而金顆粒溶液一直呈暗紫色；當(dāng)TBP不存在時(shí)，DNA鏈?zhǔn)サ鞍椎谋Ｗo(hù)作用，核酸外切酶Ⅲ從DNA 3′端切割，使得金顆粒彼此遠(yuǎn)離，溶液呈酒紅色，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA特異結(jié)合蛋白TBP的比色檢測(cè)。

圖4 基于核酸外切酶Ⅲ輔助的信號(hào)循環(huán)放大方法和金顆粒檢測(cè)DNA特異結(jié)合蛋白的原理圖[60]

Fig.4 Schematic illustration of Exo Ⅲ-assisted signal amplification system and gold nanoparticles for sequence-specific DNA-binding protein detection[60]

隨著更多的靶標(biāo)蛋白的核酸適配體成功篩選，基于適配體作為識(shí)別元件的核酸外切酶輔助信號(hào)放大的蛋白質(zhì)檢測(cè)也備受關(guān)注。Chen等[61]發(fā)明了一種基于核酸適配體和核酸外切酶Ⅲ輔助下循環(huán)放大的平臺(tái)用于檢測(cè)溶菌酶。實(shí)驗(yàn)原理如圖5所示，設(shè)計(jì)一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA，DNA鏈的一部分為溶菌酶的核酸適配體。當(dāng)有溶菌酶存在的情況下，探針發(fā)生空間構(gòu)象變化使得非核酸適配體部分暴露出，然后加入標(biāo)記了熒光基團(tuán)的信號(hào)探針，該探針與非核酸適配體部分互補(bǔ)配對(duì)，形成平齊末端的DNA雙鏈，在核酸外切酶Ⅲ的作用下，信號(hào)探針被剪切，釋放出熒光基團(tuán)，被打開(kāi)的發(fā)夾探針可以循環(huán)利用，釋放出大量熒光基團(tuán)，由于熒光分子無(wú)法被吸附到氧化石墨烯表面，從而呈現(xiàn)出強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)不存在溶菌酶時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)無(wú)法打開(kāi)，信號(hào)探針無(wú)法與其互補(bǔ)結(jié)合，核酸外切酶Ⅲ也無(wú)法切割，熒光基團(tuán)一直被標(biāo)記在信號(hào)探針上，信號(hào)探針與氧化石墨烯結(jié)合，熒光基團(tuán)被氧化石墨烯淬滅，呈現(xiàn)很低的熒光信號(hào)。endprint

基于類似的原理，凝血酶與其對(duì)應(yīng)的核酸適配體結(jié)合后構(gòu)型會(huì)發(fā)生變化，Wang等[62]設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)凝血酶的方法，該方法特異性好，靈敏度高，可達(dá)到對(duì)幾個(gè)蛋白分子的準(zhǔn)確定量。此外，利用一些核酸外切酶對(duì)底物的偏好性（如磷酸化、甲基化等），發(fā)展了一些磷酸激酶、磷酸化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等的檢測(cè)新方法。Liu等[63]利用λ核酸外切酶對(duì)底物5′磷酸化的要求，結(jié)合氧化石墨烯平臺(tái)設(shè)計(jì)了一種快速檢測(cè)T4多核苷酸激酶活性的方法。

圖5 基于氧化石墨烯和核酸外切酶Ⅲ輔助的信號(hào)循環(huán)放大方法檢測(cè)溶菌酶的原理圖[61]

Fig.5 Schematic illustration of GO and Exo Ⅲ-assisted signal amplification system for lysozyme detection[61]

3.3 生物小分子檢測(cè)

除了核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子外，一些生物活性小分子在機(jī)體的新陳代謝及生命過(guò)程中也起著重要作用，與人類的健康息息相關(guān)。如三磷酸腺苷（ATP）發(fā)生水解時(shí)，能產(chǎn)生大量供給人體的日常所需的生命活動(dòng)的能量；還原型的谷胱甘肽（GSH）可以通過(guò)與過(guò)多的自由基或者對(duì)身體有害處的重金屬等物質(zhì)結(jié)合，以達(dá)到中和有毒物質(zhì)的作用，并能夠?qū)⒅懦鲶w外，所以GSH是人體內(nèi)部特別的抗氧化劑跟自由基清除劑。以GSH、ATP等為代表的細(xì)胞內(nèi)小分子活性物質(zhì)的檢測(cè)對(duì)研究機(jī)體的生理功能和疾病早期診斷具有重要意義。目前，用于生物活性分子的分析檢測(cè)手段主要有熒光、比色、電化學(xué)以及同位素標(biāo)記等。其中，利用熒光方法分析小分子具有靈敏度高、分析快捷、樣品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛關(guān)注。隨著配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）的發(fā)展，一些小分子的核酸適配體（Aptamer）被發(fā)現(xiàn)，利用其適配體與小分子的特異性結(jié)合，已發(fā)展了許多新的小分子熒光分析新方法[65～67]。工具酶對(duì)作用底物的結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的依賴性，而這些小分子與核酸適配體的結(jié)合又能誘導(dǎo)核酸適配體構(gòu)型的變化，因而，一些工具酶也被廣泛用于小分子的放大檢測(cè)[68～71]。

如圖6所示，Xu等[68]設(shè)計(jì)了一種基于核酸外切酶Ⅲ催化的目標(biāo)物循環(huán)放大方法免標(biāo)記檢測(cè)ATP。利用ATP的核酸適配體構(gòu)建了一個(gè)發(fā)夾探針，且使得莖部3′端突出，以避免被核酸外切酶Ⅲ降解。當(dāng)有ATP存在時(shí)，ATP與發(fā)夾探針中的核酸適配體序列結(jié)合，使得核酸適配體的構(gòu)型發(fā)生變化，導(dǎo)致莖部3′端凹陷，加入核酸外切酶Ⅲ后即可從3′端開(kāi)始剪切雙鏈部分，最終形成單鏈DNA，并釋放出ATP，而ATP即可繼續(xù)循環(huán)利用，實(shí)現(xiàn)循環(huán)放大，雙鏈特異性染料無(wú)法嵌入循環(huán)產(chǎn)生的單鏈DNA，因此沒(méi)有熒光信號(hào)。而沒(méi)有目標(biāo)ATP存在時(shí)，發(fā)夾探針的莖部雙鏈部分能嵌入SYBR Green I呈現(xiàn)出非常高的熒光信號(hào)。

Zheng等[69]利用核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合產(chǎn)生的空間位阻作用達(dá)到抗酶切的效果，設(shè)計(jì)了一種基于核酸外切酶Ⅰ輔助的分析檢測(cè)平臺(tái)，可用于離子、小分子物質(zhì)及蛋白的檢測(cè)。

圖6 基于核酸外切酶Ⅲ輔助的目標(biāo)物循環(huán)放大方法檢測(cè)ATP的原理圖[68]

Fig.6 Schematic illustration of Exo Ⅲ-assisted target amplification system for ATP detection[68]

3.4 離子檢測(cè)

重金屬離子Hg2+和Ag2+由于其性質(zhì)相對(duì)比較穩(wěn)定，在環(huán)境中很難被生物降解，且生物毒性高，因此，重金屬污染嚴(yán)重危害環(huán)境及生物的生存。由于重金屬污染以及重金屬隨著食物鏈的富集作用，使得重金屬離子廣泛存在于水、土壤和食物當(dāng)中，

圖7 基于核酸外切酶Ⅲ輔助的信號(hào)放大方法檢測(cè)Hg2+的原理圖[80]

Fig.7 Schematic illustration of Exo Ⅲ-assisted signal amplification system for Hg2+ detection[80]

然而重金屬的攝入會(huì)直接損害人體健康，過(guò)量甚至?xí)＜吧黐72，73]，因此針對(duì)重金屬離子的監(jiān)測(cè)顯得極為重要。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是基于專業(yè)儀器的原子吸收光譜、原子發(fā)射光譜以及電感耦合等離子體質(zhì)譜法等，這些方法存在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高等缺點(diǎn)。近些年，一些基于小分子發(fā)色團(tuán)、納米材料、核酶以及聚合物材料的重金屬離子傳感檢測(cè)方法被不斷發(fā)展[74～76]。同時(shí)，基于DNA的特殊堿基或位點(diǎn)能特異性地與某些金屬離子結(jié)合，形成非自然堿基對(duì)（即金屬離子穩(wěn)定的非沃森-克里克堿基配對(duì)系統(tǒng)，如“T-Hg2+-T”、“C-Ag+-C”），許多針對(duì)相應(yīng)離子的傳感器被發(fā)展出來(lái)[77～79]。正是由于這些離子與核酸的結(jié)合，許多工具酶，特別是核酸外切酶也被引入相應(yīng)離子的放大檢測(cè)體系[80，81]。如Chen等[80]發(fā)明了一種基于核酸外切酶Ⅲ輔助的信號(hào)放大方法可視化檢測(cè)Hg2+的一次性條帶生物傳感器，其原理如圖7所示，發(fā)夾DNA和輔助DNA中間部分可互補(bǔ)配對(duì)，其中發(fā)夾DNA的3′端和輔助DNA的5′均為富T序列，沒(méi)有Hg2+存在時(shí)，二者無(wú)法雜交以打開(kāi)發(fā)夾DNA；只有當(dāng)Hg2+存在時(shí)，通過(guò)T-Hg2+-T非自然配對(duì)使得形成具有平齊末端的雙鏈DNA，進(jìn)而被核酸外切酶Ⅲ識(shí)別并從3′端開(kāi)始剪切，釋放出的輔助DNA和Hg2+繼續(xù)循環(huán)利用，產(chǎn)生大量ssDNA。在B部分中，結(jié)合部分（Conjugate pad）含有大量修飾了DNA的金顆粒（AuNPs-DNA probe1），檢測(cè)條帶區(qū)域（TZ）處含有修飾了鏈霉親和素和生物素的DNA（SA-biotin-DNA probe2），對(duì)照條帶區(qū)域（CZ）處含有修飾了鏈霉親和素和生物素的另一條DNA（SA-biotin-DNA probe3）。其中AuNPs-DNA probe1與SA-biotin-DNA probe3是互補(bǔ)的，只要條帶部分完好，金顆粒被富集于CZ條帶處顯色，該條帶可以檢驗(yàn)條帶傳感器是否完好。當(dāng)檢測(cè)體系中有Hg2+存在時(shí)，產(chǎn)生的ssDNA可以與AuNPs-DNA probe1和SA-biotin-DNA probe2雜交，從而使金顆粒富集于TZ條帶處顯色；而當(dāng)沒(méi)有Hg2+存在時(shí)，無(wú)法產(chǎn)生ssDNA，因此TZ條帶處不能顯色。該方法方便快捷，可直接肉眼觀察到結(jié)果，且靈敏度高，檢出限可達(dá)1 pmol/L。類似T-Hg2+-T非自然堿基配對(duì)，基于C-Ag+-C效應(yīng)和核酸外切酶Ⅲ輔助放大，Xu等[79]設(shè)計(jì)了一種的循環(huán)放大方法檢測(cè)Ag+，其檢出限可達(dá)0.03 nmol/L。endprint

4 展 望

核酸外切酶在生化分析領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展極其快速而且應(yīng)用方式變化層出不窮。縱觀核酸外切酶在生化分析中的應(yīng)用情況，其在生化分析中的應(yīng)用發(fā)展未來(lái)將有可能呈現(xiàn)出以下趨勢(shì)，包括：（1）多元化信號(hào)獲取方式?？梢酝ㄟ^(guò)改進(jìn)儀器達(dá)到高靈敏的檢測(cè)（如熒光信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)等），也可通過(guò)肉眼直接觀察的比色方法以及試紙條顯色等方法得出結(jié)果，未來(lái)可能有更多、更靈敏的信號(hào)輸出方式；（2）酶切循環(huán)放大和功能化納米材料信號(hào)放大相結(jié)合實(shí)現(xiàn)多重放大。例如酶和金屬納米顆粒結(jié)合應(yīng)用，先通過(guò)酶切實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，然后通過(guò)結(jié)合金屬納米顆粒二級(jí)放大實(shí)現(xiàn)更靈敏的檢測(cè)； （3）向生化傳感的實(shí)用性方向發(fā)展。利用核酸外切酶來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的傳感器通常都比較輕巧，不需要配備嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和貴重的儀器，可用于發(fā)展便攜的傳感器或檢測(cè)試紙條等，因此這類傳感器有望實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)（POCT）和臨床應(yīng)用；（4）復(fù)雜生物樣品的檢測(cè)?；诤怂嵬馇忻傅姆糯髾z測(cè)方法，目前還主要應(yīng)用于體外緩沖液樣品的檢測(cè)，隨著更多的離子、分子、細(xì)胞等與核酸結(jié)合的發(fā)現(xiàn)，核酸外切酶也將用于更多樣性的分析物的檢測(cè)，其難點(diǎn)和挑戰(zhàn)是在更為復(fù)雜的生物樣品（如體液、細(xì)胞等）中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測(cè)。我們相信，隨著對(duì)核酸外切酶性質(zhì)和應(yīng)用的進(jìn)一步探索，核酸外切酶在生化分析領(lǐng)域?qū)?huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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