張 婷,付 軍,王國治,陳保文,楊 蕾,盧錦標,許 曄,李慶閣
2.中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室,北京100050
我國結核分枝桿菌的耐藥情況嚴重,耐藥率高,給結核病的預防和治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)。耐多藥結核?。∕ultidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)是指至少對異煙肼和利福平具有耐藥性,廣泛耐藥結核 病 (Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)則是指在耐多藥結核病的基礎上,對二線藥物中的氟喹諾酮類藥物以及3種二線抗結核注射劑(卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星)中的至少一種耐藥。MDR-TB和XDR-TB的不斷增多,使得快速、可靠地對二線抗結核藥物的耐藥性進行檢測的需求更加迫切。
常用的注射類二線抗結核藥物主要有氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、阿米卡星)和多肽類抗生素(卷曲霉素)。通過藥物敏感性試驗進行耐藥檢測是目前普遍采用的方法,包括比例法和絕對濃度法[1]。但由于結核分枝桿菌生長緩慢而使藥敏試驗周期過長,通常需要4-6周,延誤患者治療?;诜肿由飳W的耐藥檢測可以大大減少得到藥敏結果的時間,如線性探針雜交法[2-3]、焦磷酸測序法[4]、DNA 測序法等。然而,這些基于PCR的方法均涉及PCR后處理,易引起PCR產(chǎn)物污染造成假陽性結果,且操作復雜,需要具備專業(yè)背景的技術人員。
基于實時PCR技術的探針熔解曲線法將擴增和檢測合二為一,無PCR后處理,具有快速、特異、靈敏等優(yōu)點,在突變檢測領域得到廣泛應用,在結核分枝桿菌耐藥性檢測上的應用也引起人們極大興趣[5-11]。注射類二線藥的耐藥主要由點突變引起,適合采用探針熔解曲線法進行檢測??敲顾亍⒚卓ㄐ呛途砬顾氐哪退帣C制存在交叉耐藥現(xiàn)象,主要是由rrs基因的點突變導致,3種藥的耐藥株中發(fā)生該基因突變的比例分別為25%~40%、95%和70%~80%,包括rrs1401A→G、rrs1402C→T和rrs1484G→T等位點。另外,rrs1473G→A/T的突變導致部分卷曲霉素的耐藥。60%~80%的卡那霉素耐藥株在eis基因啟動子區(qū)發(fā)生突變,主要有-10G→A、-14C→T和-37G→T等突變類型[12-15]。
本研究利用廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結核分枝桿菌注射類二線藥耐藥突變檢測試劑盒(探針熔解曲線法)MeltPro TB/SL對241份結核分枝桿菌臨床分離株進行注射類二線藥耐藥相關突變檢測,并對該試劑盒進行檢測性能的考察。
1.1 結核分枝桿菌注射類二線藥耐藥突變檢測試劑盒MeltPro TB/SL試劑盒由廈門致善生物科技股份有限公司提供。試劑盒采用探針熔解曲線法檢測,使用雙管雙色體系檢測rrs基因(1401、1402、1473和1484位點)、eis基因啟動子區(qū)(-10、-14和-37位點)的突變。包括提取體系(TB DNA提取液)、擴增體系(PCR反應混合液A、B和酶混合液)以及對照體系(陽性對照和陰性對照)。
探針熔解曲線法的檢測原理基于野生型序列具有特定的熔點,基因突變會導致探針結合能力下降,導致熔點下降。根據(jù)熔點的變化即可判斷突變的有無。對于一份未知的待檢樣本,需要結合反應體系A和B的FAM和HEX通道共4個檢測區(qū)域的結果,進行整體的分析。結核分枝桿菌在4個檢測區(qū)域均應存在野生型或突變型熔解峰,若有一個或一個以上檢測區(qū)域無熔解峰,則提示待檢樣本可能不是結核分枝桿菌或其濃度低于檢測限。
反應程序:50。C2min;95。C10min;95。C10 s,71。C15s(每個循環(huán)下降1。C),78。C15s,循環(huán)10次;95。C10s,61。C15s(檢測熒光),78。C15 s,循環(huán)45次,熒光通道選用FAM和HEX。熔解分析程序:95。C2min;40。C2min;40。C~85。C,升溫過程中每1。C采集FAM和HEX通道熒光信號。
注射類二線藥耐藥突變檢測分兩管在雙色實時PCR儀進行。一管檢測rrs基因突變,另一管檢測eis基因啟動子區(qū)突變。PCR體系按照試劑盒說明書配制,25μL檢測體系含20μL PCR反應混合液和5μL模板DNA。
1.2 菌株來源及處理
1.2.1 臨床樣本 來自中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室的結核分枝桿菌培養(yǎng)樣本96份,均有卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素的藥敏信息;來自山東胸科醫(yī)院的結核分枝桿菌培養(yǎng)樣本145份,無藥敏信息。
文獻[11]提出了基于余弦函數(shù)(記為COSGWO)和二次函數(shù)(記為2GWO)的非線性動態(tài)變化收斂因子更新方法,更新公式為式(23)、式(24),仿真結果表明優(yōu)于基本GWO,且基于余弦函數(shù)和二次函數(shù)的收斂因子非線性動態(tài)變化效果接近。
按照試劑盒說明書,采用熱裂解法進行基因組DNA的提?。喝颖镜臏缁罹海cTB DNA提取液按照體積比1∶1混勻;99。C加熱20min;13 000 r/min離心10min,取上清作為模板。
1.2.2 非結核分枝桿菌 用于分析特異性評價的23株非結核分枝桿菌標準株滅活菌液由中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室提供。23株菌濃度為1×106個菌/mL,包括:鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、胃分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、施氏分枝桿菌、次要分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、亞洲分枝桿菌?;蚪MDNA提取方法與臨床樣本的提取方法相同。
1.2.3 含不同耐藥突變的質(zhì)粒 用于突變檢出能力驗證的12個質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其中包括2個野生型質(zhì)粒(分別對應rrs基因和eis基因啟動子區(qū))以及10個突變型質(zhì)粒(1個野生型多態(tài)性eis-12C>T,9個耐藥突變rrs1401A>G、rrs1402C>T、rrs1473G>A、rrs1473G>T、rrs1484G>T、eis-37G>T、eis-14C>T、eis-13A>G、eis-10G>A)。使用 E.Z.N.A.TMPlasmid Miniprep Kit(Omega Bio-tek,美國)進行質(zhì)粒的提取。使用分光光度計進行濃度測定,根據(jù)質(zhì)粒長度進行拷貝數(shù)的計算。
1.2.4 H37Rv標準株 用于最低檢測限考察的H37Rv標準株滅活菌液由深圳市慢性病防治中心提供,使用 TIANamp Bacteria DNA Kit(TIANGEN BIOTECH,北京)進行基因組DNA提取和純化。之后使用分光光度計進行濃度測定。
1.3 實驗儀器 CFX 96實時定量PCR儀(Bio-Rad,美國);GenePro基因擴增儀(杭州博日科技有限公司,中國);ND-1000紫外-可見分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司);5451D臺式離心機(Eppendorf,德國);CHB-100恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰?,中國)。
1.4 突變檢出能力考察 使用TB DNA提取液將定量好的質(zhì)粒進行稀釋,得到濃度為1×104拷貝/μL的模板。同時以滅菌超純水作為空白對照。
1.5 最低檢測限考察 使用TB DNA提取液將定量好的H37Rv基因組DNA進行稀釋,依次得到濃度為1×105拷貝/μL、1×104拷貝/μL、1×103拷貝/μL、1×102拷貝/μL、1×101拷貝/μL、1×100拷貝/μL的模板。每管加入5μL作為模板,同時以滅菌超純水作為空白對照。
1.7 分析特異性考察 以中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室提供的23株非結核分枝桿菌提取的DNA為模板,考察該試劑盒的分析特異性。同時以滅菌超純水作為空白對照。
1.8 樣本檢測 使用241份臨床樣本進行試劑盒的臨床評價。所有檢測為突變的樣本、疑似不均一耐藥的樣本以及與藥敏結果不符的樣本均進行測序驗證,測序由華大基因科技服務有限公司完成。
2.1 使用質(zhì)粒進行突變檢出能力的考察 為考察該試劑盒能否將注射類二線藥耐藥相關突變與野生型進行區(qū)分,使用具有不同突變類型的質(zhì)粒進行考察。結果如表1。
結果顯示,各耐藥突變與野生型的熔點差異均在3.0。C以上,突變型均能和野生型相區(qū)分。部分情況下無法判斷具體的突變類型(rrs1473G>A和rrs1473G>T;eis-14C>T、eis-13A>G 和eis-10G>A),但這兩種情況下不同突變的發(fā)生都導致試驗菌株對CAP或KAN耐藥,因此不影響對試驗菌株耐藥性的判斷。
2.2 最低檢測限考察結果 最低檢測限考察的結果顯示,不同濃度的模板對應的4個檢測通道的Tm值均一而穩(wěn)定。當野生型模板濃度為5拷貝/反應時,4個檢測通道均有相應的熔解峰。結果表明,本體系的野生型最低檢出量可以達到5拷貝/反應。
2.3 不同突變比例模板的考察結果 如圖1結果顯示,隨著突變比例的增加,熔解曲線逐漸由野生型峰向突變型峰偏移。在4個檢測通道中,突變比例為30%及以上時,熔解曲線的峰形較野生型有明顯的差異,可以與野生型峰進行區(qū)分,從而判斷為不均一耐藥樣本。
2.4 分析特異性的考察結果 使用23種非結核分枝桿菌進行該試劑盒的分析特異性考察,同時以H37Rv為對照。結果顯示,在反應體系A的FAM和HEX通道,除H37Rv有熔解信號之外,部分非結核分枝桿菌有信號;在反應體系B的FAM通道和HEX通道,除H37Rv有野生型熔解峰之外,23株非結核分枝桿菌和空白對照的結果一致,即反應體系B對非結核分枝桿菌的無交叉反應。綜合兩個反應結果,沒有任何一株NTM同時在兩個反應中均有檢測信號,因此23種常見非結核分枝桿菌對檢測結果無交叉反應,說明該試劑對于上述NTM具有100%的分析特異性。
2.5 臨床樣本檢測結果
2.5.1 中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室的培養(yǎng)樣本96份。
表1 不同突變質(zhì)粒與野生型的熔點差異Tab.1 ΔTmbetween wild-type and mutant plasmids
圖1 不同突變比例的模板考察的結果Fig.1 Detection of the mixed mutant and wild-type in different ratios
通過將試劑盒的檢測結果與藥敏結果進行對比(表2),可以發(fā)現(xiàn),對于卡那霉素耐藥突變檢測,該試劑盒的靈敏度為90.0%,特異性為98.8%,總符合率為97.9%,kappa值為0.89;對于阿米卡星耐藥突變檢測,該試劑盒的靈敏度為80.0%,特異性為98.8%,總符合率為96.9%,kappa值為0.83;對于卷曲霉素耐藥突變檢測,該試劑盒的靈敏度為85.7%,特異性為96.6%,總符合率為95.8%,kappa值為0.73。
表2 探針熔解曲線結果與藥敏結果對比Tab.2 Results comparison between MeltPro TB/SL and phenotypic drug-susceptibility testing(DST)
從以上96份臨床樣本中共檢出10例突變樣本,測序結果表明,9例樣本發(fā)生rrs1 401A→G突變,1例樣本發(fā)生eis基因啟動子區(qū)-10G→A突變。比例法藥敏試驗結果對卡那霉素耐藥而MeltPro TB/SL為野生的1例樣本,其測序結果也為野生型,與探針熔解曲線結果一致;比例法藥敏試驗結果對卡那霉素敏感而MeltPro TB/SL為突變的1例樣本,其測序結果為rrs1401A→G,與探針熔解曲線結果一致。比例法藥敏試驗結果對阿米卡星耐藥而MeltPro TB/SL為野生的2例樣本,其測序結果也為野生型,與探針熔解曲線結果一致;比例法藥敏試驗結果對阿米卡星敏感而MeltPro TB/SL為突變的1例樣本,其測序結果為rrs1 401A→G,與探針熔解曲線結果一致。比例法藥敏試驗結果對卷曲霉素耐藥而MeltPro TB/SL為野生的1例樣本,其測序結果也為野生型,與探針熔解曲線結果一致;比例法藥敏試驗結果對卷曲霉素敏感而MeltPro TB/SL為突變的3例樣本,其測序結果為rrs1401A→G,與探針熔解曲線結果一致??偠灾瑴y序結果與探針熔解曲線法的耐藥檢測結果完全一致。
2.5.2 山東胸科醫(yī)院的145份培養(yǎng)樣本 使用注射類二線藥耐藥突變檢測試劑盒對145份樣本進行檢測,并對突變樣本進行測序驗證。熔解曲線分析為突變的樣本共9份,均為反應體系A的FAM通道檢測突變,即rrs1 400區(qū)域的突變。經(jīng)測序證實,所有9株突變類型均為rrs1 401A→G突變。另外檢出1份不均一耐藥樣本,在反應體系A的FAM通道檢測結果為雙峰。經(jīng)測序證實,該樣本同時存在野生型菌株和突變類型為rrs1 401A→G的突變型菌株。
簡便高效、靈敏特異的耐藥診斷技術是結核病防控的有利工具,對于耐藥結核病的早期檢測、合理治療以及傳播控制都有重要的意義。目前針對一線抗結核藥物的耐藥檢測試劑有較多開發(fā)和評價[6-11,16-17],而針 對 注 射 類 二 線 藥 的 耐 藥 檢 測 試 劑相對較少,專門針對注射類二線藥的耐藥檢測試劑則近乎空白。商用試劑GenoType MTBDRsl(Hain Lifescience,德國)采用固相線性探針雜交原理,可檢測包括氟喹諾酮類、乙胺丁醇以及氨基糖苷類/多肽類的耐藥性[2-3]。其中針對注射類二線藥的耐藥性突變,該試劑僅針對rrs基因設計了2條突變型探針,而已知與注射類二線藥耐藥相關的常見突變在rrs基因上有1 401、1 402、1 473和14 844個位點,在eis基因啟動子區(qū)有-10、-14和-37 3個位點,顯然,該試劑盒檢測的突變數(shù)目嚴重不足。另外,就方法學而言,所采用的固相雜交法需要多步PCR后操作,不僅操作復雜繁瑣,時間長,且極易造成PCR產(chǎn)物的污染而出現(xiàn)假陽性結果。
本文考察的結核分枝桿菌注射類二線藥耐藥突變檢測試劑盒(探針熔解曲線法)MeltPro TB/SL是目前唯一專門檢測注射類二線藥物耐藥突變的試劑,覆蓋突變位點囊括了rrs基因的4個位點(1401、1402、1473和1484位點)和eis基因啟動子區(qū)(-10、-14和-37位點)的3個位點上的所有突變類型,設計檢測耐藥突變類型共9個,大大超過了GenoType MTBDRsl檢測數(shù)目。在方法學上,MeltPro TB/SL是基于熒光PCR的探針熔解曲線法,屬于閉管檢測模式,檢測過程在實時PCR儀器上運行,無PCR后處理步驟,不僅大大節(jié)約了時間(46個樣品從核酸提取到報告結果僅需約3h),也減少了PCR產(chǎn)物污染的機會。
從分析性能評價結果可以看出,MeltPro TB/SL可將10種突變類型與野生型明確區(qū)分,最低檢出量低至5個拷貝的野生型基因組DNA,并且其熔解峰Tm值在較大范圍內(nèi)不受模板濃度影響。使用含有常見耐藥突變型的質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒按不同的比例混合后,當突變比例為30%及以上時,熔解曲線的峰形相較于野生型有明顯的差異,可以與野生型區(qū)分,這一結果為檢測耐藥患者中的非均一耐藥提供了依據(jù)。分析特異性研究結果表明,在23株NTM中,部分NTM在rrs基因有檢測信號,這可能與rrs基因在這些NTM中保守度高有關,但所有菌株在eis基因啟動子區(qū)內(nèi)均無信號。對于任何一個待測樣本而言,其檢測結果需兩個反應同時檢出信號,當其中一個反應無檢測信號時,就可以判斷該樣本非 MTB感染,上述結果證明了 MeltPro TB/SL高特異性。
從臨床性能評價結果可以看出,與傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗相比,MeltPro TB/SL有較高的臨床靈敏度(卡那霉素為90.0%,阿米卡星80.0%,卷曲霉素85.7%),尤其是具有極高的臨床特異性(卡那霉素為98.8%,阿米卡星98.8%,卷曲霉素96.6%)。對于那些藥敏結果與突變檢測結果不一致的樣本,測序結果顯示其突變信息與MeltPro TB/SL結果一致,進一步證明了該試劑檢測突變的可靠性。這些藥敏與突變信息不一致的樣本,或者存在其它的耐藥突變機制,或者其藥敏試驗的準確性不夠,需更多的樣本驗證。
總之,MeltPro TB/SL覆蓋位點廣,分析性能優(yōu)良,對臨床樣本的檢測結果與藥敏結果以及測序結果具有較高的一致性,并具有操作簡便和檢測快速的優(yōu)點,作為一種新型結核分枝桿菌注射類二線藥耐藥突變檢測的試劑,具有潛在的應用價值,有望為耐藥結核病的防控和治療提供快速高效的篩查手段。
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