高永艷，陳欽再，郭桂萍，盧瑛*，孫佳益，潘迎捷

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南通 226006）

南美白對(duì)蝦主要過(guò)敏原原肌球蛋白的低過(guò)敏性處理方法研究

高永艷1，陳欽再1，郭桂萍2，盧瑛*1，孫佳益1，潘迎捷1

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南通 226006）

以南美白對(duì)蝦原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm）為研究對(duì)象，采用酶解法、超聲結(jié)合酶解法消減3種蝦制品中的Tm。首先，以菠蘿蛋白酶水解富集的Tm樣品通過(guò)優(yōu)化酶活與底物質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度，建立了能有效消減Tm的酶解方法；同時(shí)對(duì)比了酶解、超聲結(jié)合酶解法分別對(duì)蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜3種制品中的Tm過(guò)敏原性變化情況。Tm致敏動(dòng)物模型的抗血清ELISA結(jié)果顯示，單純酶解和超聲結(jié)合酶解處理的蝦仁其過(guò)敏原性無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；經(jīng)超聲結(jié)合菠蘿蛋白酶酶解處理后的蝴蝶蝦仁樣品其過(guò)敏原性降低了21.05%；而蝦糜樣品中，單純的酶解或超聲結(jié)合酶解法與對(duì)照相比均有顯著性差異，其過(guò)敏原性分別減少了30.70%和33.33%。綜上所述，作者建立的酶解法可有效消減Tm的過(guò)敏原性，該酶解法以及超聲結(jié)合酶解法在低過(guò)敏原性蝴蝶蝦仁和蝦糜制品的生產(chǎn)領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用可行性。

低過(guò)敏性；原肌球蛋白；消減；菠蘿蛋白酶

隨著生活水平的提高，食物引起的過(guò)敏性疾病已成為嚴(yán)重的食物安全問(wèn)題，相關(guān)調(diào)查顯示，約有3%～4%的成人和6%的兒童發(fā)生食物過(guò)敏反應(yīng)［1］。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織公布的8大類主要過(guò)敏食品，有兩類屬于水產(chǎn)品，其中一類就是蝦蟹等甲殼類動(dòng)物及其制品［2］。近年來(lái)，食物過(guò)敏發(fā)生率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確［3］，臨床上尚無(wú)有效的治療方法，易過(guò)敏患者僅能依靠避免或者減少致敏性食物的攝入，從而達(dá)到預(yù)防過(guò)敏的目的。

南美白對(duì)蝦在我國(guó)的分布較為廣泛，養(yǎng)殖規(guī)模較大，是我國(guó)常見(jiàn)的蝦類，因其含有較高的營(yíng)養(yǎng)成分，氨基酸種類齊全，蛋白質(zhì)含量豐富，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［4］，而被消費(fèi)者青睞。目前，我國(guó)對(duì)其消費(fèi)較高，主要產(chǎn)品有冷凍蝦仁、即食蝦仁［5］、蝦丸［6］等，廢棄物［7-8］頭殼也有較高的利用價(jià)值。

食品領(lǐng)域中的低過(guò)敏性處理方法主要有物理法，生物法等，例如有學(xué)者用微波結(jié)合酶解［9］，超高壓［10］等方法處理乳制品來(lái)降低其過(guò)敏性，用超高壓結(jié)合酶解［11］的方法處理大豆蛋白。原肌球蛋白Tm是甲殼類水產(chǎn)品的主要過(guò)敏原物質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量約為36 000，具有較高的熱穩(wěn)定性和一定的耐消化性。目前較為常見(jiàn)的降低蝦類致敏性的處理方法有酶解法［12-13］、美拉德反應(yīng)［14］、高壓處理等。也有學(xué)者采用輻照［15］、超聲［16］等方法降低蝦的過(guò)敏原性。超聲波具有高速、強(qiáng)烈振動(dòng)和空化效應(yīng)作用，是一種彈性機(jī)械振動(dòng)波。其傳播時(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，能夠降解生物大分子［10］，引起介質(zhì)的某些變化［17］。蛋白酶的酶解作用主要是使抗原決定簇的三維結(jié)構(gòu)改變，或使化學(xué)鍵斷裂導(dǎo)致抗原失去活性從而達(dá)到降低其致敏性的作用，也有通過(guò)斷裂酰胺鍵，破壞其一級(jí)結(jié)構(gòu)而降低其致敏性。有報(bào)道用菠蘿蛋白酶酶解蛋清樣品，其蛋清致敏性有較大程度的降低［18］。

作者以南美白對(duì)蝦主要過(guò)敏原Tm為研究對(duì)象，首先優(yōu)化菠蘿蛋白酶對(duì)Tm富集樣本的最優(yōu)消減條件［19］，建立了Tm的低過(guò)敏性處理方法；進(jìn)而采用酶解、超聲結(jié)合酶解法分別處理蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜樣品對(duì)比分析其過(guò)敏原性變化情況，最終探討了低過(guò)敏原性蝦制品的有效處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活南美白對(duì)蝦：購(gòu)于浦東新區(qū)果園農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；層析濾紙（3030-861）：德國(guó)Whatman公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜（NC）：德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品。菠蘿蛋白酶（B4882-10G），TEMED（0761），DAB顯色液（D0426-50SET）：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；蛋白標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量Marker（BM523），雙色預(yù)染寬相對(duì)分子質(zhì)量Marker，牛血清蛋白組分V（BSA），HRP標(biāo)記的兔抗小鼠抗體IgG（BS392-A）：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為國(guó)產(chǎn)分析純。

勻漿機(jī)（JYL-C020）：九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)電泳儀（mini protean 4）：美國(guó)BIO-RAD產(chǎn)品；半干式轉(zhuǎn)膜儀（AE-8135）：日本ATTO公司產(chǎn)品；凝膠掃描儀（powerlook 2100XL-USB）：UMAX公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)（Avanti J-26XP）：美國(guó)Beckman Coulter產(chǎn)品；超聲波清洗器（SK5200HP）：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：Biotek公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Tm富集樣品的制備蝦類Tm的富集純化參照蔡秋鳳［20］等的方法，并略作修改。首先將蝦肉制成丙酮粉，再將其分別經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%和55%硫銨濃縮得到Tm富集樣品。Bradford法［21］測(cè)定蛋白濃度后，保存于-20℃冰箱中。采用SDS-PAGE和免疫印跡法鑒定Tm的純度，免疫印記一抗為單克隆抗體2A7H6，其對(duì)蝦蟹等甲殼類和部分軟體動(dòng)物的主要過(guò)敏原Tm具有特異性反應(yīng)［22］。

1.2.2 SDS-PAGE和免疫印記SDS-PAGE：參考陳小文等［23］建立的不連續(xù)電泳體系，配制質(zhì)量濃度為12 g/dL的分離膠和5 g/dL的濃縮膠。樣品與上樣緩沖液1:1混勻后，點(diǎn)樣，電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，再經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。免疫印跡：電泳結(jié)束后，采用半干式電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將膜封閉反應(yīng)1 h，再分別加入一抗2A7H6和二抗（兔抗鼠HRP-IgG，1:5 000）各室溫反應(yīng)1 h，最后加入DAB顯色液顯色并拍照。

1.2.3 菠蘿蛋白酶酶解條件優(yōu)化將富集的Tm樣品中加入菠蘿蛋白酶酶解液（酶活6 u/mg）中，探討酶解時(shí)間、最適酶解溫度以及酶活與底物質(zhì)量比（u/g）3個(gè)因素對(duì)酶解作用的影響。首先探討不同酶活與Tm質(zhì)量比，分別對(duì)比酶活與Tm質(zhì)量比為32.57、21.71、14.47、9.65、6.43、4.29 u/g，在60℃水浴30 min時(shí)酶對(duì)Tm過(guò)敏原活性的酶解作用。再采用溫度60℃、酶活與底物質(zhì)量比為32.57 u/g的條件下分別酶解5、10、15、20、25、30 min，優(yōu)化酶解時(shí)間。最后在酶活與底物質(zhì)量比為32.57 u/g的條件下，分別采用酶解溫度為25、30、35、40、45、50、55℃酶解30 min，優(yōu)化酶解溫度。對(duì)酶解后的樣品，采用SDS-PAGE及免疫印跡法分析評(píng)價(jià)酶對(duì)過(guò)敏原物質(zhì)的影響，以確定最佳的酶處理?xiàng)l件。

1.2.4 蝦制品的低過(guò)敏性處理工藝探討去南美白對(duì)蝦10～11 g，去除蝦頭，蝦殼，蝦線，用蒸餾水沖洗干凈，置于吸水紙上去除表面水分，稱重（5± 0.03）g，即為蝦仁樣品；將蝦仁沿蝦線剖開(kāi)呈蝴蝶狀，作者將其命名為蝴蝶蝦仁；用勻漿機(jī)將蝦仁絞碎后的蝦樣定義為蝦糜樣品。首先配制優(yōu)化后的酶解液，再將其置于水浴鍋中預(yù)熱5 min，再將蝦制品加入其中，60℃水浴，酶解30 min后，取出蝦制品蒸制15 min滅酶活。此外，作者還采用了超聲結(jié)合酶解的方法探討蝦的低過(guò)敏性。即先將蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜樣品放入有水的燒杯中，超聲3 min，再加酶解液酶解30 min，其余步驟如前所述。對(duì)照樣品：先將酶解液煮沸10 min滅酶活，再酶解蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜樣品，其余步驟如前所述。

1.2.5 蝦制品的過(guò)敏原性分析抽提Tm的方法參照Shi liang［24］，并略做修改。經(jīng)低過(guò)敏處理的蝦肉與20 mmol/L PBST（pH 7.0，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% Tween20）體積比1：5混合，勻漿40 s。4℃條件下10 000 g離心20 min，取上清，將其煮沸15 min，立即置于冰上冷卻。4℃條件下10 000 g離心20 min，得上清。一部分上清液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，參照Hermann Sch?gger［25］的方法，其中分離膠質(zhì)量濃度為16 g/dL，堆積膠質(zhì)量濃度為4 g/dL。另一部分上清液用碳酸鹽緩沖液以一定比例稀釋后（50 mmolL-1，pH 9.6）100 μL/孔包被，37℃孵育1.5 h，洗滌3次。每孔加200 μL封閉液（PBS+2%BSA）于37℃孵育1 h；洗滌。依次加入抗血清和二抗，抗血清按照1:8 000稀釋（PBS+0.5%BSA），二抗（羊抗鼠HRP-IgG，羊抗鼠HRP-IgE）根據(jù)產(chǎn)品推薦稀釋度稀釋，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗滌。OPD顯色，硫酸終止，測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菠蘿蛋白酶對(duì)Tm酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 菠蘿蛋白酶與底物質(zhì)量比的優(yōu)化蝦的主要過(guò)敏原原肌球蛋白Tm是相對(duì)分子質(zhì)量約為3.6×104的蛋白，不同酶活與底物質(zhì)量比條件下處理Tm后SDS-PAGE和免疫印跡結(jié)果如圖1。由圖可知，隨著酶活與底物質(zhì)量比的增加，在相對(duì)分子質(zhì)量約為3.4×104和3.6×104處電泳條帶逐漸模糊（圖1（a））。樣本1～5其過(guò)敏條帶消減較少，而樣本6的過(guò)敏原Tm條帶基本上消失其消減效果較明顯，表明當(dāng)菠蘿蛋白酶與底物質(zhì)量比為32.57 u/g時(shí)對(duì)過(guò)敏原Tm的消減效果最好。免疫印跡結(jié)果（圖1（b））表明樣本3～6在3.4×104和3.6×104處蛋白對(duì)2A7H6抗體具有特異性反應(yīng)，說(shuō)明3.4×104和3.6×104處為過(guò)敏原蛋白Tm；并且樣本1在3.4×104和3.6×104處無(wú)特異性條帶，說(shuō)明此處沒(méi)有免疫反應(yīng)，該結(jié)果與電泳結(jié)果一致。因此，最優(yōu)的酶活與底物質(zhì)量比為32.57 u/g。在后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選擇該條件較好。

圖1 不同酶與底物質(zhì)量比對(duì)Tm的影響Fig.1The effect of mass ratio between bromelain and substrate on Tm

2.1.2 酶解時(shí)間的優(yōu)化在酶解溫度為60℃時(shí)，不同酶解時(shí)間條件下處理Tm的SDS-PAGE和免疫印跡結(jié)果如圖2所示。從圖中可看出，隨著酶解時(shí)間由1 min到30 min的增加，在相對(duì)分子質(zhì)量約為34× 103和36×103處電泳條帶逐漸模糊，條帶顏色逐漸變淺（圖2（a）），圖中樣本6過(guò)敏原Tm條帶最為模糊，幾乎看不清楚，說(shuō)明相比之下，該時(shí)間點(diǎn)的酶解效果較好。免疫印跡結(jié)果表明（圖2（b）），樣本6在34×103和36×103處無(wú)特異性條帶，說(shuō)明無(wú)特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)而表明Tm消減效果較明顯沒(méi)有特異性反應(yīng)，免疫印跡檢測(cè)不出Tm條帶。該結(jié)果與電泳結(jié)果一致。說(shuō)明菠蘿蛋白酶最佳的酶解時(shí)間為30 min，酶解30 min的效果較好，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，采用菠蘿蛋白酶酶解30 min較好。

圖2 不同酶解時(shí)間對(duì)Tm的影響Fig.2The effect of hydrolysis time of bromelain on Tm

2.1.3 酶解溫度的優(yōu)化不同酶解溫度處理Tm的SDS-PAGE和免疫印跡結(jié)果如圖3所示。隨著酶解溫度由25℃到55℃的增加，在相對(duì)分子質(zhì)量約為34×103和36×103處電泳條帶與對(duì)照組相比基本無(wú)變化（圖3），表明酶解溫度在25℃到55℃條件下，菠蘿蛋白酶的酶解作用很微弱，對(duì)Tm的消減基本沒(méi)有作用，而根據(jù)2.1.2可知，在60℃的條件下處理30 min時(shí)的樣品過(guò)敏原條帶消減較為顯著，大部分Tm被酶解（圖2（a）），免疫印跡反應(yīng)也證實(shí)了這一條件。由此說(shuō)明，在相同條件下，當(dāng)菠蘿蛋白酶酶解溫度設(shè)置為60℃時(shí)能較明顯的消減過(guò)敏原Tm。因此，在后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選擇菠蘿蛋白酶酶解溫度為60℃，較為合理。

2.2 超聲與酶解結(jié)合處理的不同蝦制品的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果

圖4所示，經(jīng)優(yōu)化條件后的菠蘿蛋白酶酶解處理的不同蝦制品的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果，由圖可知，樣本2的Tm條帶與對(duì)照相比，沒(méi)有顯著性變化，說(shuō)明菠蘿蛋白酶對(duì)蝦仁樣品的過(guò)敏原消減作用較低。樣本3的Tm條帶與對(duì)照相比明顯減弱，條帶顏色較淺，有小分子蛋白條帶產(chǎn)生，表明菠蘿蛋白酶對(duì)蝴蝶蝦仁樣品的過(guò)敏原消減有一定的作用。樣本4的Tm條帶減弱的最為明顯，并且產(chǎn)生小分子蛋白條帶較多，與樣本2和3相比，表明菠蘿蛋白酶對(duì)蝦糜樣品的過(guò)敏原消減作用較強(qiáng)。樣本5和6的Tm條帶與對(duì)照樣本幾乎無(wú)顯著差異，表明超聲結(jié)合酶解處理后的蝦仁和蝴蝶蝦仁其Tm基本無(wú)消減，而樣本7的Tm條帶最為模糊，并且產(chǎn)生了更多的小分子蛋白條帶，表明超聲結(jié)合酶解處理蝦糜樣品后Tm條帶有較大程度的減弱，超聲結(jié)合酶解處理蝦糜樣本的對(duì)其過(guò)敏原的消減有較好的作用。

圖3 不同酶解溫度對(duì)Tm的影響Fig.3The effect of hydrolysis temperature of bromelain on Tm

圖4 菠蘿蛋白酶處理蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜后的電泳圖Fig.4SDS-PAGE of shrimp meat and butterfly shrimp and minced shrimp hydrolyzed by bromelain

2.3 蝦制品的過(guò)敏原性評(píng)價(jià)

作者構(gòu)建的ELISA檢測(cè)方法，利用前期研究的Tm致敏動(dòng)物模型獲得的針對(duì)過(guò)敏原Tm的含高濃度的IgE鼠源抗血清和含高濃度IgG的抗血清，利用該抗血清，評(píng)價(jià)了經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后的蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜樣品的過(guò)敏原性變化情況，其結(jié)果如表1所示。由表可知，對(duì)于蝦仁樣品，采用羊抗鼠IgE-HRP為二抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)，對(duì)于蝦仁樣本，單純的酶解法、超聲結(jié)合酶解法與對(duì)照組相比其OD值都無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜經(jīng)處理后的ELISA檢測(cè)結(jié)果（OD值，X±S.D.，n=9）Table 1OD values of tackled shrimp meat and butterfly shrimp and minced shrimp by ELISA（X±S.D.，n=9）

對(duì)于蝴蝶蝦仁，單純酶解法與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異，而超聲結(jié)合酶解法與對(duì)照組相比有極顯著的差異（P＜0.01），其過(guò)敏原性降低了21.05%，表明超聲結(jié)合酶解法的處理效果要明顯好于單純酶解法。對(duì)于蝦糜樣品，單純的酶解法或超聲結(jié)合酶解法與對(duì)照組相比均有顯著性差異，其OD值比對(duì)照組分別減少了30.70%和33.33%，說(shuō)明這兩種處理方法能夠明顯降低蝦糜樣品的過(guò)敏原性。比較蝴蝶蝦仁和蝦糜發(fā)現(xiàn)，在相同的處理方式下，單純酶解法處理的蝦糜樣品效果要好于蝴蝶蝦仁，呈極顯著性差異；超聲結(jié)合酶解法處理的蝴蝶蝦仁和蝦糜其過(guò)敏原性的降低程度無(wú)顯著性差異。綜上所述，作者所建立的超聲結(jié)合酶解法較適用于低過(guò)敏性蝴蝶蝦仁和蝦糜的制備。

3 結(jié)語(yǔ)

作者首先以富集的Tm樣本為模式蛋白，探討并建立了有效的消減Tm的酶解處理方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了經(jīng)該方法處理后的蝦仁、蝴蝶蝦仁和蝦糜制品中的Tm的過(guò)敏原性變化情況。結(jié)果表明菠蘿蛋白酶能夠有效消減蝦制品的過(guò)敏原性，不同的蝦制品有其不同程度的消減變化，進(jìn)一步的研究結(jié)果表明酶解法及超聲結(jié)合酶解法對(duì)于蝴蝶蝦仁和蝦糜的低過(guò)敏性有較強(qiáng)的消減作用，相比于蝦仁樣品消減效果較為顯著，具有較好的應(yīng)用可行性。作者研究結(jié)果不僅對(duì)蝦制品的低過(guò)敏性處理方法具有理論指導(dǎo)意義，更為蝦制品的低過(guò)敏性工藝提供了實(shí)際參考，也為開(kāi)發(fā)低過(guò)敏性蝦產(chǎn)品提供了方法，具有較好的應(yīng)用性與實(shí)際指導(dǎo)意義。

［1］Moreno F J.Gastrointestinal digestion of food allergens:Effectontheirallergenicity［J］.Biomed&Pharmacotherapy，2007，61（1）: 50-60.

［2］吳海明，胡志和.凡納濱對(duì)蝦過(guò)敏原酶法消減技術(shù)的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（19）:38-41.

WU Haiming，HU Zhihe，WANG Lijuan.Identification and enzymatic elimination of major allergens in Litopenaeus vannamei［J］. Food Science，2010，31（19）:38-41.（in Chinese）

［3］王念蓉，黎海芪.食物過(guò)敏嬰兒和健康兒腸道菌群分析［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18（2）:110-111.

WANG Nianrong，LI Haiqi.The analysis of intestinalm icroflora of infantswith food allergy and healthy infants［J］.Chinese Journal of Microecolog，2006，18（2）:110-111.（in Chinese）

［4］潘英，王如才，羅永巨，等.海水和淡水養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的分析比較［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，31（6）:828-834.

Pan Ying，Wang Rucai，Luo Yongju，et al.Analysis of the nutritive composition in muscle of marine cultured and fresh-water cultured penaeus vannamei［J］.Journal of Oceanuiversity of Qingdao（Natural Science），2001，31（6）:828-834.（in Chinese）

［5］胡雪瓊，張?jiān)?，夏杏洲，?一種即食熏制蝦仁的生產(chǎn)工藝研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2009（12）:30-34.

Hu Xueqiong，Zhang Zengqi，Xia Xingzhou，et al.The processing technology of instant fumigated shrimp meat［J］.Academic Periodical of Farm Products Processing，2009（12）:30-34.（in Chinese）

［6］王益群，陳直.蝦丸的工藝優(yōu)化研究［J］.食品工業(yè)，2011（12）:15-18.

Wang Yiqun，Chen zhi.Technology standard and process optimization research of shrimp balls［J］.Food Industry，2011（12）:15-18.（in Chinese）

［7］羅夢(mèng)良，錢名全.蝦仁加工廢棄的頭、殼的綜合利用［J］.淡水漁業(yè)，2003.33（6）:59-60.

Luo Mengliang，Qian Mingquan.Utilization of the discarded heads and shells in shrimp product processing［J］.Freshwater Fisheries，2003，33（6）:59-60.（in Chinese）

［8］薛惠琴，孫國(guó)榮，杭怡瓊.淺談蝦仁生產(chǎn)廢棄物的開(kāi)發(fā)利用［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2009，（2）:105-105.

Xue Huiqin，Sun Guorong，Su HangQiong.Introduction to the development and utilization of shrimp production waste［J］.Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2009，（2）:105-105.（in Chinese）

［9］Izquierdo F.J，Pe?as E，Baeza M.L，et al.Effects of combined microwave and enzymatic treatments on the hydrolysis and immunoreactivity of dairy whey proteins［J］.International Dairy Journal，2008，18（9）:918-922.

［10］Zeece M，Huppertz T，Kelly A.Effect of high-pressure treatment on in-vitro digestibility of［β］-lactoglobulin［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2008，9（1）:62-69.

［11］Pe?as E，Préstamo G，Polo F，et al.Enzymatic proteolysis，under high pressure of soybean whey:Analysis of peptides and the allergen Gly m 1 in the hydrolysates［J］.Food Chemistry，2006，99（3）:569-573.

［12］王麗娟，胡志和，周汛，等.南美白對(duì)蝦蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物過(guò)敏原消減效果研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（17）:263-266.

WANG Lijuan，HU Zhihe，ZHOU Xun，et al.Elimination of allergens in South American shrimp by protease hydrolysis［J］.Food Science，2010，31（17）:263-266.（in Chinese）

［13］吳海明，胡志和，王麗娟.凡納濱對(duì)蝦主要過(guò)敏原鑒定及酶法消減技術(shù)的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（17）:272-276.

WU Haiming，HU Zhihe，WANG Lijuan.Identification and enzymatic elimination of major allergens in Litopenaeus vannamei［J］. Food Science，2010，31（17）:272-276.（in Chinese）

［14］李慶麗，李振興，林洪，等.美拉德反應(yīng)中麥芽糖、葡萄糖對(duì)蝦過(guò)敏原活性影響的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，213（1）:79-81.

Li Qingli，Li Zhenxing，LIN Hong，et al.Study on the influence of maltose and glucose in Maillard reaction on the activity of the shrimp allergen［J］.Science and Technology of Food Industry，2009，213（1）:79-81.（in Chinese）

［15］Li Z X，Lin H，Cao L M，et al.The Influence of gamma irradiation on the allergenicity of shrimp（Penaeus vannamei）［J］.Journal of Food Engineering，2007，79（3）:945-949.

［16］Li Z X，Lin H，Cao L M，et al.Reduction of allergenic properties of shrimp（Penaeus Vannamei）allergens by high intensity ultrasound［J］.European Food Research and Technology，2006，223（5）:639-644.

［17］Li Z X，Lin H，Cao L M.Influence of ultrasonic treatment on the allergenic properties of shrimp（Penaeus vannamei）allergen［J］. Journal of Ocean University of China，2006，5（2）:115-118.

［18］聶君，楊哪，金征宇，等.不同加工處理方式對(duì)蛋清致敏的影響［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（4）:528-534. NIE Jun，YANG Na，JIN Zengyu，et al.Influence of different processings on egg white’s antigenicity［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（4）:528-534.（in Chinese）

［19］張瑋瑋，武彥文，歐陽(yáng)杰.酶解水提法從胡蘿卜中提取水溶性β-胡蘿卜素［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，201332（8）:854-860.

ZHANG Weiwei，WU Yanwen，OU Yanjie.Extraction of water-soluble β-carotene from carrots by enzymation hydrolysis［J］. Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（8）:854-860.（in Chinese）

［20］蔡秋鳳，王錫昌，劉光明，等.口蝦蛄主要過(guò)敏原原肌球蛋白的免疫活性［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34（3）:415-421.

CAI Qiufeng，WANG Xichang，LIU Guangming，et al.Studies on the Immunoreactivity of the major allergen tropomyosin in mantis shrimp［J］.Journal of Fisheries of China，2010，34（3）:415-421.（in Chinese）

［21］楊文鵬，王明春，楊留啟，等.玉米總蛋白質(zhì)提取技術(shù)和蛋白質(zhì)樣品濃度測(cè)定方法的比較［J］.種子，2010，29（12）:18-23.

YANG Wenpeng，WANG Mingchun，YANG Liuqi，et al.Comparison of methods for the extraction and concentration determination of total protein in maize［J］.Seed，2010，29（12）:18-23.（in Chinese）

［22］Lu Y，Ohshima T，Ushio H，et al.Immunological characteristics of monoclonal antibodies against shell fish major allergen tropomyosin［J］.Food Chemistry，2007，100（3）:1093-1099.（in Chinese）

［23］陳小文，堯榮鳳，李建春，等.油菜花粉過(guò)敏原的分析、鑒定與純化［J］.免疫學(xué)雜志，2011，27（3）:225-227.

CHEN Xiaowen，YAO Rongfeng，LI Jianchun，et al.Analysis，Characterization and purification of allergen in oilseed rape pollen［J］. Immunological Journal，2011，27（3）:225-227.（in Chinese）

［24］Shi L，Wang X C，Liu Y，et al.Rapid detection of shellfish major allergen tropomyosin using Superparamagnetic nanoparticlebased lateral flow immunoassay［J］.Advanced Materials Research，2011，（311-313）:436-445.

［25］Hermann Sch?gger.Tricine-SDS-PAGE［J］.Nature Protocols，2006，1（1）:16-22.

Studies on the Reduction of the Major Allergen Tropomyosin in Pacific White Shrimp

GAO Yongyan1，CHEN Qinzai1，GUO Guiping2，LU Ying*1，SUN Jiayi1，PAN Yingjie1
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for AquaticProducts on Storage andPreservation（Shanghai），Ministry of Agriculture，Shanghai 201306，China；2.Nantong Entery-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nantong 226006，China）

The reduction of tropomyosin（Tm），the major allergen in Pacific white shrimp（PenaeusVannamei），wasstudiedusingenzymolysisandthecombinationofultrasound andenzymolysis，respectively.First，the enzymatic hydrolysis of shrimp Tm with bromelain wasoptimized by measuring the effects of changes in enzyme activity/substrate mass ratio，incubation time and temperature of hydrolysis.The changes of Tm allergenicity in peeled prawns，butterfly shrimp and minced shrimp was comparatively studied by three methods of hydrolysis.The antiserum of sensitization animal model for shrimp allergen Tm was detected using enzyme-linkedimmunosorbent assay（ELISA）.The results showed the allergenicity was not significant（P＞0.05）when treated with enzymolysis or combining with ultrasound.The allergenicity of the butterfly shrimp treated by ultrasound and bromelain was reduced to 21.05%，while the allergens of the minced shrimp hydrolyzed using enzymolysis or the combination of ultrasound andenzymolysiswere reduced to 30.70%and 33.33%，respectively.In conclusion，the developed enzymolysis methods，ie.，the enzymolysis and the combination of ultrasound andenzymolysis，can effectively reduce shrimp Tm allergenicity.They have potential applications in producing hypoallergenic shrimp，such as hypoallergenic butterfly shrimp or hypoallergenic minced shrimp.

allergenicity，tropomyosin，reduce，bromelain

Q511

A

1673—1689（2015）04—0413—07

2014-07-14

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2009）第6-1號(hào)）；江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（2013kj34）；上海海洋大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（B1-5106-12-0049）；上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心資助項(xiàng)目（11DZ2280300）；上海高校一流學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目。

*通訊作者：盧瑛（1971-），女，上海人，副教授，主要從事食物過(guò)敏原、食品安全檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail:y-lu@shou.edu.cn