黃武寧，王嘉宇，肖靜

（1.義烏市海之納生物工程有限公司，浙江義烏 322000；2.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210093）

應(yīng)用脫枝酶提取大米蛋白質(zhì)的研究

黃武寧1，王嘉宇2，肖靜1

（1.義烏市海之納生物工程有限公司，浙江義烏 322000；2.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210093）

為了提高大米蛋白提取的效率及質(zhì)量，將一種新型的淀粉水解酶-脫枝酶引入大米蛋白的酶法提取工藝中。使用高效體積排阻色譜（HPSEC）分析相對分子質(zhì)量分布表明大米淀粉經(jīng)脫枝酶作用后重均相對分子質(zhì)量降低明顯；同時(shí)氫譜核磁共振圖譜顯示脫枝酶可將大米淀粉的α-1，6-糖苷鍵徹底水解，為糖化酶的水解提供了良好條件。將脫枝酶與糖化酶協(xié)同作用于大米制糖后的液化米渣，最終可將大分子的糊精完全水解為水溶性的寡糖從而除去，較單獨(dú)使用糖化酶總糖的去除率提高39.7%。所獲得大米粗蛋白的總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到90.58%，純度較傳統(tǒng)酶法提取大為提高。

大米蛋白；酶法提??；脫枝酶

大米中含有約質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的淀粉和7%的蛋白質(zhì)［1］，其中的淀粉是人類主要食物來源之一。大米除了為人直接使用外，還有相當(dāng)一部分用于制糖，與玉米、馬鈴薯、小麥等同為主要的制糖原料作物。大米制糖后會(huì)產(chǎn)生約含有蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%左右的廢渣，國內(nèi)主要將其簡單處理后作為飼料使用，附加值極低。近年來的研究表明，大米蛋白的生物價(jià)（B.V.）和蛋白價(jià)（P.V.）在各種糧食蛋白中均居第一位［2］，含有人體所需的全部氨基酸，是一種完全蛋白質(zhì)；大米又是唯一可以免于過敏實(shí)驗(yàn)的谷物，這些使得大米蛋白被公認(rèn)為優(yōu)質(zhì)食品蛋白質(zhì)，尤其適合用于保健品和嬰幼兒食品中。

傳統(tǒng)的大米蛋白提取方式是堿法提?。?］。其優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單，提取率高，蛋白質(zhì)收率可達(dá)90%以上。但由于高堿性環(huán)境會(huì)引起分子間交叉耦合和重排，破壞多種氨基酸，甚至產(chǎn)生毒性物質(zhì)Lysinoalnine等［4］。相比較堿法提取，通過使用淀粉酶水解淀粉而提取大米蛋白質(zhì)的酶法提取條件更為溫和，產(chǎn)品也更為安全。隨著酶制劑研究的進(jìn)展，越來越多具有優(yōu)異性能的淀粉水解酶被開發(fā)出來，這些新型酶制劑的應(yīng)用，將會(huì)使大米蛋白質(zhì)酶法提取的效率及產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)一步提高。

脫枝酶能夠水解淀粉中的α-1，6-糖苷鍵，當(dāng)它與其它淀粉酶協(xié)同作用時(shí)可實(shí)現(xiàn)淀粉的徹底水解［5，6］。作者研究了一種新型脫枝酶對大米淀粉的作用機(jī)制，優(yōu)化了其與其他酶制劑協(xié)同作用的工藝條件，為大米蛋白質(zhì)的酶法提取工藝中引入淀粉脫枝步驟提供了理論依據(jù)和應(yīng)用實(shí)例。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：大米：采用東北大米；液化酶，糖化酶：江蘇奧谷生物工程公司提供；NaOH，HCl等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 600高效液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；ICS-5000離子色譜儀：美國Dionex公司產(chǎn)品；液相色譜系統(tǒng)Agilent 1100 Series：美國Agilent公司產(chǎn)品；AVANCE III 400 MHz全數(shù)字化核子共振譜儀：瑞典Bruker公司產(chǎn)品；UV-2100分管光度計(jì)：上海尤尼科儀器有限公司產(chǎn)品；SLSC超級恒溫水油槽：南京順流有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米渣原料的預(yù)處理及酶水解反應(yīng)大米制糖后的殘?jiān)?jīng)過烘干后，過60目篩篩分獲得米渣樣品。將米渣于緩沖液中配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的溶液，分別使用液化酶10 U/g、糖化酶10 U/g、脫枝酶10 U/g及其中幾種酶的組合，于50℃pH 6.0的條件下酶解。反應(yīng)結(jié)束后滅酶，離心獲得上清組分后以待分析。

1.3.2 分析條件高效體積排阻色譜（HPSEC）條件：Ultrahydrogel Linear 300 mm×7.8 mm色譜柱；流動(dòng)相：0.1 mol/L NaNO3；流量：0.9 mL/min；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：20 μL。

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（PADHPAEC）條件：CarboPac PA-200 3 mm×150 mm色譜柱；ED40電化學(xué)檢測器；流動(dòng)相：0.25 mol/L NaOH（A），1 mol/L NaAc+0.1 mol/L NaOH（B）+H2O（A），流動(dòng)相比例見表1；流量：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 高效離子交換色譜分離條件Table 1Mobile phase composition of HPAEC

氫核磁共振譜（1H-NMR）條件：樣品溶于D2O中配制成10 mg/mL的溶液并于70℃攪拌過夜，使得淀粉分子與D2O充分交換羥基質(zhì)子。檢測溫度：60℃；5 mm探頭定量；以4、4-二甲基-4-硅代戊磺酸鈉（DSS）作為內(nèi)標(biāo)；為保證最優(yōu)信噪比使用每個(gè)樣品調(diào)諧探頭；使用Bruker UXNMR軟件處理原始一維數(shù)據(jù)經(jīng)傅里葉變換得到的圖譜。

寡糖的高效液相色譜（HPLC）條件；Waters Xbridge BEH Amide 150 mm×D2.1 mm色譜柱；示差折光檢測器；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)70%乙腈；流量：1.0 mL/min；柱溫：30oC；進(jìn)樣量：50 μL。以葡萄糖，麥芽糖及DP 3～5的麥芽寡糖為標(biāo)準(zhǔn)物，定量分析產(chǎn)物中的寡糖成分。

蛋白質(zhì)的測定依照凱式定氮法［7］；水分的測定依照兩次烘干測定法［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫枝酶作用對淀粉相對分子質(zhì)量分布的影響

由圖1可知，聚合態(tài)的大米淀粉經(jīng)過HPSEC分離成單一峰，重均相對分子質(zhì)量（Mw）約為3 141 000。而脫枝酶作用0.5 h后的樣品呈現(xiàn)了兩個(gè)峰，其中一個(gè)仍為聚合態(tài)的大分子淀粉，Mw約為2 041 000；另一個(gè)峰為相對分子質(zhì)量較小的線性葡聚糖及寡糖，Mw約為44 000，兩峰之間分布著Mw約為10 000至600 000的大分子線性葡聚糖。

圖1 大米淀粉經(jīng)脫枝酶水解前后的HPSEC圖譜Fig.1Size exclusion HPLC of rice starch digested by debranching enzymes.A.digestion time 0 h；B.digestion time 1 h.

圖2為大米淀粉及其脫枝酶水解物的氫核磁共振譜。由圖中可明顯看出大米淀粉中位于化學(xué)位移δ 5.35×10-6處的α-1，4糖苷鍵與位于化學(xué)位移δ 4.94×10-6處的α-1，6糖苷鍵的比例為21:1。經(jīng)過脫枝酶作用，大米淀粉的α-1，6糖苷鍵被完全降解，轉(zhuǎn)化成具有α型或β型還原末端的葡聚糖或小分子寡糖（其化學(xué)位移分別位于δ 5.21和4.65×10-6）；同時(shí)，作用前后的α-1，4糖苷鍵的無變化，這表明該脫枝酶可徹底水解大米淀粉的α-1，6糖苷鍵分支點(diǎn)處的α-1，6糖苷鍵，而對α-1，4糖苷鍵無作用。以上結(jié)果初步揭示了該脫枝酶對于大米淀粉及同類底物的作用機(jī)制：從淀粉分子內(nèi)部和外部隨機(jī)及專一地作用于分支點(diǎn)處的α-1，6糖苷鍵，生成直鏈淀粉和麥芽寡糖，其最小水解單位為2-3個(gè)葡萄糖殘基；為脫枝酶應(yīng)用于大米蛋白質(zhì)的提取過程提供了理論依據(jù)。Harada［9］應(yīng)用凝膠排阻層析分析了Pseudomonas脫枝酶對于直鏈淀粉的脫枝機(jī)制。結(jié)果顯示足量的脫枝酶可完全水解聚合態(tài)支鏈淀粉，生成線性葡聚糖，支鏈葡聚糖以及少量寡糖，與本研究中所使用的芽孢桿菌脫枝酶性質(zhì)相近。大米蛋白質(zhì)的提取首先是一個(gè)淀粉的水解過程。現(xiàn)有的酶法提取工藝中通過加入液化酶將大米淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性的寡糖及小分子糊精從而除去［10］。由于液化酶隨機(jī)內(nèi)切的特性，其單獨(dú)使用在短時(shí)間內(nèi)無法將大分子不溶性糊精徹底水解。而脫枝酶的添加卻可以迅速除去淀粉分子的支鏈，從而顯著提升了液化酶水解的效率，足量的脫枝酶與液化酶協(xié)同作用可實(shí)現(xiàn)大米淀粉的完全水解。

圖2 大米淀粉經(jīng)脫枝酶水解前后的氫譜圖譜Fig.21H-NMR spectrum of rice starch.A.Native rice starch；B.debranching enzyme digested rice starch.

2.2 脫枝酶與液化酶和糖化酶協(xié)同作用對淀粉相對分子質(zhì)量的影響

大米經(jīng)過粉碎后添加液化酶于高溫下水解制糖，殘留的米渣中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)質(zhì)約為50%；其余成分主要為小分子的糊精，其相對分子質(zhì)量分布如圖3所示。這部分糊精的Mw約為1 348，由于支鏈的存在，液化酶很難將這部分糊精徹底水解。

圖3 大米淀粉制糖殘?jiān)暮獺PSEC圖譜Fig.3Size exclusion HPLC of the residual dextran of rice starch saccharification.

表2為大米蛋白提取過程中各樣品經(jīng)HPSEC分離后主要組分的相對分子質(zhì)量分布數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在米渣中加入脫枝酶后，樣品中小分子糊精的數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）及Mw都顯著降低；這一方面顯示了液化殘留極限糊精中支鏈成分的大量存在，另一方面也體現(xiàn)出脫枝酶對于淀粉徹底水解的關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步降低殘留糊精的相對分子質(zhì)量以便將其與蛋白分離，在液化米渣脫枝后的樣品中加入了糖化酶。糖化酶從直連糊精的外側(cè)以葡萄糖為單位逐步水解，可將淀粉的相對分子質(zhì)量降至最低程度。結(jié)果顯示，在脫枝酶與糖化酶的協(xié)同作用下，液化極限糊精幾乎全部轉(zhuǎn)化為可溶性的寡糖，18 h后的反應(yīng)產(chǎn)物中主要成分的Mw僅為356，表明此時(shí)糊精已被徹底水解。

表2 大米蛋白提取過程中各樣品的相對分子質(zhì)量分布Table 2Molecular weight distribution of different samples in rice protein extraction process

2.3 脫枝酶與液化酶和糖化酶協(xié)同作用對大米淀粉去除的影響

將液化米渣以pH 6.0的磷酸緩沖液配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液，在其中分別單獨(dú)加入糖化酶50 U/g糖化以及糖化酶50 U/g和脫枝酶50 U/g協(xié)同作用。于50℃反應(yīng)4 h后檢測上清液中水解釋放出的總糖質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖4所示。液化米渣溶液中總糖質(zhì)量濃度為34 g/L，其中上清液中的游離總糖質(zhì)量濃度為8.6 g/L。加入糖化酶和脫枝酶協(xié)同作用后，上清液中總共釋放出32.7 g/L的總糖，較單獨(dú)使用糖化酶提高了39.7%，基本實(shí)現(xiàn)了液化米渣中淀粉質(zhì)物質(zhì)的徹底消除。

圖4 不同酶制劑作用對大米淀粉總糖水解的影響Fig.4Effect of enzymes on reducing sugar released in saccharification

2.4 脫枝酶與液化酶和糖化酶協(xié)同作用對大米蛋白提取率的影響

將液化米渣以pH 6.0的磷酸緩沖液配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液，在其中分別單獨(dú)加入糖化酶糖化以及糖化酶和脫枝酶協(xié)同作用。于50℃反應(yīng)4 h后檢測沉淀中的總氮含量，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，液化米渣中的總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為57.12%。作為大米蛋白的提取原料，此時(shí)主要的雜質(zhì)為大分子的糊精，由于其與大米蛋白彼此緊密纏繞而很難直接分離。另一方面，由于液化過程的高溫造成了大米蛋白的變性和結(jié)構(gòu)壓縮，進(jìn)一步提高了其提取難度。糖化酶和脫枝酶的水解作用可以使蛋白從糊精中的包裹中解放出來，釋放出蛋白酶的作用位點(diǎn)以便其進(jìn)一步提純。最終水解后的沉淀中總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到90.58%，得到了純度極高的大米蛋白質(zhì)。

圖5 不同酶制劑作用對大米蛋白提取率的影響Fig.5Effect of enzymes on yield of rice protein extraction

3 討論

歐美發(fā)達(dá)國家很早就開展了食用大米的純蛋白質(zhì)粉的開發(fā)，形成了穩(wěn)定的市場規(guī)模。目前美國亨氏公司的各種細(xì)分配方蛋白質(zhì)粉占據(jù)了市場中的大部分份額，年產(chǎn)值超過100億人民幣。與之相比，國內(nèi)企業(yè)的蛋白質(zhì)粉制品競爭力不足的最大原因就在于生產(chǎn)技術(shù)落后，無法加工出高品質(zhì)的蛋白粉產(chǎn)品。近年來，受瘋牛病，口蹄疫和禽流感的侵?jǐn)_，國內(nèi)外對新蛋白質(zhì)來源的需求愈加迫切。大米蛋白質(zhì)因其完善的營養(yǎng)成分和低過敏性的特質(zhì)成為最具開發(fā)前景的食用蛋白質(zhì)品種。在現(xiàn)有的大米蛋白質(zhì)生產(chǎn)工藝中，堿法提取收率高，但部分營養(yǎng)成分遭到破壞，傳統(tǒng)的液化+糖化提取又無法保證產(chǎn)品的純度。為此，將新型酶制劑-脫枝酶引入大米蛋白的酶法提取工藝中，分別從理論及實(shí)際應(yīng)用考察了該酶對于大米蛋白質(zhì)提取的影響。結(jié)果顯示脫枝酶在液化和糖化過程中均能以很少的添加量帶來大米淀粉水解率的顯著提高，從而提升了大米蛋白質(zhì)的提取效率及純度。

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Application of Debranching Enzyme for the Extraction of Rice Protein

HUANG Wuning1，WANG Jiayu2，XIAO Jing1
（1.Yiwu Highstar Biotechnology Co.Ltd.，Yiwu 322000，China；2.School of Life Scjence，Nanjing University，Nanjing 210093，China）

Debranching enzyme was used to enhance the extraction efficiency and product quality of rice protein.A significant decrease in molecular weight was detected by HPSEC for rice starch digested by debranching enzyme and the1H-NMR analysis proved that the enzyme completely hydrolyzed α-1，6-linkages，which facilitated the following function of glucoamylase.Debranching enzyme together with α-amylase and glucoamylase could entirely hydrolyze the dextrin in liquefied rice dreg after sugar processing into water soluble oligosaccharides，which increased the removal rate by 38.9%compared with the processing only through glucoamylase.The total nitrogen content of the crude protein reached up to 90.58%，which was higher than that obtained by the traditional methods.

rice protein，enzymatic extraction，debranching enzyme

Q819

A

1673—1689（2015）04—0443—05

2014-09-25

黃武寧（1964-），男，浙江東陽人，高級工程師，主要從事大米深加工技術(shù)研究。E-mail:1977513347@qq.com