王棐，張海玲，光翠娥，桑尚源，楊紅飛

（食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫 214122）

大豆皂苷Ⅰ抑制唾液酸轉(zhuǎn)移酶的分子機理研究

王棐，張海玲，光翠娥*，桑尚源，楊紅飛

（食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫 214122）

從晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，應用分子對接和結(jié)合自由能分析，研究了唾液酸轉(zhuǎn)移酶（Sialyltransferase，ST）與其抑制劑大豆皂苷Ⅰ的相互作用機理，確定了它們的作用位點、作用力類型及大小。結(jié)果表明：范德華力和靜電相互作用是復合物形成的主要驅(qū)動力，極性溶劑化能則起相反作用；8個氨基酸殘基Gly149、Ser151、Met172、Asn173、Phe292、Trp300、His301、Ser325與大豆皂苷Ⅰ形成疏水相互作用，11個氨基酸殘基Asn150、Tyr194、Ser271、Thr272、Gly273、Ile274、Gly291、Gly293、His302、Glu305、Glu324與大豆皂苷Ⅰ形成氫鍵作用；大豆皂苷Ⅰ占據(jù)了ST與底物胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經(jīng)氨酸相互作用的12個氨基酸殘基中的11個，可起到競爭性抑制的作用。

唾液酸轉(zhuǎn)移酶；大豆皂苷Ⅰ；分子對接；結(jié)合自由能分析

唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST）是一類糖基轉(zhuǎn)移酶，它以胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經(jīng)氨酸（CMP-β-N-acetylneuramic acid，CMP-Neu5Ac）為底物，將唾液酸殘基Neu5Ac以α-2，3，α-2，6或α-2，8糖苷鍵的形式轉(zhuǎn)移至新的糖基受體上形成唾液酸糖苷化合物［1］。細胞表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化修飾在許多生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如致癌性轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移和入侵［2］。

ST的底物單一，唾液酸供體僅為CMP-Neu5Ac［1］，所以，迄今為止，ST抑制劑的設計主要是基于供體CMP-Neu5Ac的化學結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在也有研究是基于CMP-Neu5Ac過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)和糖基受體的結(jié)構(gòu)進行設計以及通過隨機篩選得到［3］。然而，由于低膜通透性這些化合物很難進入細胞或組織［3］。Chi-Yue Wu［2］等人發(fā)現(xiàn)大豆皂苷Ⅰ對ST中的ST3Gal I有強烈的抑制作用，抑制常數(shù)（K1）為2.3 μmol/L，作為競爭性抑制劑（相對底物CMP-Neu5Ac），大豆皂苷Ⅰ對ST3Gal I的親和性是CMP-Neu5Ac和CMP的20和25倍，并且大豆皂苷Ⅰ只對ST起作用，對其他的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶幾乎不起抑制作用。細胞水平上，大豆皂苷Ⅰ能抑制高轉(zhuǎn)移黑色素瘤細胞表面唾液酸的生成［4］，也能抑制MFC-7乳腺癌細胞ST的活性、ST3GalⅣmRNA的表達及唾液酸的分泌［5］。

ST是藥物設計的重要靶點，作者采用分子對接及結(jié)合自由能計算的方法研究大豆皂苷Ⅰ對ST的抑制作用，確定他們的作用力類型、結(jié)合的關(guān)鍵位點以及復合物的結(jié)合自由能，提高了實驗效率，減少不必要的消耗，為ST抑制劑的合理藥物設計提供理論依據(jù)，也為大豆皂苷Ⅰ的開發(fā)利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 受體ST與配體大豆皂苷Ⅰ分子的獲取

ST的三維結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb/），PDB ID：2WNB，分辨率為0.155 nm，共有298個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為34 748.3，小分子配體為C8H15NO6、C9H14N3O8P、C6H6NO3和C6H12O6，利用北京創(chuàng)騰科技有限公司的Discovery Studio 2.5（DS）軟件去掉小分子配體和水分子并加氫后得到ST三維結(jié)構(gòu)并作為受體用于后續(xù)的對接過程。大豆皂苷Ⅰ（圖1）的三維結(jié)構(gòu)取自chemicalbook網(wǎng)站庫（http://www.chemicalbook.com），分子式為C48H78O18，相對分子質(zhì)量為943.12，采用PRODRG網(wǎng)站（http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgibin/prodrg）對大豆皂苷Ⅰ的分子結(jié)構(gòu)進行加電荷和構(gòu)象優(yōu)化等預處理。

圖1 大豆皂苷Ⅰ的分子結(jié)構(gòu)Fig.1Molecular structure of soyasaponinⅠ

1.2 ST與大豆皂苷Ⅰ的分子對接

以ST為對接受體，以大豆皂苷Ⅰ為對接配體，以ST的活性位點Gln108、Asn150、Met172、Asn173、Tyr194、Clu196、Phe212、Tyr233、Arg269、Thr272、Gly273、Gly293、Trp300、His302、Val318、His319形成的區(qū)域為中心，通過DS軟件包中的Libdock模塊，在半徑為1.65 nm內(nèi)的范圍內(nèi)（圖2）進行受體與配體的分子對接。每產(chǎn)生一個構(gòu)象就進行一次分子對接，配體分子在受體口袋中可能的構(gòu)象模式采用Libdock模塊進行收集。根據(jù)LibDock綜合得分LibDockscore和最終的均方根偏差RMSD值，分析和評估ST與大豆皂苷Ⅰ的相互作用。取打分最好以及底物骨架重合性較高的復合物構(gòu)象，運用DS程序包，采用CHARMm力場，添加抗衡離子溶劑化（Solvation）后，對對接復合物的空間結(jié)構(gòu)進行兩次能量優(yōu)化，electrostatic參數(shù)設置為Particle，Mesn，Ewald。優(yōu)化分成2步完成：先限制蛋白質(zhì)和抑制劑的結(jié)構(gòu)，只優(yōu)化水分子；再去除限制，優(yōu)化整個體系。每個步驟都先采用最陡下降法（Steepest Descent）優(yōu)化500步，再采用共軛梯度法（Conjugate Gradient）優(yōu)化1 000步。基于優(yōu)化后的空間結(jié)構(gòu)用Ligplot+軟件統(tǒng)計受體中與配體產(chǎn)生氫鍵及疏水作用的氨基酸殘基，并分析復合物的空間作用力。

1.3 對接復合物的結(jié)合自由能計算

基于優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)，用分子力學泊松-波爾茲曼表面積法（molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA）計算對接復合物的結(jié)合自由能（binding free energy，ΔGbind）［6］。ΔGbind值越低說明受體與配體之間的親和力越高［7］。MM-PBSA法將體系自由能分解為真空下分子內(nèi)能、溶劑化能和由構(gòu)象變化引起的熵變3部分，能更為直觀的分析各種相互作用的貢獻。結(jié)合自由能（ΔGbind）計算過程為：

圖2 ST與大豆皂苷Ⅰ分子對接的活性區(qū)域圖Fig.2Active zone of ST docking with soyasaponinⅠ

其中Gcomplex、Greceptor和Gligand分別為復合物、受體和配體的自由能。復合物、受體或配體的自由能由液相和氣相兩部分組成的，液相部分的自由能為溶劑化能Gsolv，主要包括極性溶劑化能GPB和非極性溶劑化能GSUR，用DS中的程序包計算，Implicit Solvent Model參數(shù)設置為Poisson Boltzmann with non-polar Surface Area，electrostatic參數(shù)設置為Spherical Cutoff；氣相部分的自由能包含內(nèi)能EMM和熵TSMM，EMM為整個分子力學能，Eelec和EvdW分別為氣相中分子靜電相互作用和范德華能，用DS中的程序包計算，Implicit Solvent Model參數(shù)設置為None，electrostatic參數(shù)設置為Spherical Cutoff。因為TSMM值的變化對結(jié)合自由能的影響非常小，所以一般情況下可以忽略此數(shù)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子對接總體結(jié)果

從晶體結(jié)構(gòu)看出，ST3Gal-I按結(jié)構(gòu)折疊方式屬于GTA類，有12個α螺旋，7個β折疊，3個二硫鍵（Cys62-Cys67、Cys65-Cys142、Cys145-Cys284）［8］。Libdock模塊收集的大豆皂苷Ⅰ與ST活性口袋結(jié)合的可能構(gòu)象顯示，配體與受體蛋白的結(jié)合方式共有90種，其中得分超過100的有85種，LibDock綜合得分最高為186.2表明，大豆皂苷Ⅰ和ST活性區(qū)域匹配性較好（LibDockscore＞100）。以打分最高的對接結(jié)果為研究對象（圖3，（a）），將其與結(jié)合有糖基受體Galβ1，3GalNAcα-PhNO2和產(chǎn)物CMP的ST3Gal-I（圖3，（b））、結(jié)合有糖基受體Galβ1，3GalNAcα-PhNO2和底物CMP-Neu5Ac的ST3Gal-I（圖3，（c））、結(jié)合有糖基受體Galβ1，3GalNAcα-PhNO2和大豆皂苷Ⅰ的ST3Gal-I進行比較（圖3，（d）），結(jié)果表明大豆皂苷Ⅰ主要與ST中由氨基酸殘基Asn150、Met172、Asn173、Gly273、Gly293、Trp300和His302形成的活性區(qū)域產(chǎn)生相互作用，這類似于CMP-Neu5Ac與ST的作用，并且發(fā)現(xiàn)糖基受體的存在幾乎不影響大豆皂苷Ⅰ和ST活性區(qū)域的結(jié)合。

圖3 ST與配體分子對接示意Fig.3Molecular docking schematic diagram of ST andligands

2.2 大豆皂苷Ⅰ與ST形成的氫鍵和疏水作用分析

圖4為用Ligplot+軟件顯示的對接后配體與受體相互作用的二維圖。

圖4 ST和大豆皂苷Ⅰ分子間氫鍵和疏水相互作用分析Fig.4Hydrogen bond and hydrophobic interactions between ST and soyasaponinⅠ

通過圖4分析可得，ST中8個氨基酸殘基Gly149、Ser151、Met172、Asn173、Phe292、Trp300、His301、Ser325與大豆皂苷Ⅰ形成疏水相互作用，11個氨基酸殘基參與形成氫鍵作用（表1）。其中氨基酸Asn150、Gly273、Gly293也是CMP-Neu5Ac及CMP與ST形成氫鍵的重要殘基［8］，Ile274、Gly291、Glu305也可影響CMP與ST的作用，Thr194、Ser271、Ser272也可影響Gal與ST的作用。ST與大豆皂苷Ⅰ的氫鍵和疏水作用結(jié)果表明，大豆皂苷Ⅰ能有效阻礙CMP-Neu5Ac與ST的作用。

表1 ST和大豆皂苷I的氫鍵分析Table 1Hydrogen bondsbetween ST and soyasaponin I

2.3 復合物的比較

通過Ligplot+軟件將大豆皂苷Ⅰ以及CMPNeu5Ac分別與ST的對接結(jié)果進行比較［9］（圖5），發(fā)現(xiàn)CMP-Neu5Ac與ST的12個氨基酸殘基存在相互作用，其中11個氨基酸殘基Asn150、Ser151、Met172、Asn173、Tyr194、Thr272、Gly273、Phe292、Gly293、Trp300、His301在ST與大豆皂苷Ⅰ、ST與CMPNeu5Ac的結(jié)合過程中都參與了作用，并且CMPNeu5Ac與ST分子對接的LibDock綜合得分最高為143.5，得分超過100的結(jié)合方式有73種，說明大豆皂苷Ⅰ能有效阻止CMP-Neu5Ac與ST的結(jié)合。通過圖6看出，大豆皂苷Ⅰ在空間位置上也能阻礙CMP-Neu5Ac與ST的結(jié)合。

圖5 大豆皂苷I-ST與CMP-Neu5Ac-ST相互作用細節(jié)比對Fig.5Interaction comparison between soyasaponin IST and CMP-Neu5Ac-ST

圖6 大豆皂苷I與CMP-Neu5Ac在ST活性口袋中的空間位置Fig.6Spatial superposition of soyasaponin I and CMP-Neu5Ac in the active site of ST

2.4 大豆皂苷Ⅰ與ST復合物的結(jié)合自由能計算結(jié)果

結(jié)合自由能反映了受體和配體結(jié)合的穩(wěn)定性［10］。對大豆皂苷Ⅰ和ST進行分子對接和優(yōu)化后，按照公式（1）對對接復合物的結(jié)合自由能進行計算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆皂苷Ⅰ和ST的結(jié)合自由能（ΔGbind）為-209 kJ/mol，表明大豆皂苷Ⅰ和ST結(jié)合穩(wěn)定。

圖7 結(jié)合自由能各項能量示意圖Fig.7Each energy contributiong value in binding free energy

通過對比圖7中結(jié)合自由能各項能量的貢獻值可以看出，在大豆皂苷Ⅰ和ST形成的復合物中，ΔEvdW，ΔEelec和ΔGSUR均為負值，表明范德華力、靜電相互作用和非極性溶劑化能對結(jié)合自由能都起到促進作用，而極性溶劑化能很大程度上表現(xiàn)為阻礙ST和大豆皂苷Ⅰ的結(jié)合。ΔEvdW和ΔEelec在ΔGbind中占有主導地位，表明范德華力和靜電相互作用對于大豆皂苷Ⅰ和ST之間的結(jié)合能作用貢獻比較大（＞90%），但是較強的極性溶劑化能可抵消部分作用力，阻礙大豆皂苷Ⅰ和ST的結(jié)合。

3 結(jié)語

對大豆皂苷I與ST進行分子對接，預測了ST與大豆皂苷I相互作用的模式，得到的復合物結(jié)果表明：8個氨基酸殘基與大豆皂苷I形成疏水相互作用，11個氨基酸殘基與大豆皂苷I形成氫鍵作用；結(jié)合自由能為-209 kJ/mol，范德華力和靜電相互作用是復合物形成的主要驅(qū)動力，極性溶劑化能不利于復合物的形成；大豆皂苷I相對底物是ST的競爭性抑制劑。

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Mechanism of Interaction between Sialyltransferase and Its Inhibitory SoyasaponinⅠ

WANG Fei，ZHANG Hailing，GUANG Cuie*，SANG Shangyuan，YANG Hongfei
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The molecular mechanism for the binding sites，driving forces and the interaction intensity between sialyltransferase（ST）and soyasaponin I was investigated by molecular docking and free energy calculation based on the crystal structure.The van der Waals force and electrostatic interaction were considered as the main driving forces，while polar solvation energy behaved in an opposite manner.The hydrophobic interaction was formed between soyasaponin I and eight amino acid residues，i.e.，Gly149，Ser151，Met172，Asn173，Phe292，Trp300，His301，and Ser325.Hydrogen bonding was found between soyasaponin I and eleven amino acid residues，including Asn150，Tyr194，Ser271，Thr272，Gly273，Ile274，Gly291，Gly293，His302，Glu305，and Glu324.Soyasaponin I was a competitive inhibitor which occupied 11 of the 12 amino acid residues that accommodated the substrate CMP-β-N-acetylneuramic acid.These results provide a theoretical basis for the development and utilization of soyasaponin I as a ST inhibitor.

sialyltransferase，soyasaponin I，molecular docking，free energy calculation

R914.2

A

1673—1689（2015）04—0355—06

2014-07-15

國家自然科學基金項目（31201289）；江南大學大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（012011342）。

*通訊作者：光翠娥（1976-），女，湖北仙桃人，工學博士，副教授，主要從事食品營養(yǎng)與功能因子研究。E-mail：guang1226@hotmail.com。