霍永久，占今舜，金曉君，趙國琦

（揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009）

Flavourzyme酶水解蛋清蛋白的工藝研究

霍永久，占今舜，金曉君，趙國琦

（揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009）

以水解度和蛋白質(zhì)殘留量為指標，研究溫度、pH、酶用量及蛋清濃度對Flavourzyme酶解蛋清蛋白的影響，并通過正交試驗來確定其最佳工藝。結(jié)果是溫度55℃、pH6.5、加酶量為質(zhì)量分數(shù)6%、蛋清料液質(zhì)量體積比1 g：5 mL為最佳工藝參數(shù)。在該條件下，6 h酶解物的蛋白質(zhì)殘留率為27.68%，水解度為38.75%，水解物的相對分子質(zhì)量大部分集中在300以下，即主要以游離氨基酸及二肽形式存在。

蛋清蛋白；酶水解；蛋白酶

在我國，蛋品深加工的比例只占禽蛋總量的0.7%～1.0%左右。然而，在發(fā)達國家，已利用蛋品提取多種有效成分應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及保健品等行業(yè)。蛋清蛋白質(zhì)序列中存在具有生物活性的肽段，用適當?shù)牡鞍姿饷缚蓪⑦@些生物活性肽釋放出來并發(fā)揮生理調(diào)節(jié)作用，如具有抗菌活性、降血壓、降低膽固醇、抗氧化活性等功能［1-4］。目前，國內(nèi)外已有利用蛋清蛋白肽液生產(chǎn)功能性飲料，如利用鵪鶉蛋清多肽制作保健飲料［5］。Flavourzyme酶是由經(jīng)過選育的米曲霉菌種發(fā)酵而獲得，其包括內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性，是一種用于在中性或微酸性條件下水解蛋白質(zhì)的真菌蛋白酶/肽酶的復合體［6］。Flavourzyme能夠水解肽鏈末端顯苦味的疏水氨基酸，可用來脫除苦味蛋白水解液的苦味，同時還可以徹底水解蛋白質(zhì)，增進和改進水解液的風味［7］。作者擬采用Flavourzyme蛋白酶酶解雞蛋清蛋白，對水解溫度、pH、酶用量及蛋清濃度幾個水解參數(shù)進行優(yōu)化，探索適宜的水解條件，為進一步生產(chǎn)蛋清蛋白活性肽提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞蛋：市售新鮮雞蛋；Flavourzyme蛋白酶：諾維信生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 600高效液相色譜儀：Waters公司產(chǎn)品；Ag1100安捷倫：安捷倫公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶水解蛋清蛋白的工藝流程新鮮雞蛋（洗凈，消毒）→分離蛋清和蛋黃→稀釋蛋清→95℃加熱變性20 min→調(diào)節(jié)pH→酶解反應(yīng)→終止酶解反應(yīng)

1.3.2 單因素試驗在單因素試驗中，分別研究酶解的溫度、pH、酶用量及蛋清濃度對水解雞蛋清蛋白反應(yīng)的影響，以水解度為指標，確定適宜的酶解條件。

1.3.3 正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)殘留率和水解度為指標，對水解溫度、pH、Flavourzyme酶用量和蛋清濃度4個因素進行正交設(shè)計，來確定最佳水解工藝參數(shù)，因素水平設(shè)計如表1所示。

表1 L9（3）4正交試驗設(shè)計Table 1L9（3）4orthogonal design

1.4 試驗指標測定

1.4.1 水解度及蛋白殘留率總氮含量由凱式半自動定氮儀測得，方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》。

氨基氮含量由甲醛滴定法測得。準確吸取試樣5 mL（氨基氮含量約1～5 mg）于小燒杯中，加5滴30%過氧化氫，將燒杯置于磁力攪拌器上，pH計電極插入燒杯內(nèi)試樣中適當位置，開動磁力攪拌器，先用0.1 mol/L HCl或NaOH將溶液pH調(diào)至8.5，保持1 min不變，然后慢慢注入預(yù)先調(diào)好的中性甲醛溶液10 mL，1 min后用NaOH標準滴定溶液滴定值pH 8.5，記錄消耗的NaOH標準滴定溶液體積。

1.4.2 蛋清蛋白水解物相對分子質(zhì)量分布水解物溶液經(jīng)0.45 μm微孔過濾膜過濾后上TSK gel 2 000色譜柱，以細胞色素C（MW 12 500），抑肽酶（MW 6 500），桿菌酶（MW 1450），乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW 451），乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW 189）為標準品，測定水解物的相對分子質(zhì)量分布。

高效液相色譜儀條件：色譜柱為TSK gel 2 000（7.8 mm×300 mm）；柱溫30℃；流量0.5 mL/min；檢測波長220 nm；流動相為V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45∶55∶0.01。

1.4.3 氨基酸分析總氨基酸和游離氨基酸分析均采用Agilen 1 100高效液相分析儀進行測定，樣品處理和測定均由揚州大學測試中心完成。高效液相色譜儀條件：C18柱：D4.0 mm×125 mm；柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：338 nm和262 nm（Pro）；流動相A：20 mmol/L醋酸鈉液；流動相B：20 mmol/L V（醋酸鈉液）∶V（甲醇）∶V（乙腈）=1∶2∶2。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用軟件SPSS 15.0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），Duncan法進行均值的多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性標準。

2 結(jié)果與討論

天然蛋清中存在的抑酶物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)目標蛋白酶活性、阻礙酶解底物與蛋白酶的反應(yīng)或清除或競爭目標受體［8］。在蛋清蛋白酶解前進行適當?shù)募訜崽幚?，不僅能降低或消除蛋白酶抑制物，還能使蛋白變性暴露更多的酶作用點，使酶解反應(yīng)加速。然而，加熱溫度過高，會導致蛋白酶變性，阻礙酶的水解作用。楊萬根等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在蛋清酶解前，利用堿性條件下變性獲得的去抑制效果顯著優(yōu)于酸性條件，且隨著溫度的升高，去抑制效果顯著增加，95℃時的去抑制作用尤為明顯。因此，作者采用的熱處理條件為95℃，20 min。

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溫度對Flavourzyme酶水解蛋清蛋白的影響在pH7.0，酶用量5%，蛋清料液質(zhì)量體積比1 g∶4 mL的條件下，溫度分別為40、45、50、55、60、65℃進行反應(yīng)，6 h后收集水解液，沸水浴滅活酶20 min，后取上清液進行檢測。所得結(jié)果如圖1所示，溫度在40～55℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，蛋清蛋白酶解液的水解度呈顯著上升，到50℃和55℃時，水解度極顯著高于其它組（P＜0.01）。隨著溫度的繼續(xù)升高，水解度呈下降趨勢。當溫度達到65℃時，蛋白酶解液的水解度極顯著低于其它組（P＜0.01）。溫度對蛋白酶活力具有一定的影響作用。當溫度過低，酶解體系中分子運動較弱，酶與底物的碰撞概率較小，降低酶與底物的反應(yīng)，進而導致蛋清蛋白酶解液的水解度較低。隨著溫度的逐漸升高，酶與底物的反應(yīng)速率加快，進而促進蛋清蛋白降解為分子量較小的肽和氨基酸。然而，當溫度過高，會使蛋白水解酶喪失活性，導致酶解反應(yīng)速率降低甚至不再具有催化能力。在本試驗中，溫度在50～55℃是Flavourzyme酶最佳反應(yīng)溫度。溫度超過該范圍，會導致酶失活，導致水解度降低。

圖1 溫度對水解的影響Fig.1Effect of temperature on hydrolysis

2.1.2 pH對Flavourzyme酶水解蛋清蛋白的影響pH對蛋白酶水解蛋清具有一定的影響。當反應(yīng)體系中過酸或過堿均會導致酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，改變酶的構(gòu)象，使水解酶失活。此外，pH影響酶與蛋清蛋白的解離狀態(tài)，使底物不能和酶結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物，且pH能影響酶分子上活性集團的解離，影響酶與底物的絡(luò)合或催化，使酶的活性降低［10］。因此，只有在適合的pH下，蛋白酶才能保持穩(wěn)定的具有活性的構(gòu)象，促進酶解反應(yīng)的高效進行。在本試驗中，溫度55℃，酶用量5%，蛋清料液質(zhì)量體積比1 g：4 mL的條件下，pH分別設(shè)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0進行酶解反應(yīng)，6 h后收集蛋清水解液，沸水浴滅活酶20 min，后取上清液待測。測得的結(jié)果如圖2所示，水解度與pH的關(guān)系與溫度相似，呈先增后減的趨勢，當pH為6.5時，其水解度極顯著高于其它組（P＜0.01）；當pH繼續(xù)增大，F(xiàn)lavourzyme蛋清蛋白酶解液的水解度呈極顯著下降，說明較高的pH可能直接導致Flavourzyme失活。

圖2 pH對水解的影響Fig.2Effect of pH on hydrolysis

2.1.3 Flavourzyme酶用量對水解蛋清蛋白的影響與其他非生物催化劑相似，酶通過降低化學反應(yīng)的活化能來加快反應(yīng)速率。水解反應(yīng)的關(guān)鍵是蛋白酶的選擇，酶的來源和類型不同，其活性中心不同［11］，作用亦不同，所得水解產(chǎn)物也存在很大差異，并影響水解物的生物活性。Flavourzyme是一種用于在中性或微酸性條件下水解蛋白質(zhì)的真菌蛋白酶/肽酶的復合體。Flavourzyme可催化水解肽鏈末端顯苦味的疏水氨基酸。據(jù)報道，F(xiàn)lavourzyme已用于板栗、牛骨和雞骨中蛋白的水解［12-14］。另外，還可以跟其他酶組成復合酶進行水解蛋白［15］。在溫度55℃，pH 7.0，蛋清料液質(zhì)量體積比1 g：4 mL的條件下，F(xiàn)lavourzyme酶用量分別設(shè)為質(zhì)量分數(shù)3%、4%、5%、6%、7%、8%進行酶解反應(yīng)，6 h后收集蛋清水解液，沸水浴滅活酶20 min后取上清液待測。測得的結(jié)果如圖3所示，酶用量在3%～5%范圍內(nèi)，隨著酶用量的增加，F(xiàn)lavourzyme蛋清蛋白酶解液的水解度呈現(xiàn)出極顯著增加的趨勢（P＜0.01）；當超過5%時，各組之間的水解度差異不顯著（P＞0.05）。說明當酶用量達一定水平時底物被酶所飽和，使得酶促反應(yīng)速率減慢，水解度不再增加。

圖3 酶量對水解的影響Fig.3Effect of enzyme dosage on hydrolysis

2.1.4 蛋清料液質(zhì)量體積比對Flavourzyme酶水解蛋清蛋白的影響底物濃度對酶促反應(yīng)速率會產(chǎn)生影響。在一定范圍內(nèi)，隨著底物濃度增加，酶促反應(yīng)速率逐漸加快。但超過該范圍時，酶促反應(yīng)速率不會隨之而增加。溫度55℃，pH7.0，酶用量5%的條件下，蛋清液料液質(zhì)量體積比分別設(shè)為1 g∶3 mL、1 g∶4 mL和1 g∶5 mL進行酶解反應(yīng)，6 h后收集蛋清水解液，沸水浴滅活酶20 min后取上清液待測。測得的結(jié)果如圖4所示，蛋清液料液質(zhì)量體積比1 g∶4 mL組的水解度極顯著高于其它兩組（P＜0.01），蛋清液料液質(zhì)量體積比1 g∶5 mL組的水解度最低。說明蛋清液料液質(zhì)量體積比為1 g∶4 mL是該酶水解最佳底物濃度。原因可能是當水解酶被底物蛋清蛋白飽和，酶與底物的碰撞概率變大，隨著蛋清液料液質(zhì)量體積比的增加，高濃度的蛋清蛋白阻礙了酶解體系中的流動性，減少了酶與底物的碰撞，使得酶解反應(yīng)速率降低。此外，蛋清蛋白液料液質(zhì)量體積比過高可能占據(jù)蛋白酶的部分活性位點，形成不具活性的中間產(chǎn)物，抑制酶解反應(yīng)的進行，導致水解度下降。

圖4 蛋清料液質(zhì)量體積比對水解的影響Fig.4Effect of concentration of egg white on hydrolysis

2.2 正交試驗結(jié)果

在本試驗中，從表2和3可知，以蛋白殘留率為考察指標，由極差分析可知，影響酶水解蛋清蛋白的主次因素依次為：溫度＞pH＞酶用量＞蛋清液料液質(zhì)量體積比。最優(yōu)組合為A1B1C3D3，即溫度50℃、pH6.0、酶量為6%、蛋清料液質(zhì)量體積比為為1 g∶5 mL。以水解度為考察指標，影響水解蛋清蛋白的主次因素依次為：蛋清濃度＞酶用量＞pH＞溫度，其最優(yōu)組合為A2B1/B2/C3D1/D3，即溫度55℃、pH6.0或6.5、酶量為6%、蛋清液料液質(zhì)量體積比為1 g∶3 mL或1 g∶5 mL。綜合兩個指標，盡可能降低蛋白殘留率即提高底物蛋清蛋白的利用率的同時，盡量提高水解度，確定最佳水解工藝參數(shù)為：溫度55℃、pH 6.5、酶量為6%、蛋清液料液質(zhì)量體積比為1 g∶5 mL。在此條件下，F(xiàn)lavourzyme酶水解蛋清蛋白的蛋白殘留率為27.68%，水解度達38.75%。雖然Flavourzyme酶解液的水解度雖然較高，但其蛋白殘留率也較高，可以說明有一部分的蛋白是無法被Flavourzyme酶降解，其酶解液水解度高的原因是由于Flavourzyme端肽酶的作用，水解液中游離氨基酸所占比例高。鄭瑞婷等［12］用Flavourzyme酶對板栗漿液中的蛋白質(zhì)進行水解，以水解度為指標，確定其最佳工藝條件為50℃、pH 4.0、時間4 h、加酶量0.2%。張永秀等［13］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavourzyme酶在pH 7.0、溫度50℃、底物質(zhì)量分數(shù)9%、酶量與底物蛋白量之比為50LAPU/g的條件下，水解牛骨粉5 h，水解產(chǎn)物的水解度和氮溶出率分別為20.6%和95.5%。其酶解產(chǎn)物絕大部分為小分子肽且具有高的溶解性，可直接作為營養(yǎng)強化劑應(yīng)用于食品中。丁小燕等［14］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavourzyme酶解雞骨泥的最佳條件為：溫度50℃、pH值7.0、底物質(zhì)量分數(shù)5%、加酶量4 000 U/g、水解時間4 h，制得的水解液的水解度達23.21%，氮收率為70%，且無任何苦昧和異味。以上說明，F(xiàn)lavourzyme酶水解不同物質(zhì)中蛋白其條件存在差異。從試驗結(jié)果來看，可以確定Flavourzyme酶在溫度為50～55℃時發(fā)揮其效果最好。

2.3 Flavourzyme酶水解蛋清蛋白水解物相對分子質(zhì)量分布分析

由圖5可知，在溫度55℃、pH6.5、酶量6%、蛋清料液質(zhì)量體積比1 g:5 mL的水解條件下，蛋清蛋白酶解物的相對分子質(zhì)量大部分集中在300以下，即主要以游離氨基酸及二肽形式存在，其中相對分子質(zhì)量小于180和180～300所占比例分別為17.71%和58.18%。

圖5 酶解物相對分子質(zhì)量分布曲線Fig.5Elution curve of zymolyte molecular weight

表2 正交試驗L9（3）4結(jié)果Table 2Effect of L9（3）4orthogonal design

表3 正交試驗L9（3）4結(jié)果Table 3Effect of L9（3）4orthogonal design

2.4 Flavourzyme酶水解蛋清蛋白水解物氨基酸分析

經(jīng)測定，總游離氨基酸質(zhì)量濃度為5.172 mg/ mL，占水解產(chǎn)物總氨基酸質(zhì)量濃度比例高達44.09%，其中以游離氨基酸的形式存在于水解液中。

3 結(jié)語

Flavourzyme酶解蛋清蛋白的最佳條件為：溫度55℃、pH 6.5、酶量為6%、蛋清料液質(zhì)量體積比為1 g∶5 mL。在該條件下，6 h酶解物的蛋白殘留率為27.68%，水解度達38.75%，主要以游離氨基酸及二肽形式存在，其相對分子質(zhì)量大部分集中在300以下，相對分子質(zhì)量小于180和180～300所占比例分別為17.71%和58.18%，游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)高達44.09%。

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Hydrolysis of Egg White Protein by Flavourzyme

HUO Yongjiu，ZHAN Jinshun，JIN Xiaojun，ZHAO Guoqi
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Hydrolysis of egg white by Flavourzyme was determined by the orthogonal test.The optimum parameters were:temperature，55℃；pH，6.5；enzyme dosage，6%；egg white concentration，1∶5.With the condition，the residual protein rate and the degree of hydrolysis after 6 h were 27.68% and 38.75%，respectively，and the resulting hydrolysate primarily consisted of free amino acids and dipeptides.

egg white protein，enzymatic hydrolysis，protein enzyme

S 879.3

A

1673—1689（2015）04—0424—06

2014-07-15

江蘇省科技支撐項目（BE2014310；BE2013293）；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設(shè)工作資助項目（PAPD）。

霍永久（1971-），男，江蘇東海人，農(nóng)學博士，副教授，主要從事動物營養(yǎng)和畜產(chǎn)品加工研究。E-mail:huoyj@126.com