曾妍，于皓杰，楊標，殷欣，鄔敏辰*

（1.江南大學藥學院，江蘇無錫 214122；2.江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇無錫 2141222；3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122）

阿魏酸酯酶與纖維素酶協同水解麥麩釋放阿魏酸的研究

曾妍1，于皓杰2，楊標2，殷欣3，鄔敏辰*2

（1.江南大學藥學院，江蘇無錫 214122；2.江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇無錫 2141222；3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122）

研究了重組阿魏酸酯酶和纖維素酶協同作用水解去淀粉麩皮對阿魏酸釋放量的影響。以高效液相色譜法檢測阿魏酸的提取量，結果顯示，底物的超聲預處理最佳條件為350 W，20 min，是未經超聲處理的底物阿魏酸釋放率的1.45倍，單獨使用阿魏酸酯酶（reAoFaeA）30 U時阿魏酸的釋放率僅為4.1%，單獨使用纖維素酶（rAuCel12A）并不釋放阿魏酸，當兩種酶協同作用時，阿魏酸的釋放率明顯提高，經單因素試驗確定雙酶協同作用的最佳條件為：reAoFaeA的最適添加量為30 U，rAuCel12A的最適添加量為70 U，水解時間為10 h，水解溫度為40℃，水解pH為5.0，料液質量體積比為1 g:30 mL，此時阿魏酸的釋放率為23.6%。該結果表明，去淀粉麩皮中纖維素的降解，對提高阿魏酸酯酶水解釋放阿魏酸效率具有重要作用。

阿魏酸酯酶；纖維素酶；淀粉麩皮；協同作用；阿魏酸

阿魏酸酯酶（E.C.3.1.1.73，ferulie acid esterase，FAE）又稱肉桂酸酯酶，是羧酸酯水解酶的一個亞類，也是一種胞外酶。它的主要功能是水解植物細胞壁中多糖與阿魏酸連接的酯鍵，釋放出游離的單體阿魏酸或阿魏酸二聚體［1］。阿魏酸酯酶的產物阿魏酸（Ferulic acid，FA）是一種天然有效的抗氧化劑，具有清除氧自由基，降低膽固醇，抗血栓和動脈粥樣硬化，抗菌消炎，抗腫瘤，抗衰老，抗病毒，抗紫外輻射等生理功能［2，3］。FA毒性很低，在日本和美國，FA己被作為抗氧化劑應用于食品添加劑中［4］。

我國是小麥生產大國，近年來小麥的年產量超1億多噸，每年僅小麥加工生產的副產品—麥麩高達2 000多萬噸，多被丟棄或用作動物飼料。麩皮中被發(fā)現含有豐富的FA，因此，它也成為生產FA的優(yōu)質原材料［3］。目前，酶法水解植物纖維質制備FA由于其反應條件溫和，專一性強，對環(huán)境友好已成為廣泛研究的熱點［5］。在植物細胞壁上，FA連接于木聚糖側鏈，纖維素與木聚糖之間形成的空間阻礙是影響FAE作用的因素之一，單一使用FAE，并不能很好地滲入木聚糖分子內部，影響酶與底物的有效接觸，導致水解率低。已有報道表明，FAE可以協同木聚糖酶等半纖維素酶提高植物纖維質中FA的釋放量［6，7］，然而，關于纖維素酶與FAE協同作用釋放FA的研究比較少。作者利用本實驗室發(fā)酵的重組阿魏酸酯酶（reAoFaeA）與重組纖維素酶（rAuCel12A）協同作用去淀粉麩皮釋放FA，從底物超聲預處理，酶液添加量，酶解時間，溫度，pH，料液比等方面對探討了雙酶協同作用的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

分別產阿魏酸酯酶和纖維素酶的工程菌株GS115/AofaeA和GS115/Aucel12A均為本實驗室構建保存［8，9］。BMGY和BMMY培養(yǎng)基參考Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊。

1.2 材料和試劑

FA標準品、阿魏酸甲酯：購自美國Sigma公司；YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨：購自上海Sangon公司；麩皮購自農貿市場；色譜純甲醇：購自江蘇漢邦試劑有限公司；其它化學試劑均為國產或進口分析純。

1.3 主要設備儀器

戴安UltiMate-3000高效液相色譜儀：戴安（中國）有限公司產品；ZW&A-C18反相色譜柱（4.6 mm×260 mm，5 μm）：無錫科奧美萃生物科技有限公司產品；恒溫水浴搖床：江蘇太倉市實驗設備廠產品；Pellico超濾系統：Millipore公司產品。

1.4 重組阿魏酸酯酶和纖維素酶的制備

按文獻［10］的方法誘導表達重組酵母GS115/ AofaeA和GS115/Aucel12A，分別獲得reAoFaeA和rAuCel12A。將reAoFaeA和rAuCel12A利用Pellico超濾系統進行超濾濃縮。reAoFaeA的酶活力按文獻［8］的方法測定，rAuCel12A的酶活力按文獻［9］的方法測定。

1.5 麩皮中FA總量的測定

去淀粉麩皮（DSWB）按照文獻［11］的方法制備。麩皮中FA的總量以堿法提取得到的FA計算［12］。FA釋放率為FA的酶解釋放量占堿提取的FA總量的百分率。FA質量分數的測定采用HPLC法。色譜條件：戴安UltiMate-3000高效液相色譜儀，ZW&AC18反相色譜柱，紫外檢測器，檢測波長320 nm，柱溫為30℃，流動相為甲醇和體積分數1%乙酸二步梯度洗脫（0～10 min內甲醇體積分數由20%上升為50%，10～20 min內甲醇體積分數由50%上升為80%），流量為1 mL/min，進樣量為20 μL。

1.6 底物超聲處理對FA釋放率的影響

準確稱取0.5 g DSWB，加入10 mL 50 mmol/L磷酸鹽（pH 5.0）緩沖液，以不同的超聲時間和超聲功率25℃下超聲對底物進行預處理，然后加入60 U的rAuCel12A和30 U的reAoFaeA，置于40℃恒溫水浴搖床反應10 h，以未經超聲處理的底物作為對照，考察底物超聲預處理對FA釋放率的影響。

1.7 reAoFaeA和rAuCel12A添加量對FA釋放率的影響

將0.5 g預處理的DSWB加入60 U的rAuCel12A和不同量的reAoFaeA，以50 mmol/L磷酸鹽（pH 5.0）緩沖液將反應體系補至終體積為30 mL，40℃反應10 h，觀察reAoFaeA添加量對FA釋放率的影響。

將0.5 g預處理的DSWB，加入飽和量的reAoFaeA，并在此基礎上，加入不同量的rAuCel12A，以50 mmol/L磷酸鹽（pH 5.0）緩沖液將反應體系補至終體積為30 mL，40℃反應10 h，觀察rAuCel12A的添加量對reAoFaeA水解DSWB，釋放FA的影響。

1.8 酶解時間對FA釋放率的影響

將0.5 g預處理的DSWB加入飽和量的reAoFaeA和rAuCel12A，以50 mmol/L磷酸鹽（pH 5.0）緩沖液將反應體系補至終體積為30 mL，于40℃恒溫水浴搖床中分別反應0～16 h，每2 h取樣測定，觀察酶解時間對FA釋放率的影響。

1.9 酶解溫度對FA釋放率的影響

將0.5 g預處理的DSWB，加入飽和量的reAoFaeA和rAuCel12A，以50 mmol/L磷酸鹽（pH 5.0）緩沖液將反應體系補至終體積為30 mL，于32～52℃（每4℃一個間隔）反應10 h，觀察酶解溫度對FA釋放率的影響。

1.10 酶解pH對FA釋放率的影響

將0.5 g預處理的DSWB，加入飽和量的reAoFaeA和rAuCel12A，以50 mmol/L pH 4.2～6.2（每0.4一個間隔）的磷酸鹽緩沖液將反應體系補至終體積為30 mL，于最適溫度下反應10 h，觀察酶解pH對FA釋放率的影響。

1.11 料液質量體積比對FA釋放率的影響

將0.5 g預處理的DSWB加入飽和量的reAoFaeA和rAuCel12A，以50 mmol/L磷酸鹽最適pH的磷酸鹽緩沖液將反應體系補至不同終體積，于最適作用溫度下反應10 h，觀察不同料液比對FA釋放率的影響。

2 結果與分析

2.1 底物超聲處理對FA釋放率的影響

由圖1可知，底物經適當的超聲處理可以增加FA的釋放率。在不同的超聲功率條件下，超聲時間在0～20 min范圍內，FA釋放率均隨超聲時間的延長呈顯著增加趨勢；而超聲時間超過20 min時，FA提取率卻略有下降減少，這可能是超聲時間的延長對FA結構的破壞作用導致其釋放率下降。因此，最佳超聲時間為20 min。當超聲功率達到350 W時，釋放率達到最大，達到20.8%，是未經超聲處理的底物FA釋放率的1.45倍，超聲波在溶劑中形成“空化效應”，使液-固之間發(fā)生相互滲透，促使麩皮中FA溶解與提取。當功率超過350 W后釋放率有下降的趨勢，這可能是由于FA不穩(wěn)定，超聲功率過強可能會促使其發(fā)生分解。

圖1 超聲處理對FA釋放率的影響Fig.1InfluenceofultrasonicpretreatmentonFAextraction

2.2 reAoFaeA與rAuCel12A添加量對FA釋放率的影響

固定rAuCel12A為60 U，加入0～50 U的reAoFaeA，考察reAoFaeA的最適添加量。結果如圖2（a）所示，當加入reAoFaeA量為0 U時，體系不釋放FA，當reAoFaeA添加量在0～30 U范圍內，FA釋放率不斷增大，加入量為30 U時，FA釋放率達到20.8%。但當加入量大于30 U時，FA釋放率變化趨勢平緩，可能由于底物已趨于飽和，進一步添加reAoFaeA不能增加水解率。因此，reAoFaeA的最適添加量為30 U。在加入30 U reAoFaeA的基礎上，再加入0～80 U rAuCel12A，考察rAuCel12A的最適添加量。如圖2（b）所示，僅加入30 U reAoFaeA時FA的釋放率為4.1%，當加入rAuCel12A量達到70 U時FA釋放率達到22.9%，是FA單獨作用時的5.58倍，因此，rAuCel12A的最適添加量為70 U。證明FAE與纖維素酶在水解麩皮釋放FA時有協同作用。

圖2 reAoFaeA和rAuCel12A添加量對FA釋放率的影響Fig.2Influence of different activity units of reAoFaeA and rAuCel12A on FA extraction

2.3 酶解時間對FA釋放率的影響

在30 U reAoFaeA和70 U rAuCel12A存在條件下，酶解體系反應0～16 h，考察最佳酶解時間。結果如圖3所示，在0～10 h之間，FA釋放率隨著酶解時間的延長而逐漸升高。當酶解10 h時，FA的釋放率為22.9%，但當酶解時間大于10 h時，FA釋放率趨于平穩(wěn)，達到16 h時有明顯的下降，這可能與FA本身的穩(wěn)定性有關。因此，最佳酶解時間為10 h。

圖3 酶解時間對FA釋放率的影響Fig.3Influence of incubation time on FA extraction

2.4 酶解溫度對FA釋放率的影響

在30 U reAoFaeA和70 U rAuCel12A存在條件下，酶解體系分別在不同的溫度下反應10 h，考察最佳酶解溫度。結果如圖4所示，當反應溫度在32～40℃之間時，FA釋放率隨著溫度的升高而提高。當反應溫度為40℃時，FA的釋放率則達到22.9%。但當酶解溫度大于40℃時，FA釋放率降低，尤其當溫度大于48℃時，釋放率驟降。這與酶的溫度穩(wěn)定性有關，高溫會使酶的穩(wěn)定性降低，從而降低了FA的釋放率。因此，最佳酶解溫度為40℃。

圖4 酶解溫度對FA釋放率的影響Fig.4Influence of incubation temperature on FA extraction

2.5 酶解pH對FA釋放率的影響

將0.5 g預處理的DSWB懸浮于50 mmol/L不同pH的磷酸鹽緩沖液中，加入30 U reAoFaeA和70 U rAuCel12A，在40℃下反應10 h，考察最佳酶解pH。結果如圖5所示，當pH為5.0時，FA釋放率達到最高22.9%。當pH高于5.8時，FA的釋放率明顯降低。這與酶的pH穩(wěn)定性有關，pH過高或過低都會使酶的穩(wěn)定性降低，從而降低了FA的釋放率。因此，最佳酶解pH為5.0。

圖5 酶解pH對FA釋放率的影響Fig.5Influence of incubation pH on FA extraction

2.6 料液質量體積比對FA釋放率的影響

將0.5 g預處理的DSWB懸浮于不同體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，加入30 U reAoFaeA和70 U rAuCel12A，在40℃下反應10 h，考察最佳料液比。結果如圖6所示，當料液質量體積比為1 g∶30 mL時，相應的釋放率為23.6%。當料液質量體積比在1 g∶10 mL～1 g∶30 mL范圍內，料液質量體積比的增加促進了FA的釋放率，可能由于較低的水分影響了酶分子的擴散速率以及水分的流動性，使得體系分布不均勻，酶的傳質增加而使酶和底物不能夠充分接觸，因而降低了FA的釋放率。當料液質量體積比大于1 g∶30 mL時FA的釋放率變化不大，因此，選擇最佳酶解料液質量體積比為1 g∶30 mL。

圖6 料液質量體積比對FA釋放率的影響Fig.6Influence of ratio of solid to liquid on FA extraction

3 結語

利用麥麩獲得高營養(yǎng)價值和高經濟價值的深加工產品FA，對小麥麩皮進一步深加工具有重要意義。采用FAE與木聚糖酶及其他輔助酶作用于麥麩，釋放大量的FA已得到廣泛研究。其中FAE與木聚糖酶系的協同作用研究較多，Faulds［6］等人率先報道了黑曲霉（Aspergillus niger）FAE-Ⅲ與綠色木霉（Trichoderma viride）木聚糖酶的協同作用，當兩種酶共同作用于小麥麩皮時，FA釋放量達到麩皮中總FA含量的95%，比FAE-Ⅲ單獨作用時提高了近24倍。Wang［7］等人從嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）中分離得到的一種新型FAE，單獨使用水解100 mg DSWB并不釋放FA，分別與木聚糖酶和α-L-阿拉伯糖苷酶協同作用最大可以得到12.4 nmol和3.64 nmol的FA，3種酶共同作用最大可以得到15.7 nmol的FA，證明以木聚糖酶為主，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶為輔可以協同作用FAE促進FA的釋放。FAE與纖維素酶協同作用的研究主要集中在對植物細胞壁的降解上，曾薇［13］等人利用FAE與纖維素酶水解氣爆稻草，證明FAE的添加可以促進纖維素酶對天然木質纖維素的酶解效率，提高原料可及度50%以上。Knoshaug［14］等人從青霉菌（Penicillium funiculosum）中分離出兩種FAE（FaeA和FaeB），分別與纖維素酶協同作用水解玉米秸稈可以提高19%和7%的纖維二糖的釋放量，3種酶共同作用可以提高25%的纖維二糖的釋放量。然而，在釋放FA的角度，探討關于FAE與纖維素酶協同作用的報道較少。

作者以DSWB為研究對象，經單因素試驗確定reAoFaeA和rAuCel12A協同作用DSWB，高效獲得FA的條件為：0.5 g底物DSWB經超聲350 W處理20 min，reAoFaeA的最適添加量為30 U，rAuCel12A的最適添加量為70 U，最佳酶解時間為10 h，最佳酶解溫度為40℃，最佳pH為5.0，最佳料液質量體積比為1 g∶30 mL，此時FA的釋放率為23.6%，明顯高于FAE單獨作用時的釋放率（4.1%），證實了纖維素所形成的空間位阻也是影響FA釋放率的一個重要因素。

由此可以推測FAE、木聚糖酶和纖維素酶3種酶共同作用，同時切斷木聚糖的長鏈和降低纖維素的位阻，阿魏酸釋放率將會得到進一步的提高。

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Synergistic Effect of Feruloyl Esterase and Cellulase on the Release of Ferulic Acid from Wheat Bran

ZENG Yan1，YU Haojie2，YANG Biao2，YIN Xin3，WU Minchen*2
（1.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The synergistic effect of feruloyl esterase and cellulose on the release of ferulic acid from de-starched wheat bran（DSWB）was studied.The HPLC results showed that DSWB which was ultrasonically pretreated at a power of 350 W for 20 minutes released ferulic acid at a level of 1.45-fold more than that unpretreated.ReAoFaeA（30 U）by itself released only 4.1%of total alkaliextractable ferulic acid from wheat bran，while no ferulic acid released if rAuCel12A was used.The rate of ferulic acid released was significantly increased when both enzymes were used.The conditions using two enzymes simultaneously were optimized by a single factor test.A maximum of 23.6%totalferulic acid released could be reached in combinations of 30 U reAoFaeA and 70 U rAuCel12A with the ratio of solid to liquid of 1∶30（g∶mL）at pH 5.0 and treated under 40°C for 10 h.

feruloyl esterase，cellulase，starched wheat bran，synergistic action，ferulic acid

Q 786

A

1673—1689（2015）04—0379—06

2014-06-13

國家自然科學基金項目（31271811）。

*通訊作者：鄔敏辰（1962-），男，江蘇無錫人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事酶工程與基因工程研究。Email:bioch@163.com