董人富，馬小麗，陳亞瓊，戚偉平，陳 瑋，何瑋毅，尤民生

(福建農(nóng)林大學應(yīng)用生態(tài)研究所，農(nóng)業(yè)部閩臺作物有害生物綜合治理重點實驗室，福建省昆蟲生態(tài)重點實驗室，福州350002)

葡萄糖氧化酶 (glucose oxidases，GOX)普遍存在于動物、植物及微生物體內(nèi)。1904年首先在黑曲霉 Aspergillus niger和灰綠青霉 Penicillium glaucum中發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶 (邢良英等，2007)。1928年，通過試驗確定了黑曲霉無細胞提取液中葡萄糖氧化酶將葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫的作用機理，并命名為葡萄糖氧化酶，之后把它歸入脫氫酶類 (張茜，2009)。1961年按照國際生化協(xié)會酶學委員會的分類新命名法，系統(tǒng)命名為β－D－葡萄糖氧化還原酶 (EC1.1.3.4)(程靜，2011)。昆蟲中GOX的研究起步相對比較遲，本文通過對昆蟲GOX的催化機制、進化關(guān)系、活性變化、對自身與氧化還原相關(guān)生理活動的影響和在植物防御反應(yīng)中的作用等方面進行闡述，為揭示昆蟲與植物協(xié)同進化的機制和害蟲生態(tài)治理提供理論依據(jù)。

1 GOX的結(jié)構(gòu)與催化特性

GOX是一種糖蛋白，其氨基酸組成中谷氨酸和谷氨酸鹽、天冬氨酸和天冬氨酸鹽以及甘氨酸含量較高，不存在半胱氨酸 (Eichenseer et al．，1999)。GOX的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相對保守，多數(shù)GOX分子具有2個黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)結(jié)合位點，它是一個同型二聚體分子，剛性非常強，不易斷裂。每個GOX單體都含有2個完全不同的區(qū)域:一個與部分FAD非共價緊密結(jié)合，主要是β折疊;另一個與底物β－D－葡萄糖結(jié)合，由4個α螺旋支撐1個反平行的β折疊。上述結(jié)構(gòu)特征使得GOX對底物β－D－葡萄糖具有高度的識別性和專一性，可以將β－D－葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫 (程靜，2011)。其催化反應(yīng)的過程是一個氧化還原反應(yīng)，需要輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD，flavin adenine dinucleotide)的參與，F(xiàn)AD作為最初的電子受體，自身還原被成FADH2，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，然后FADH2再將電子傳遞給氧氣，生成過氧化氫 (圖1)。

圖1 葡萄糖氧化酶 (GOX)催化反應(yīng)機理示意圖(程靜，2011)Fig.1 Illustration of glucose oxidase(GOX)－based catalytic reaction，showing that GOX can specifically oxidize β－D－glucose into gluconic acid and hydrogen peroxide

2 昆蟲GOX的進化

目前，公共數(shù)據(jù)庫中已有的GOX主要來自真菌和昆蟲。我們在Tang等 (2012)構(gòu)建的GOX與葡萄糖脫氫酶 (glucose dehydrogenase，GLD)的進化樹基礎(chǔ)上，新增了果蠅Drosophila melanogaster的GLD、以及蜜蜂Apis mellifera、小菜蛾P(guān)lutella xylostella和家蠶Bombyx mori的GOX序列，重新構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，一共涉及13個物種19條序列。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，昆蟲GOX與已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)的黑曲霉GOX都獨立成支，并且它們的生化性質(zhì)具有較大的差異 (Eichenseer et al．，1999)，說明了昆蟲和真菌GOX是經(jīng)過不同的進化歷程演變而來;而家蠶和蜜蜂的GOX和GLD聚到了同一個分支，說明了昆蟲GOX和GLD可能具有相同的起源。我們發(fā)現(xiàn)GOX在進化樹中的距離和物種的親緣關(guān)系緊密相關(guān)，膜翅目昆蟲的GOX和鱗翅目昆蟲的GOX可以大體各獨立成支，只有家蠶的一個GOX被聚到了膜翅目;在鱗翅目中，棉鈴蟲Helicoverpa armigera、美洲棉鈴蟲Helicoverpa zea和甜菜夜蛾Spodoptera exigua這三種夜蛾科昆蟲GOX相對菜蛾科的小菜蛾和蠶蛾科的家蠶，在進化樹中也獨立成一個小支 (圖2)。

Kunieda等 (2006)通過分析GOX在蜜蜂基因組中與相鄰基因的排布情況、序列同源性及其調(diào)控序列后認為，GOX是從與提供飛行能量相關(guān)的葡萄糖 －甲醇 －膽堿氧化還原酶 (glucosemethanol－choline(GMC)oxidoreductases)進化而來，首先由GMC氧化還原酶通過基因復制事件而產(chǎn)生數(shù)個連續(xù)排列的GLD，然后由其中一個GLD進化成GOX。在小菜蛾基因組中，我們鑒定了3個GOX基因 (You et al．，2013)，其中較為原始的GOX基因 (Px008506)在成蟲中偏好表達 (He et al．，2012)，其是否保留了GMC提供成蟲飛行能量的功能，需要進一步實驗的驗證 (圖2)。

圖2 昆蟲和真菌GOX和GLD系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of GOX and GLD in insects and fungi

3 昆蟲GOX的活性與昆蟲食性

雖然昆蟲唾液腺 (包括上鄂腺、下鄂腺或下唇腺)中普遍存在GOX(黃志君等，2007)，但是同一物種，不同組織器官和發(fā)育階段，其GOX活性不同。例如，GOX在美洲棉鈴蟲不同組織器官的活性依次 (從高到低)為:下唇腺、顎腺、中腸腔、馬氏管、前腸、血淋巴、脂肪體和中腸上皮細胞，而在其蟲體外表皮和雄蟲睪丸沒有檢測到GOX的活性 (Eichenseer et al．，1999)。其它鱗翅目昆蟲中GOX活性也呈現(xiàn)相似的特征 (宗娜和王琛柱，2004)，如在家蠶下唇腺同源器官絲腺中GOX的活性同樣較高 (肖麗蓉，2012)。此外，在昆蟲的幼蟲時期，下唇腺GOX活性呈周期性變化，取食活躍期的GOX活性相對較高 (Eichenseer et al．，1999;宗娜和王琛柱，2004)。昆蟲GOX的活性在取食密切相關(guān)的唾液腺和取食活躍時期都相對較高，說明了GOX和昆蟲取食密切相關(guān)。

取食不同寄主植物的昆蟲，其GOX活性不同。Peiffer和 Felton(2005)研究發(fā)現(xiàn)，取食煙草Nicotiana tabacum的美洲棉鈴蟲與取食棉花的相比，幼蟲下唇腺含有更高的GOX活性;Eichenseer等 (2010)發(fā)現(xiàn)美洲棉鈴蟲、煙草天蛾Manduca sexta和煙芽夜蛾Heliothis virescens取食不同的寄主植物，都會導致的GOX活性產(chǎn)生顯著的變化;喂食人工飼料的棉鈴蟲唇腺中GOX活性顯著高于取食煙草N．tabacum的，用浸泡過葡萄糖或者蔗糖的煙草葉片喂養(yǎng)棉鈴蟲幼蟲，其唇腺分泌的GOX含量也顯著提高 (Tang et al．，2012)。

Eichenseer等 (2010)通過對85種來自23個的鱗翅目家族和3種來自2個膜翅目家族昆蟲的下唇腺GOX的活性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)物種間GOX的活性相差較大，但是一般而言雜食性昆蟲比寡食性、單食性昆蟲的GOX活性高。

4 昆蟲GOX參與自身的氧化還原過程

GOX作為一種脫氫酶，其氧化產(chǎn)物對昆蟲自身具有廣泛的作用。Candy(1979)發(fā)現(xiàn)南美沙漠蝗Schistocerca americana表皮和血淋巴中GOX的活性在蛻皮之后迅速升高，推測GOX在南美沙漠蝗成蟲骨化過程中有助于蛋白質(zhì)的交聯(lián);但Eichenseer等 (1999)等人發(fā)現(xiàn)美洲棉鈴蟲的幼蟲表皮中不表達GOX。因此，GOX是否通過影響蛋白質(zhì)交聯(lián)而影響昆蟲骨化還有待證實。目前認為，GOX調(diào)節(jié)自身與氧化還原相關(guān)的生理活動有:①昆蟲GOX的氧化產(chǎn)物會抑制所取食植物中過氧化物酶、多酚氧化酶和脂肪氧化酶等對植物營養(yǎng)成分的破壞 (Felton and Summers，1995;Felton and Gatehouse，1996)，同時在中腸的氧化反應(yīng)中GOX與這些氧化酶競爭性結(jié)合氧氣，使得其它氧化酶缺少結(jié)合的底物，從而在昆蟲中腸消化系統(tǒng)中增加被攝取食物的營養(yǎng) (Eichenseer et al．，1999)。②昆蟲GOX的催化過程消耗氧氣并產(chǎn)生過氧化氫，然后由抗壞血酸過氧化物酶移除過氧化氫，減少了氧氣參與其他氧化過程，而在中腸中作為抗氧化系統(tǒng)的一部分而起作用 (Mathews et al．，1997)。③昆蟲GOX可以通過其產(chǎn)生的過氧化氫抑制某些特殊組織的細胞程序性死亡，如家蠶的前部絲腺 (Matsui et al．，2011)。

5 昆蟲GOX對植物防御反應(yīng)的影響

昆蟲GOX可以抑制植物的防御反應(yīng)，其不僅可以減少茉莉酸 (JA)誘導的防御物質(zhì)煙堿含量(Musser et al．，2002)和降低防御物質(zhì)萜類化合物合成酶基因 (Bede et al．，2006)的轉(zhuǎn)錄水平，而且還能抑制JA生物合成的關(guān)鍵酶脂氧合酶(lipoxygenase)的活力，從而抑制JA的水平 (Bi et al．，1997)。多數(shù)植食性昆蟲口腔唾液中存在兩類主要物質(zhì)，在其與寄主植物的相互作用中起著重要作用:一類是脂肪酸和氨基酸的共軛化合物(fatty acid－amino acid conjugates，F(xiàn)ACs);另一類是酶，如 β－葡萄糖苷酶和 GOX(Hu et al．，2008)。Diezel等 (2009)等人提出，昆蟲口腔唾液分泌物通過與植物激素的互作調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)。昆蟲口腔唾液中在FACs含量多、GOX含量少時，如煙草天蛾，F(xiàn)ACs作為口腔分泌物中的主效物質(zhì)，可以誘導JA和乙烯 (ET)的水平上調(diào)，進而通過植物中ET受體 (ETR1)抑制水楊酸(SA)的水平;在FACs含量少、GOX含量多時，如甜菜夜蛾，GOX作為口腔分泌物中的主效物質(zhì)，可以誘導SA的水平上調(diào)，通過與JA的相互拮抗作用，抑制依賴于JA的植物對咀嚼式口器昆蟲的防御反應(yīng)。

昆蟲GOX很可能通過其催化產(chǎn)物來抑制與植物激素相關(guān)的防御反應(yīng)。例如，用葡萄糖或者GOX單獨處理損傷煙草的傷口，都不能顯著的提高植物中與防御相關(guān)的SA的水平。但是，若用葡萄糖和GOX兩者同時處理植株傷口，卻能顯著提高植株 SA的水平 (Diezel et al．，2009)。昆蟲GOX的水解產(chǎn)物過氧化氫、葡萄糖酸處理機械損傷的煙草葉片，相較于對照組 (水處理)的煙草葉片，使得植物防御物質(zhì)煙堿含量減少 (Musser et al．，2002)。有趣的是，煙草在受到蟲害之后，會將其體內(nèi)的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)移到根部 (Schwachtje et al．，2006)，這樣也就間接降低了昆蟲GOX的作用效果，從而提高自身對昆蟲的防御。

雖然昆蟲GOX抑制植物的防御反應(yīng)的報道比較多，但是在番茄中卻誘發(fā)植物的防御反應(yīng)。昆蟲GOX不僅使得番茄中JA上調(diào)表達，而且受JA調(diào)控的防御基因蛋白酶抑制2(Pin2)也上調(diào)表達，這種誘發(fā)效應(yīng)具有組織特異性，并可以傳遞到下一代。在進一步的研究中發(fā)現(xiàn)，番茄中SA及其前體苯甲酸的含量、SA誘導的相關(guān)基因和JA途徑上游信號基因的表達量在美洲棉鈴蟲唾液處理前后都沒有顯著的變化。因此，GOX誘導JA途徑的機制可能不是直接作用于JA上游信號因子且與SA途徑無關(guān)，具體作用機理還有待進一步的研究(Tian et al．，2012)。

6 小結(jié)與展望

目前，雖然對昆蟲中普遍存在的GOX的研究仍十分有限，但是發(fā)現(xiàn)昆蟲GOX在調(diào)節(jié)自身與氧化還原相關(guān)的生理活動和對植物防御方面都具有重要的功能。其中，最令人關(guān)注的是，包括GOX在內(nèi)的昆蟲口腔分泌物在植物與昆蟲互作關(guān)系中的作用。Diezel等 (2009)所提出的昆蟲口腔分泌物調(diào)控煙草中JA、SA和ET途徑影響植物防御反應(yīng)的模型值得我們借鑒，但是其中的信號如何傳遞有待進一步深入研究。

雖然昆蟲GOX及其催化產(chǎn)物和植物的防御緊密相關(guān)，但是植物感知GOX的具體機制還不清楚。對此，我們是否可以借鑒植物病理學中效應(yīng)子觸發(fā)的植物免疫機制 (effector－triggered immunity)(Jones and Dangl，2006;Boller and He，2009)，尋找植物中GOX的受體以及由植物激素介導的響應(yīng)GOX的途徑，從而深入認識昆蟲GOX如何對植物防御反應(yīng)產(chǎn)生影響。

我們可以借助分子生物學和生物技術(shù)的手段，如借助昆蟲RNA干擾抑制GOX的表達和昆蟲轉(zhuǎn)基因誘發(fā)GOX過量表達來調(diào)控昆蟲GOX的分泌過程，進一步探討昆蟲GOX的生理功能;利用體外表達昆蟲GOX蛋白處理植物，探究昆蟲GOX和植物防御相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑如何關(guān)聯(lián)，從而深入了解昆蟲與植物的互作關(guān)系;通過構(gòu)建昆蟲GOX與寄主植物相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)，闡明昆蟲GOX在與植物互作過程中的關(guān)鍵作用，進而為農(nóng)業(yè)害蟲的有效防治和持續(xù)控制提供新思路。

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