宋紅麗，鄭衛(wèi)萍，楊洋，劉濤，吳本娟，付楠楠，張友成，沈中陽

（1.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192；2.天津市兒童醫(yī)院，天津 300074）

目前肝移植術(shù)后預(yù)防乙型肝炎（乙肝）復(fù)發(fā)的常用方案為小劑量乙肝免疫球蛋白（HBIG）聯(lián)合核苷類似物，并取得了良好的效果［1］。但是長(zhǎng)期應(yīng)用HBIG和核苷類似物藥物費(fèi)用很高，對(duì)患者和社會(huì)來說負(fù)擔(dān)沉重；同時(shí)作為生物制品的HBIG日益短缺，使部分患者不能堅(jiān)持有效預(yù)防乙肝復(fù)發(fā)的方案，而且長(zhǎng)期使用核苷類似物容易導(dǎo)致病毒耐藥［2］。術(shù)后乙肝疫苗的應(yīng)用，使患者看到了停用抗病毒藥物及HBIG的可能性，但是目前由于移植術(shù)后免疫抑制劑的使用，使乙肝疫苗治療有效性較差［3-4］。如果能夠?qū)ふ页鼋?jīng)濟(jì)有效的新方法，從而使乙肝患者移植術(shù)后徹底停用抗病毒藥物，將在該領(lǐng)域取得突破，獲得重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效應(yīng)。

肝移植是各類終末期肝臟疾病的主要治療手段，在中國(guó)，其中70%～80%為乙型肝炎病毒（HBV）導(dǎo)致［5］，患者通常在等待肝移植手術(shù)時(shí)機(jī)的同時(shí)接受抗病毒治療以降低體內(nèi)HBV DNA的復(fù)制水平［6］，同時(shí)術(shù)前HBV DNA的水平也是術(shù)后HBV復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。因此，提高患者主動(dòng)免疫力、降低等待移植患者體內(nèi)HBV DNA水平，已成為預(yù)防術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的重要目標(biāo)。樹突狀細(xì)胞（DC）是機(jī)體內(nèi)能激活初始T細(xì)胞主要的抗原呈遞細(xì)胞（APC），其強(qiáng)大的抗原呈遞能力是連接機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁［7］，因此，DC在各類病毒感染、腫瘤免疫中扮演著重要角色［8］。DC作為體內(nèi)功能最強(qiáng)大的APC，可以通過對(duì)抗原的攝取、加工處理呈遞給T細(xì)胞啟動(dòng)相應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)患者體內(nèi)特異性殺傷HBV的能力，提高患者的主動(dòng)免疫力。T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)紊亂，也是HBV在體內(nèi)持續(xù)復(fù)制的主要原因［9］。本研究主要通過觀察轉(zhuǎn)HBV基因小鼠DC刺激自體淋巴細(xì)胞對(duì)體外HBV復(fù)制，尤其對(duì)cccDNA的作用，來評(píng)價(jià)HBV感染后特異性免疫功能的變化及其與HBV復(fù)制水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑：FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；DC生成培養(yǎng)基DXF（德國(guó)PromoCell公司）；淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；胎牛血清（FBS，奧地利PAA公司）；干擾素（IFN）-γ-APC、白細(xì)胞介素（IL）-4-藻紅蛋白（PE）單抗（美國(guó)BD Pharmingen公司）；CD80-APC/CD86-FITC/CD11C-FITC MHC-Ⅱ-PE/CD83-PE（美國(guó)BD公司）；乙肝核心抗原/乙肝表面抗原（HBcAg/HBsAg）（英國(guó) Peprotech公司）；IL-10、IL-2和IFN-γ的ELISA試劑盒（中國(guó)Biovalue公司）。

1.2 研究對(duì)象：HBV全基因轉(zhuǎn)基因C57 BL/6J小鼠［10］由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司提供；HepG 2.2.15細(xì)胞株由北京軍區(qū)302醫(yī)院贈(zèng)送。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組：A組為淋巴細(xì)胞（LC）+未成熟DC組；B組為HepG 2.2.15 +未成熟DC + LC組；C組為L(zhǎng)C +負(fù)載HBV相關(guān)抗原刺激的成熟DC組（成熟DC組）；D組為HepG 2.2.15 +成熟DC + LC組；E組為HepG 2.2.15組。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 淋巴細(xì)胞的獲?。簾o菌制備C57BL/6J小鼠脾和胸腺的細(xì)胞懸液，將淋巴細(xì)胞懸液移到離心管中的細(xì)胞分離液（Percoll）淋巴細(xì)胞分離液上面，使其具有明顯分層。以2 000 r/min離心20分鐘，吸取中間白膜層，再以1 000 r/min離心8分鐘，棄去上清。最后用含0.05%吐溫-20的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，計(jì)數(shù)后加入培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中共培養(yǎng)。

1.4.2 提取HBV轉(zhuǎn)基因鼠的DC進(jìn)行培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察：取6～8周（體重18～22 g）的HBV全基因轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠，斷頸椎處死，按以下步驟進(jìn)行操作：取股骨及脛骨骨髓，PBS沖洗，離心棄上清，收集骨髓細(xì)胞；加入5 ml已預(yù)熱37℃的紅細(xì)胞裂解液，除去紅細(xì)胞；加入5倍體積RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，離心（1 500 r/min，5分鐘）；用含100 ml/L 胎牛血清（FCS）的RPMI 1640的完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，加入到6孔板中，每孔2 ml；37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)液，同時(shí)添加rGM-CSF（終濃度為 10 ng/ml）和 rIL-4（1 ng/ml）于骨髓細(xì)胞中；第2天去除未貼壁的細(xì)胞；第4天半量換液，并補(bǔ)充細(xì)胞因子rGM-CSF和rIL-4（濃度同前）；第6天成為不成熟的DC，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化。

1.4.3 成熟的DC獲取：將培養(yǎng)至第8天的DC分別用HBV相關(guān)蛋白HBsAg（19.6 μg/ml）和HBcAg（10 μg/ml）誘導(dǎo)，第10天細(xì)胞即轉(zhuǎn)為帶有HBV的抗原成熟的DC。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)志物CD80、CD86、CD83等的表達(dá)。

1.4.4 免疫效應(yīng)細(xì)胞（IEC）的制備及檢測(cè)：成熟的DC刺激自體淋巴細(xì)胞（DC︰淋巴細(xì)胞＝1︰10），經(jīng)過10余天的培養(yǎng)及活化，制備成IE細(xì)胞（CD8+為主）并進(jìn)行不斷的分裂與增殖。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1.4.5 ELISA法檢測(cè)上清中的IL-10/IFN-γ/IL-2的分泌：按照試劑盒說明書步驟來操作，顯色后在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度（A）值。

1.4.6 IEC與HepG 2.2.15細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，并檢測(cè)免疫細(xì)胞對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞中cccDNA及HBV DNA水平的影響：免疫效應(yīng)細(xì)胞與HepG 2.2.15細(xì)胞混合于6孔板，效靶比為1︰10，在37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24、48和72小時(shí)，每組設(shè)3個(gè)空白孔。收集混合細(xì)胞上清及細(xì)胞，進(jìn)行cccDNA及HBV DNA水平的檢測(cè)。

1.4.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子：用流式細(xì)胞儀對(duì)DC表面標(biāo)志物CD80/CD83/CD86、MHCⅡ/CD11C進(jìn)行檢測(cè)，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.8 生物化學(xué)方法檢測(cè)上清液的肝功能指標(biāo)。

1.4.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)血清及細(xì)胞內(nèi)HBV DNA：使用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀（Applied Biosystems），操作按PCR試劑盒說明書進(jìn)行（上海Kehua公司）。

1.4.10 HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的cccDNA，具體方法見參考文獻(xiàn)［11］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism5軟件做圖。

2 結(jié) 果

2.1 檢測(cè)HBV全基因轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠血清的HBsAg、HBeAg、HBV DNA均陽性，而肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA陰性。肝功能、腎功能等正常。

2.2 成功獲取轉(zhuǎn)HBV基因鼠骨髓中的DC細(xì)胞

2.2.1 DC形態(tài)學(xué)變化：第1天，鏡下觀察可見貼壁的圓形單核細(xì)胞，細(xì)胞體積小，數(shù)量多，無突觸；第3天，細(xì)胞體積逐漸變大，由規(guī)則的圓形向長(zhǎng)條狀進(jìn)展；第6天，細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞表面伸出短的突觸（圖1a）。按第6天DC細(xì)胞是否負(fù)載HBsAg和HBcAg抗原肽分為負(fù)載抗原成熟組和未負(fù)載抗原未成熟組，第8天負(fù)載抗原成熟組的細(xì)胞大量懸浮，小而圓的單核細(xì)胞逐漸消失，細(xì)胞表面都伸出兩個(gè)或多個(gè)突觸，細(xì)胞體積大，突觸明顯，未分化的單核細(xì)胞較少（圖1b）。圖1c、1d顯示出由未成熟到成熟的DC表型的典型變化。

2.2.2 DC表面標(biāo)志的變化（表1）：與培養(yǎng)6天未成熟DC相比，負(fù)載抗原成熟的DC表面標(biāo)志物CD11c/MHC-Ⅱ、CD83、CD80、CD86的表達(dá)在成熟DC中均明顯增高（均P＜0.05），說明在體外環(huán)境HBV相關(guān)抗原可以刺激體外DC的成熟。

圖1 未成熟與成熟DC形態(tài)比較（a、b均為低倍放大）

表1 未成熟DC與成熟DC表型變化比較（±s）

表1 未成熟DC與成熟DC表型變化比較（±s）

注：與未成熟DC組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

標(biāo)志物 樣本數(shù) 未成熟DC 成熟DC CD11c+MHC-Ⅱ+ 3 45.77±4.53 95.50± 4.07 CD80 3 20.07±2.66 64.00±10.66 b CD86 3 16.37±6.91 29.77± 4.48 a CD83 3 86.83±2.89 98.37± 0.97 b

2.3 特異性效應(yīng)性淋巴細(xì)胞對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的肝功能及上清HBV DNA的影響：

2.3.1 D組與B組細(xì)胞上清液HBV DNA變化 （表2；圖2）：D組在24、48和72小時(shí)細(xì)胞上清HBV DNA均較E組明顯下降（均P＜0.01），B組細(xì)胞上清HBV DNA水平也較E組有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。說明特異性的成熟DC刺激的淋巴細(xì)胞能有效地抑制體外HBV的釋放，但與B組相比，D組作用更顯著。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液HBV DNA變化（±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液HBV DNA變化（±s）

組別 樣本數(shù) HBV DNA（×106）24小時(shí) 48小時(shí) 72小時(shí)D 組 3 0.95±0.07 1.10±0.58 1.04±0.16 B 組 3 1.99±1.18 1.80±0.12 1.90±0.25 E 組 3 3.45±0.50 2.82±1.17 4.09±1.99

2.3.2 各組間肝臟酶學(xué)的變化（圖2）：在48和72小時(shí)B組和D組肝細(xì)胞丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平有下降趨勢(shì)，與E組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平雖然有上升趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明免疫細(xì)胞與異種肝細(xì)胞之間混合培養(yǎng)，并不能導(dǎo)致細(xì)胞間的排斥反應(yīng)發(fā)生，可能有保護(hù)肝細(xì)胞膜的作用。

2.4 特異性免疫效應(yīng)淋巴細(xì)胞對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和cccDNA的影響（表3）：成熟DC與LC作用（C組）24、48和72小時(shí)后，HepG 2.2.15細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA和cccDNA表達(dá)均明顯下降，與E組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。未成熟DC與LC作用（A組）24、48和72小時(shí)后的HepG 2.2.15細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA和cccDNA表達(dá)亦均有下降，但與E組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果提示由HBV相關(guān)蛋白刺激的轉(zhuǎn)HBV基因鼠的DC刺激自體淋巴細(xì)胞后對(duì)體外HepG 2.2.15細(xì)胞中的HBV有顯著的抑制作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的復(fù)制及HBV DNA的分泌均有抑制作用。而未成熟DC組抑制HBV復(fù)制作用較成熟DC組作用弱。B組與D組在24、48和72小時(shí)對(duì)HBV DNA和cccDNA均有抑制作用，D組的作用更明顯，與E組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而B組與E組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞上清的肝功能與HBV DNA的影響

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和cccDNA的影響

2.5 各組淋巴細(xì)胞亞群的變化（圖3）：將成熟DC或不成熟DC與淋巴細(xì)胞共刺激后再與HepG 2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+/ CD3+CD8+比值的變化，結(jié)果提示，隨著DC由不成熟到成熟，CD3+CD4+及CD4+/ CD8+比值先下降后升高；而CD3+CD8+比例變化不明顯。說明成熟DC刺激的淋巴細(xì)胞在24小時(shí)以CD3+CD8+作用為主發(fā)揮免疫作用，48小時(shí)以后則以CD3+CD4+陽性細(xì)胞作用為主。

對(duì)CD3+CD4+細(xì)胞的影響：B、C、D組在24、48和72小時(shí)分別與A組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），A組與B組、C組與D組相比差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），表現(xiàn)為24小時(shí)先下降，48小時(shí)以后升高，而CD3+CD8+比例各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化。

CD4+/ CD8+比值：C組較A組CD4+/ CD8+比值明顯降低；D組較C組CD4+/ CD8+比值在24小時(shí)明顯降低，48小時(shí)和72小時(shí)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；D組較B組CD4+/ CD8+比值在24小時(shí)明顯下降（P＜0.01），48 小時(shí)和72小時(shí)明顯升高，48小時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而72小時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 IEC與HepG 2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)后上清液的細(xì)胞因子水平變化（圖4；表4）：A組與B組、C組與D組細(xì)胞上清液的IL-2和IFN-γ分泌水平在24、48和72小時(shí)均為上升趨勢(shì)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；各個(gè)時(shí)間點(diǎn)D組與B組水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且不隨時(shí)間而變化；C組與A組比較24小時(shí)時(shí)IFN-γ分泌量無明顯差異，而IL-2分泌量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他時(shí)間點(diǎn)均有意義，但不隨時(shí)間變化而變化；C組與A組比較24和72小時(shí)IFN-γ無明顯差異。

圖3 各組C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞亞群的變化

圖4 各組細(xì)胞上清液的IL-2、IFN-γ和IL-10分泌量的變化

IL-10的變化卻相反。A組與B組24小時(shí)呈下降趨勢(shì)，48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)均呈上升趨勢(shì)（均P＜0.05）；C組與D組24、48和72小時(shí)均呈下降趨勢(shì)（均P＜0.05）；C組與A組24小時(shí)IL-10分泌量無明顯差異，D組與B組則有顯著差異（P＜0.01）。但不隨時(shí)間變化而變化。

提示DC刺激淋巴細(xì)胞對(duì)體外HepG 2.2.15細(xì)胞作用后都能產(chǎn)生較高的IL-2、IFN-γ和較低的IL-10。但成熟DC較未成熟DC的作用更明顯。

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)、HepG 2.2.15細(xì)胞上清液細(xì)胞因子水平變化比較（±s）

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)、HepG 2.2.15細(xì)胞上清液細(xì)胞因子水平變化比較（±s）

注：B組與A組比較，aP＜0.05；D組與C組比較，bP＜0.05；C組與A組比較，cP＜0.05；D組與B組比較，dP＜0.05

組別 樣本數(shù) IL-2（pg/ml）24小時(shí) 48小時(shí) 72小時(shí)A 組 3 71.36±5.85 67.09±1.92 67.36±3.26 B 組 3 97.90±8.21a 92.60±2.43a 89.69±4.25a C 組 3 44.15±5.41c 50.36±4.26c 48.70±1.43c D組 3 80.09±4.54bd 85.74±4.91bd 82.62±3.07bd組別 樣本數(shù) IFN-γ（pg/ml）24小時(shí) 48小時(shí) 72小時(shí)A 組 3 416.87±24.01 396.73± 78.30 438.61±111.85 B 組 3 534.77±16.41a 595.45± 57.15a 678.58± 39.31a C 組 3 425.79±23.83 597.08± 88.69c 497.99±104.50 D 組 3 830.95±75.12bd 953.64±109.19bd 909.97±117.39bd組別 樣本數(shù) IL-10（pg/ml）24小時(shí) 48小時(shí) 72小時(shí)A 組 3 532.16±16.52 383.97±24.87 420.38±19.83 B 組 3 420.13±43.59a 444.92±10.53a 479.56±32.06a C 組 3 572.08±21.72 525.04±41.05c 560.78±33.48c D 組 3 338.95±31.37bd 323.65±22.55bd 333.38±33.67bd

3 討 論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，發(fā)生慢性病毒性肝炎及病毒持續(xù)感染的機(jī)制除了取決于病毒本身的生物學(xué)特性外，更重要的是與宿主自身的免疫功能狀態(tài)有關(guān)。利用自身的免疫細(xì)胞培養(yǎng)識(shí)別標(biāo)靶特異抗原的淋巴細(xì)胞，以特定方法促使功能性淋巴細(xì)胞增殖，制成高純度、特異識(shí)別以及有殺傷標(biāo)靶細(xì)胞（例如腫瘤、病毒感染的細(xì)胞等）功能的IEC。IEC的特點(diǎn)在于除了含有多種免疫活化所需的功能性細(xì)胞外，還可以促使免疫反應(yīng)更加完整、活躍，達(dá)到高效清除病原的目的。有研究表明，提取患者自身DC，在體外經(jīng)過HBcAg刺激后回輸?shù)襟w內(nèi)能夠促進(jìn)T細(xì)胞免疫，從而抑制病毒復(fù)制和改善肝功能［12］。而Weiwei等［13］發(fā)現(xiàn)，通過HBcAg活化的DC能夠產(chǎn)生針對(duì)于HBV特異性的CD8+細(xì)胞反應(yīng)。

本研究提取轉(zhuǎn)HBV基因C57BL/6小鼠DC及淋巴細(xì)胞，通過不同的HBV蛋白刺激DC成熟，并通過成熟的DC與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)得到IEC，在體外HepG 2.2.15細(xì)胞（含有完整的HBV基因）共培養(yǎng)，結(jié)果顯示了細(xì)胞間并沒產(chǎn)生異種細(xì)胞間的排斥反應(yīng)，肝細(xì)胞的ALT有變化，但與對(duì)照組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ALT有下降趨勢(shì)，故免疫細(xì)胞療法不會(huì)造成肝細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷［14］，可能有修復(fù)肝細(xì)胞膜的作用。提示我們采用的體外處理方法對(duì)HBV的研究是可行的。其次我們發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)抗原刺激的成熟DC與淋巴細(xì)胞共刺激組較未成熟DC與淋巴細(xì)胞組HepG 2.2.15細(xì)胞上清HBV DNA水平明顯下降，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA和cccDNA水平也明顯下降。說明該種成熟DC作用后的淋巴細(xì)胞具有明顯的抑制HBV cccDNA的合成以及分泌的作用。

HBV cccDNA在HBV復(fù)制過程中起關(guān)鍵作用，是HBV復(fù)制的突出標(biāo)志，很難被清除，監(jiān)測(cè)其水平被認(rèn)為是目前評(píng)價(jià)抗HBV療效或臨床治愈的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前認(rèn)為，機(jī)體通過免疫清除HBV cccDNA的途徑主要為：① 通過細(xì)胞溶解機(jī)制，清除感染的肝細(xì)胞，HBV被巨噬細(xì)胞吞噬或與抗-HBs抗體結(jié)合成為免疫復(fù)合物后被巨噬細(xì)胞吞噬并從尿中排出，破壞的肝細(xì)胞由新生肝細(xì)胞替代；② 通過Th1反應(yīng)介導(dǎo)的依賴細(xì)胞因子的非細(xì)胞溶解機(jī)制，如IFN-γ、TNF-α和IL-2等細(xì)胞因子介導(dǎo)非細(xì)胞裂解機(jī)制清除細(xì)胞核內(nèi)的HBV cccDNA或阻斷合成新的HBV cccDNA，即通過細(xì)胞因子的作用“治療”感染［15-16］，從而清除HBV。目前在移植患者中發(fā)現(xiàn)可以通過供者針對(duì)HBV的過繼免疫而實(shí)現(xiàn)HBV的清除［17］。

為了解釋其原因及機(jī)制，我們檢測(cè)了致敏淋巴細(xì)胞的亞群變化，發(fā)現(xiàn)特異性IEC在作用HBV的早期主要以CD8+細(xì)胞為主，CD4+細(xì)胞水平明顯降低，CD4+/ CD8+比值顯著降低，48小時(shí)以后CD4+細(xì)胞明顯升高，表明IEC的抗HBV的早期作用主要是CD8+細(xì)胞發(fā)揮的，隨后以CD4+T細(xì)胞作用為主；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，CD4+/CD8+比值上升，而細(xì)胞的HBV DNA水平明顯下降，可能與在抗HBV過程中CD4+和CD8+細(xì)胞直接參與有關(guān)［18-19］。HBV DNA水平降低，CD4+/ CD8+比值卻明顯升高，說明IEC的亞群改變首先是CD4+/ CD8+比值的降低，而后在HBV作用后升高，并且與異種細(xì)胞間的排異反應(yīng)無關(guān)。有研究表明，IEC的CD8+淋巴細(xì)胞是決定HBV清除的關(guān)鍵細(xì)胞亞群，細(xì)胞溶解或非溶解機(jī)制（IFN-γ和TNF-α等）是CD8+T細(xì)胞清除HBV的主要方式，而CD4+淋巴細(xì)胞主要通過分泌Thl細(xì)胞因子來抑制HBV復(fù)制［20-21］，提示此種情況下加強(qiáng)急性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的治療和疫苗的策略是有意義的。而DC是目前已知的唯一能激活Th0細(xì)胞向Thl細(xì)胞或Th2細(xì)胞分化的功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞［22］。為了進(jìn)一步解釋其機(jī)制，我們對(duì)各組進(jìn)行了細(xì)胞因子的檢測(cè)。

Th1和Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群相互拮抗，Thl/Th2動(dòng)態(tài)平衡是機(jī)體處于正常免疫狀態(tài)的保證［23］。Thl主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-3等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子誘發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)微生物對(duì)宿主的感染，尤其是病毒與細(xì)胞內(nèi)感染的免疫性和防御功能，達(dá)到清除病毒的目的；Th2主要分泌IL-10、IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可刺激B細(xì)胞增生，產(chǎn)生相應(yīng)抗體，誘發(fā)體液免疫反應(yīng)［24］，并與感染的進(jìn)展、慢性化有關(guān)。Thl/Th2的失衡應(yīng)答可能是HBV感染慢性化的主要機(jī)制，這種失衡又體現(xiàn)在細(xì)胞因子失調(diào)方面［25］。IFN-γ、IL-2能正向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，清除侵入體內(nèi)的病毒抗原。IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，也可抑制Th1成熟和產(chǎn)生相應(yīng)細(xì)胞因子，故IFN-γ、IL-2、IL-10可大致代表 Th1 / Th2的功能［26-27］。我們檢測(cè)了IFN-γ、IL-2和IL-10，結(jié)果顯示，HBV DNA高表達(dá)時(shí)，IFN-γ和IL-2水平下降，而IL-10均升高，HBV DNA低表達(dá)時(shí)，IFN-γ和IL-2水平上升，而IL-10水平下降。由于IFN-γ分泌增加可使CD4+T細(xì)胞向Th1分化，抑制Th2形成，從而激活HBV特異的CTL克隆增殖，殺傷HBV［28］。IL-10含量升高，且伴隨病毒載量增高而增加，顯示HBV致病與免疫應(yīng)答中Th2介導(dǎo)的體液免疫活性偏高有關(guān)系。IL-10水平升高抑制了Th1群細(xì)胞的功能，使Th1分泌IFN-γ和IL-2的量減少，細(xì)胞免疫效應(yīng)降低，機(jī)體清除病毒能力減弱，導(dǎo)致病毒持續(xù)存在［29］。有研究報(bào)道HBV感染者血清IL-10濃度明顯高于正常對(duì)照組，HBV高載量組感染者血清IL-10濃度明顯高于正常對(duì)照組和低載量組［30］，說明細(xì)胞因子與肝細(xì)胞中HBV DNA的消長(zhǎng)有一定關(guān)系，特別是與肝細(xì)胞中HBV cccDNA、HBV DNA的關(guān)系需要進(jìn)一步研究，以探討cccDNA的清除與機(jī)體免疫的關(guān)系。

以往人們對(duì)血清及腹腔積液中細(xì)胞因子與HBV DNA的研究較多，但對(duì)細(xì)胞因子與肝細(xì)胞中HBV DNA及HBV cccDNA的關(guān)系卻研究較少。本研究結(jié)果證實(shí)，IEC對(duì)體外HBV DNA及HBV cccDNA均有明顯的抑制作用，這一結(jié)果也與其他報(bào)道［31-33］一致。通過對(duì)轉(zhuǎn)HBV基因小鼠的DC處理的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，可以證明體外IEC中HBV特異性的CD4+和CD8+細(xì)胞對(duì)HBV清除和疾病轉(zhuǎn)歸有重要影響，對(duì)體外HBV復(fù)制及分泌均有抑制作用。肝移植術(shù)后HBV再感染的病原來源于病肝釋放到循環(huán)中的病毒顆粒，或者淋巴系統(tǒng)及淋巴細(xì)胞等肝外組織中存在的病毒［34］。而移植術(shù)后，隨著大量免疫抑制劑的應(yīng)用，肝移植受體術(shù)后外周血來源的DC呈遞乙肝表面抗原的能力低下，針對(duì)HBV的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答低下，此種功能缺陷是導(dǎo)致受體針對(duì)HBV的主動(dòng)免疫反應(yīng)性低的重要原因［35］。特異修飾的DC刺激淋巴細(xì)胞可以在很大程度上減少HBV的復(fù)制，不會(huì)造成肝功能的損傷。這種療法可能在不久的將來用于預(yù)防和治療移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)患者。

綜上所述得出以下結(jié)論：① IEC與異種肝細(xì)胞體外混合培養(yǎng)，細(xì)胞間不產(chǎn)生排斥反應(yīng)；② 轉(zhuǎn)HBV基因鼠DC誘導(dǎo)的IEC對(duì)體外HBV復(fù)制有明顯的抑制作用，為免疫細(xì)胞療法在臨床中的應(yīng)用提供理論依據(jù)；③ Th1/Th2平衡可能在控制體外HBV復(fù)制及分泌過程中處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡；④ 細(xì)胞因子在抗HBV中發(fā)揮重要作用，可能也是保護(hù)肝細(xì)胞損傷的重要因素。