儲 俐 鄭燕林 李 妍 馬素紅

水蛭滲濾液對猴RF/6A細胞表達TNF-α的影響

儲 俐1鄭燕林2李 妍3馬素紅4

目的觀察水蛭滲濾液對凝血酶誘導下猴脈絡膜-視網(wǎng)膜（內(nèi)皮）細胞（RF/6A）表達促血管生成因子TNF-α的影響。方法采用消化培養(yǎng)法，對猴RF/6A細胞進行體外傳代培養(yǎng)，選擇20 μ/ml的凝血酶作為誘導濃度，分別作用于RF/6A細胞2、4、6、8、10、12及24 h，用ELISA法觀察凝血酶對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞表達TNF-α的誘導情況。觀察在有或無凝血酶誘導下水蛭滲濾液（64 mg/ml）對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞表達TNF-α的影響。結果（1）凝血酶作用2 h，TNF-α的表達開始增加，作用4 h，TNF-α的表達達到最大，持續(xù)至10 h；4、6、8 h與空白組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；當凝血酶作用時間達12 h，TNF-α的表達開始下降，凝血酶組與空白組12 h和24 h比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（2）水蛭滲濾液對有或無凝血酶誘導組都能下調(diào)TNF-α的表達（P＜0.05）。結論水蛭滲濾液能下調(diào)凝血酶誘導下猴RF/6A細胞表達TNF-α。

水蛭滲濾液；凝血酶；視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞；TNF-α

視網(wǎng)膜新生血管（retinal neovascularization）病變，能導致嚴重的中心視力損害，目前臨床治療方法有手術切除、黃斑轉位、激光光凝、光動力療法等，但是一旦視力受損，大多數(shù)治療對于視力的恢復是有限的，還有可能加速新生血管的生成或是損傷正常視網(wǎng)膜組織；另外，視網(wǎng)膜新生血管仍有復發(fā)的可能，而且這些治療的費用不菲。

我們前期的實驗發(fā)現(xiàn)，64 g/L水蛭滲濾液可以抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，將細胞阻滯在G1期〔1〕，同時，水蛭滲濾液可使內(nèi)皮細胞跨膜受體VEGF R2表達明顯減少〔2〕，從一定層次說明水蛭對視網(wǎng)膜新生血管有抑制作用。但是水蛭是如何防治視網(wǎng)膜新生血管性疾病的機制目前尚不清楚。本研究通過觀察水蛭滲濾液對凝血酶誘導下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞表達TNF-α的情況，力圖從另一角度初步探討水蛭防治視網(wǎng)膜新生血管性疾病的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及主要試劑：恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（rhesus retinal endothelial cell，RF/6A，上海中國科學院細胞庫）。水蛭（四川新荷花中藥飲片有限股份公司，產(chǎn)地：山東，批號：070301）。RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco BRL，美國），特級胎牛血清（北京元亨公司，中國），胰蛋白酶（Gibco BRL，美國），PBS平衡鹽溶液（北京中杉生物技術有限公司，中國），凝血酶（Sigma公司，美國），中藥水蛭滲濾液（成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑科，批號：2007030201），TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（Sigma公司）等。

1.1.2 主要實驗器材：M-Q型超凈工作臺（Heraeus公司，德國），CO2培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本），Herzeus varifuge 3.0RS型低速離心機（Kendro公司，美國），1-13型高速離心機（Sigma公司，美國），Mili-Q型超純水系統(tǒng)（Milipore公司，美國），550型酶標儀（Biorad公司，美國），MO-18型倒置像差顯微鏡（Olympus，日本）等。

1.1.3 實驗用水蛭滲濾液的制備：取水蛭，60～65℃干燥3小時，粉碎成粗粉，照2005年版《中國藥典》一部流浸膏劑與浸膏劑項下的滲濾法，用60%乙醇作溶劑，浸漬48 h后，收集滲濾液，回收乙醇至無醇味，定容，調(diào)整pH值至6.5～7.5，靜置，取上清液，濾過（0.45微孔濾膜），即得。本品每1 ml含抗凝血酶活性為24.0 μ。取1 ml水蛭提取原液（5 g/ml）加入38 ml DMEM液中，保存濃度為128 mg/ml，調(diào)pH值為7.4。過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細胞的傳代培養(yǎng)及鑒定：恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)及鑒定：0.25%胰蛋白酶消化后，用完全1640培養(yǎng)液制成內(nèi)皮細胞懸液，調(diào)整細胞濃度接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，每2～3 d換液1次。恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞80%融合后，消化傳代培養(yǎng)，取傳2代細胞，采用Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色法在光鏡和電鏡下觀察細胞形態(tài)并進行細胞鑒定。1.2.2凝血酶誘導RF/6A細胞表達TNF-α的測定：選取指數(shù)生長的RF/6A細胞，按3×104個/ml的單細胞懸液，每孔200 μl接種于96孔培養(yǎng)板，加入20 NIHU/ml凝血酶溶液，空白組只加入RPMI1640，分別培養(yǎng)2、4、6、8、10、12及24 h。取上清液，離心后分裝于EP管中。建立標準曲線后，取分裝于EP管中的細胞培養(yǎng)上清液，以每孔100 μl注入經(jīng)Ⅰ抗包被的96孔酶標板中。置孵箱中反應90 min。按每孔100 μl依次加入親和素——過氧化物酶復合物（ABC）液，置孵箱中反應60 min。洗板5次后，按每孔90 μl加入TMB顯色液，置于孵箱中反應10 min。按每孔100 μl依次加入TMB終止液。用酶標儀在450 nm測定光密度D（450 nm）。

1.2.3 水蛭對凝血酶誘導下RF/6A細胞表達TNF-α的影響：取指數(shù)生長的RF/6A細胞，按3×104個/ ml的單細胞懸液，每孔200 μl接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，細胞貼壁生長。棄原培養(yǎng)液，加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)液200 μl，培養(yǎng)24 h，使細胞相對同步化。棄原培養(yǎng)液，隨機分成空白對照組（只加入RPMI1640培養(yǎng)液），凝血酶組（加入以RPMI1640培養(yǎng)液配制的20 NIHU/ml凝血酶溶液），水蛭滲濾液組（加入以RPMI1640培養(yǎng)液配制的水蛭滲濾液64 mg/ml）和合藥組（同時加入凝血酶溶液以及水蛭滲濾液），同時孵育10 h。取上清液，離心后分裝于EP管內(nèi)。建立標準曲線后，吸取分裝于EP管中的細胞培養(yǎng)上清液，以每孔100 μl注入經(jīng)Ⅰ抗包被的96孔酶標板中。棄酶標板內(nèi)液體，按每孔100 μl依次加入生物素抗TNF-α抗體，置孵箱反應60 min。洗板3次后按每孔100 μl依次加入親和素——過氧化物酶復合物（ABC）液，置于孵箱反應60 min。再洗板5次，按每孔90 μl依次加入已經(jīng)平衡30 min的TMB顯色液，加蓋，置孵箱避光反應10 min。按每孔100 μl依次加入TMB終止液。用酶標儀在450 nm測定光密度D（450 nm）。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)資料采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料用x±s表示，組間差異性比較用單因素方差分析。多組間兩兩比較用S-N-K檢驗，不同時間點兩組組間及組內(nèi)比較采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血管內(nèi)皮細胞鑒定

細胞膜表面見棕黃色陽性顆粒（第Ⅷ因子相關抗原），即免疫組化染色為陽性反應，證實細胞類型為血管內(nèi)皮細胞（圖1）。

2.2 凝血酶對體外培養(yǎng)的RF/6A細胞表達TNF-α的影響

兩組RF/6A細胞不同時間點的TNF-α表達量不同（重復測量方差分析，同組內(nèi)不同時間點比較：空白組TNF-α的含量間差異無統(tǒng)計學意義（F=0.483，P=0.666）。凝血酶組TNF-α的含量間差異有統(tǒng)計學意義（F=12.98，P=0.00）；時間與組別之間存在交互效應，說明凝血酶組和空白對照組的TNF-α含量隨時間變化趨勢有所不同，交互效應F=4.283，P=0.008）；交互效應F=4.283，P=0.008），凝血酶組TNF-α表達在2、4、6、8、10 h時高于空白對照組（P＜0.05），在12、24 h時與空白對照組接近（P＞0.05）。從時間變化上看，空白對照組的TNF-α表達較為平穩(wěn)，凝血酶組的TNF-α表達則表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢（表1）。

2.3 蛭滲濾液對凝血酶誘導RF/6A細胞TNF-α表達的影響

凝血酶組、空白對照組、水蛭組以及合藥組TNF-α表達的光密度值分別為0.075±0.002，0.061± 0.003，0.039±0.003，0.045±0.002，四組差異有統(tǒng)計學意義（單因素方差分析，F(xiàn)=53.42，P＜0.05）。水蛭組及合藥組的TNF-α表達均低于凝血酶組及空白對照組，合藥組的TNF-α表達為最低（S-N-K法，P＜0.05）。

圖1 細胞膜表面見棕黃色陽性顆粒（第Ⅷ因子相關抗原），證明是血管內(nèi)皮細胞光鏡100×

3 討論

視網(wǎng)膜新生血管的形成是一個復雜的過程，其中，血管內(nèi)皮細胞是關鍵靶細胞〔3〕，同時，促血管生成因子，如TNF-α、VEGF等的過度表達是視網(wǎng)膜新生血管形成的重要環(huán)節(jié)。平時在外周血液循環(huán)中，血管內(nèi)皮細胞處于血管生成因子和抑制因子的復雜精細平衡穩(wěn)態(tài)下，因此局部的血管生長處于靜止狀態(tài)〔4-6〕。凝血酶則是視網(wǎng)膜新生血管性疾病中打破這一平衡最為常見和關鍵的誘因。視網(wǎng)膜新生血管性疾病是一種以視網(wǎng)膜反復出血為主要特征的疾病，一旦出血則導致局部凝血酶表達的極度上調(diào)，這也將誘導大批的促血管生成因子如TNF-α的分泌增加，從而打破血管生成微環(huán)境的平衡，誘導視網(wǎng)膜新生血管的生成〔7-8〕。

視網(wǎng)膜新生血管性疾病屬中醫(yī)“眼底血癥”范疇，中醫(yī)藥在阻止視網(wǎng)膜新生血管性疾病病情進展方面有較好的療效。唐容川在《血證論》中明確指出“血癥當以祛瘀為要”，臨床眼科醫(yī)家對視網(wǎng)膜出血性疾病也始終以祛瘀為基本治法，取得了很好的療效〔9-12〕。在這一理論的指導下，成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院眼科研制的以水蛭為主藥的“化瘀散結片”已經(jīng)在臨床運用和研究多年，臨床療效良好〔13-14〕。

3.1 凝血酶對視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞表達TNF-α的誘導

凝血酶與細胞表面的凝血酶受體即蛋白酶活化受體（protease-activated receptor，PAR）結合，引起受體活化〔15〕，受體活化后進一步激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）〔16〕，使IkB磷酸化降解，與NF-κB解離，暴露NF-κB的核識別位點，使NF-κB進入核內(nèi)，促進TNF-α基因的轉錄。本研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶能夠在2、4、6、8、10 h誘導TNF-α表達的增加，并且在10 h達高峰，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），凝血酶能夠上調(diào)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞對促血管生成因子TNF-α的表達，從一定程度上誘導視網(wǎng)膜新生血管的形成，這與國外的研究報道有相似之處〔17-18〕。

有研究發(fā)現(xiàn)〔19〕，在體內(nèi)NF-κB的激活過程受精細的反饋調(diào)節(jié)調(diào)控。正反饋調(diào)節(jié)：NF-κB激活后，可增強TNF-α和白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等的基因轉錄，促使TNF-α和IL-1β產(chǎn)生和釋放增多，后者又導致NF-κB的進一步激活。負反饋調(diào)節(jié)：當細胞內(nèi)NF-κB激活時，胞質內(nèi)IkB的mRNA表達和蛋白合成增強。本研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶作用2 h，TNF-α的表達開始增加，作用4 h，TNF-α的表達達到最大，持續(xù)至10 h；當凝血酶作用時間達12 h，TNF-α的表達開始下降，經(jīng)統(tǒng)計學分析，凝血酶組與空白組12 h和24 h，TNF-α的表達間差異無統(tǒng)計學意義。因此推測12 h可能是負反饋調(diào)節(jié)的節(jié)點，這還有待進一步深入研究證實。

3.2 水蛭滲濾液對凝血酶誘導下視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞表達TNF-α的影響

過去20年的廣泛深入研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素含有與凝血酶受體相似的結構——K51YEPF55，它能與凝血酶結合從而阻止凝血酶與其活性受體PAR-1的結合〔20-21〕，使凝血酶無法進一步發(fā)揮其生物學反應。本研究發(fā)現(xiàn)，水蛭滲濾液能夠抑制凝血酶誘導下的TNF-α表達，合藥組TNF-α表達低于凝血酶誘導組（P＜0.05），推測水蛭滲濾液對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞TNF-α表達的下調(diào)，是通過對凝血酶的阻斷來實現(xiàn)的。

同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，水蛭滲濾液單獨作用組的TNF-α表達也低于空白組。這是否與TNF-α表達相關的PKC、PKA的激活有關呢？還是與其他途徑有關。這還有待于今后更進一步的深入研究。

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Effect of leech extract on thrombin induced monkey RF/6A cell in expressing angiogenesis-promotingfactor TNF-α

CHU Li，ZHENG Yanlin，LI Yan，et al.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China

OBJECTIVE To observe the affection of Leech extract to RF/6A cell by thrombin-induced and to investigate the mechanism of preventive affection of retinal choroidal neovascularization.METHODS RF/6A cell cultured in vitro by digestion culture，and induced by thrombin（20 μ/ml，2，4，6，8，10，12，24 hour）to observe the express of TNF-α cytokine.Simultaneously，we observed the express of TNF-α by leech extract（64 mg/ml）to RF/6A cell，with or without thrombin-induced.RESULTS The leech extract could decline the TNF-α express of RF/6A cell，with or without thrombin-induced.CONCLUSIONS Leech extract could prevent the retinal vascular disease，from a certain extent，by blocking thrombin activation to reduce retinal angiogenesis factor TNF-α expression to achieve.

leech extract；thrombin；retinal endothelial cell；TNF-α

R285

A

1002-4379（2015）05-0314-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.05.002

中國國家博士點基金資助課題（編號：20050633003）

1成都中醫(yī)藥大學，成都610072

2成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院眼科

3四川省瀘州醫(yī)學院附屬中醫(yī)醫(yī)院眼科

4云南省中醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科

鄭燕林，E-mail：zyl3327@163.com