李雪磊，米盈盈，王秋紅，匡海學(xué)

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040）

酸性染料比色法測(cè)定雅連中總生物堿的含量

李雪磊，米盈盈，王秋紅*，匡海學(xué)

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040）

目的：測(cè)定雅連中總生物堿的含量，為其質(zhì)量的控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)品，采用酸性染料比色法測(cè)定雅連總生物堿的含量。結(jié)果：鹽酸小檗堿在44.7～178.8μg·mL-1內(nèi)，回歸方程為Y=1.7765χ+0.124，r=0.9991，吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為100.35%，RSD=1.02%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確度好，有一定的專屬性，為雅連質(zhì)量的控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

雅連；總生物堿；酸性染料比色法

雅連為四川著名道地藥材，來(lái)源于毛茛科植物三角葉黃連（Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao）的根莖，其味苦，寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，清熱燥濕，瀉火解毒?！侗静菥V目》記載“今雖吳蜀皆有，惟以雅州，眉州者良?！倍嘤糜跐駸崞M，嘔吐吞酸，瀉痢，黃疸，高熱神昏，心火亢盛，心煩不寐，血熱吐衄，目赤，牙痛，消渴，癰腫疔瘡；外治濕疹、濕瘡，耳道流膿等疾病[1]，是一種被廣泛應(yīng)用的清熱燥濕解毒藥[2]。雅連根莖中分離出的主要成分為小檗堿等季胺型生物堿[3]及多糖等非生物堿成分，尚含有多種微量元素。其中生物堿類成分具有抗病菌，改善糖尿病等良好作用，具有很好的研究?jī)r(jià)值。但用酸性染料比色法測(cè)定雅連總生物堿尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用酸性染料比色法測(cè)定雅連總生物堿含量，其準(zhǔn)確，專屬性較好，且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求較為嚴(yán)格[4]，為雅連質(zhì)量的控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試藥

Specord 250 PLUS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）；FE20型pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；METTLER TOLEDO NewClassical MS天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

雅連藥材（四川省眉山市洪雅縣瓦屋山藥業(yè)）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度≥98%）；溴甲酚綠（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；溴甲酚紫（天津市光復(fù)化工研究所）；溴百里香酚蘭（天津市光復(fù)化工研究所）；枸櫞酸（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）；枸櫞酸鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；磷酸氫二鈉（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）；甲醇（A.R.西隴化工股份有限公司）；水為蒸餾水，氯仿（A.R.）。

1.2 試驗(yàn)溶液的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的鹽酸小檗堿對(duì)照品8.94mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為178.8μg· mL-1的對(duì)照品溶液。

1.2.1 供試品溶液的制備取干燥雅連粉末1g，置于干燥的100mL圓底燒瓶中，加入80%的乙醇50mL回流提取1h，抽濾，同法提取兩次，合并濾液并定容于10mL容量瓶中，精密吸取1mL上述溶液，定溶于10mL容量瓶中加水至刻度，搖勻，既得供試品溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件的選擇

2.1.1 酸性染料種類的選擇精密吸取1.0mL蒸餾水，置于分液漏斗中，加入pH值為4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液5.0mL，分別各取溴甲酚綠2.5mL、溴甲酚紫、溴百里香酚蘭酸性染料溶液，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層，作為空白對(duì)照溶液組，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液1.0mL，置于分液漏斗中，加入pH值為4.5的5.0mL枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液，分別各取2.5mL溴甲酚綠、溴甲酚紫、溴百里香酚蘭酸性染料溶液，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層，作為離子對(duì)提取溶液組，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

根據(jù)結(jié)果可知，溴甲酚紫空白對(duì)照溶液在300～500nm范圍內(nèi)有較大吸光度，干擾較大；溴百里香酚蘭與鹽酸小檗堿形成的離子對(duì)在300～500nm范圍內(nèi)的最大吸光度最高，故酸性染料確定為溴百里香酚蘭。

2.1.2 緩沖溶液的選擇精密吸取1.0mL蒸餾水，置于分液漏斗中，分別加入pH值為4.5的5.0mL枸櫞酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液、枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加入2.5mL溴百里香酚蘭，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層，作為空白對(duì)照溶液組，分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液1.0mL，置于分液漏斗中，分別加入pH值為4.5的枸櫞酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液5.0mL、枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加入溴百里香酚蘭2.5mL，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層，作為離子對(duì)提取溶液組，分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

根據(jù)結(jié)果可知，乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中空白對(duì)照溶液干擾較大；枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液中離子對(duì)吸光度最大，故緩沖溶液確定為枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液。

2.1.3 緩沖溶液pH值的選擇精密吸取1.0mL鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，加入pH值為3.5的5.0mL枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液溶，加入溴百里香酚蘭2.5mL，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層在417nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。同方法測(cè)定pH值4.0、4.5、5.0、5.5時(shí)的吸光值。

根據(jù)結(jié)果可知，pH值為4.5時(shí)離子對(duì)吸光度最大，離子對(duì)吸光度最大故緩沖溶液pH值確定為4.5。2.1.4酸性染料用量的選擇精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液1mL，置于分液漏斗中，加入pH值為4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液5.0mL，分別各取2.5mL溴百里香酚蘭酸性染料溶液，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層在417 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。同法測(cè)酸性染料量為1.5、2.0、2.5、3.0mL時(shí)的吸光值。

根據(jù)結(jié)果可知，酸性染料用量為2.5mL時(shí)離子對(duì)吸光度最大，故酸性染料用量定為2.5mL。

2.1.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇根據(jù)2.2.1及2.2.2分析得出波長(zhǎng)為417nm時(shí)有最大吸收峰，故波長(zhǎng)的選擇為417nm。

2.1.6 總生物堿的測(cè)定精密吸取對(duì)照品溶液0.25、0.4、0.55、0.7、0.85、1.0mL加入甲醇至1.0mL，按測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，在417nm處測(cè)定吸收度，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1.7765χ+0.124，r=0.9991.結(jié)果表明鹽酸小檗堿在44.7～178.8μg·mL-1的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 酸性染料比色法的方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)精密量取對(duì)照液1.0mL，置于分液漏斗中，加入pH值為4.5的5.0mL枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液，取溴百里香酚蘭酸性染料溶液2.5mL，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層在417nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，連續(xù)測(cè)定6次。測(cè)得RSD=1.74%，說(shuō)明儀器所測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2.2.2 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取生雅連供試品溶液和酒黃連供試品溶液1.0mL，加入pH值為4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液5.0mL，取溴百里香酚蘭酸性染料溶液2.5mL，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層在417 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每間隔0.5h在417nm處測(cè)定吸收度。測(cè)得RSD為1.31%,表明其在2h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取6份已知濃度的供試品溶液各0.5mL，分別精密加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4mL對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋至1.0mL，混勻，按以上方法比色測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 雅連總生物堿回收率Tab.1 The results of recovery test

2.2.4 樣品含量測(cè)定精密稱取干燥雅連粉末1g，按1.2.1項(xiàng)下制備樣品供試液。精密吸取樣品供試液1mL，加入pH值為4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液5.0mL，取溴百里香酚蘭酸性染料溶液2.5mL，搖勻，加入三氯甲烷10mL，振搖5min，靜置30min，取三氯甲烷層在417 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雅連總生物堿的含量，得出雅連總生物堿含量分別為0.1489g·g-1。

3 結(jié)論

酸性染料比色法是生物堿類與氫離子生成陽(yáng)離子，酸性染料與其定量結(jié)合成有色絡(luò)合物，被有機(jī)溶劑提取，在一定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度，即可計(jì)算出總生物堿的含量[5]。酸性染料比色法所測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，近年來(lái)應(yīng)用較多[6]。

本文對(duì)酸性染料的種類及用量、檢測(cè)波長(zhǎng)、緩沖液pH值、緩沖液的選擇等多個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，找到最佳條件。該方法具有一定的專屬性和準(zhǔn)確度，靈敏度高，簡(jiǎn)便易行[7]，適用于雅連總生物堿含量的測(cè)定，用于其質(zhì)量的控制。

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表4 不同混合時(shí)間藥槳粘度Tab.4 Viscosity of slurry with different mixing time

由表4可以看出，隨著混合時(shí)間延長(zhǎng)，藥槳粘度不斷增加。這是因?yàn)榛旌蠒r(shí)間越長(zhǎng)，陶粒的酸解程度加大，導(dǎo)致藥槳粘度增大。

3 結(jié)論

（1）陶粒添加到復(fù)合推進(jìn)劑中后，會(huì)產(chǎn)生一定程度的酸解，導(dǎo)致藥槳粘度增大。相同密度條件下陶粒粒徑越小，酸溶解度越高，藥槳粘度越大。陶粒密度差異對(duì)藥槳粘度影響不大。

（2）陶粒添加比例增大，復(fù)合推進(jìn)劑體系的固含量上升，藥槳粘度增大。

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Determination of total alkaloids in coptidis deltoideae by acid dye colorimetry

LI Xue-lei，MI Ying-ying，WANG Qiu-hong，KUANG Hai-xue
（Key Laboratory of Chinese Materia Medica（Ministry of Education），Hei Long Jiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Objectiue：To determine total alkaloids in coptidis deltoideae,which can be used for quality control. Methods:Berberine hydrochloride was used as a control standard.The contents of total alkaloids were determined by acid dye colorimetry.Results:The linear range of berberine hydrochloride was 44.7～178.8μg·mL-1,the regression equation was Y=1.7765χ+0.124,r=0.9991.The average recovery was 100.35%,and RSD was 1.02%.Conclusion:This method is accurate with good reproducibility,which can be used for quality control.

coptidis deltoideae；total alkaloids；acid dye colorimetry

R927.2

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20151229

2015-08-31

李雪磊（1990-），女，黑龍江牡丹江人，在讀研究生，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究。

王秋紅，教授，從事中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、中藥性味理論研。