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透骨消痛顆粒干預OA早期 COX-2和iNOS表達的實驗研究

2015-11-25 11:06:36高雪偉中船武漢六七二醫(yī)院骨科湖北武漢430079
轉(zhuǎn)化醫(yī)學電子雜志 2015年1期
關(guān)鍵詞:透骨滑膜軟骨

高雪偉 (中船武漢六七二醫(yī)院骨科,湖北 武漢 430079)

透骨消痛顆粒干預OA早期 COX-2和iNOS表達的實驗研究

高雪偉 (中船武漢六七二醫(yī)院骨科,湖北 武漢 430079)

目的:通過動物試驗探討透骨消痛顆粒對骨性關(guān)節(jié)炎早期環(huán)氧化酶-2(COX-2)和誘導性一氧化氮合酶(iNOS)表達的影響,研究透骨消痛顆粒在膝骨性關(guān)節(jié)炎治療中的相關(guān)作用機制.方法:新西蘭大白兔采用改良Hulth法造模,造模成功后隨機分成3組:模型組、對照組、實驗組,和正常組共4組,分別灌胃給藥4周后處死動物取材,并觀測如下指標:關(guān)節(jié)腔大體觀察,滑膜與軟骨組織學觀察;關(guān)節(jié)液內(nèi) NO、NOS、PGE2含量檢測,滑膜軟骨中iNOS、COX-2含量檢測.結(jié)果:4周后關(guān)節(jié)液中 NO、NOS含量、PGE2濃度,滑膜和軟骨中iNOS、COX-2含量,模型組、對照組、實驗組均呈高表達,與正常組比較差異有顯著性(P<0.05);對照組、實驗組與模型組比較差異有顯著性(P<0.05);對照組與實驗組比較差異有顯著性(P<0.05).結(jié)論:透骨消痛顆??赏ㄟ^抑制COX-2和 iNOS在 OA早期滑膜和軟骨細胞中的表達及其誘導產(chǎn)物PGE2和 NO的生成,從而達到控制OA早期炎癥、減輕疼痛、緩解癥狀的作用.

透骨消痛顆粒;骨性關(guān)節(jié)炎;滑膜;軟骨;COX-2;iNOS;NO;PGE2

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種多發(fā)病,常見于中老年人群,在我國其患病率40歲以上人群為10%~17%,60歲以上為 50%,75歲以上則達80%,而該病最終致殘率為53%[1],是影響中老年人活動最常見的原因.透骨消痛顆粒重要成分為杭白芍、巴戟天、川芎和腫節(jié)風,全方具有補肝腎、強筋骨之功效.輔以活血化淤、舒筋通絡、祛風除濕的治療效果,對改善膝 OA的癥狀有著良好療效.本課題擬通過動物試驗探討透骨消痛顆粒對 OA早期環(huán)氧化酶-2(COX-2)和誘導性一氧化氮合酶(iNOS)表達的影響,探討透骨消痛顆粒治療膝 OA療效作用機制.

1 材料和方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔,6月齡,實驗對象空腹體重為(2 100±100)g,雌性30只、雄性30只,全部由上海醫(yī)用動物實驗中心提供,并安全運輸至實驗地(福建省中西醫(yī)結(jié)合研究院的動物中心進行),動物合格證號:SCXK(滬)2008-0009.經(jīng)過適應性喂養(yǎng)1周.

1.2 藥物制備 透骨消痛顆粒:所需中藥顆粒劑均由福建省第二人民醫(yī)院制劑室提供,制成水煎劑,每10 mL含生藥1.12 g.壯骨關(guān)節(jié)丸(批準文號:國藥準字Z44023377);鹽酸氯胺酮注射液(批準文號:國藥準字H32O22820);注射用青霉素鈉80萬 u(批準文號:國藥準字H37021950);滅菌注射用水(批準文號:國藥準字H44020786).

1.3 主要試劑 一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20081215);一氧化氮合成酶試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20081215);PGE2(ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供,批號:0811165);誘導型一氧化氮合酶原位雜交試劑盒(武漢博士德生物試劑有限公司提供,批號20080908);COX-2免疫組化全套試劑盒(武漢博士德生物試劑有限公司,批號:20060408).

1.4 主要儀器 酶標儀(ELX808U),美國 BIO-TEK公司;半自動生化分析儀(BT224),意大利生物技術(shù)公司;離心機(DDL-5),上海安亭科學儀器廠;醫(yī)用冰箱(MDF-U5410),SANYO;電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082),上海精宏實驗設備有限公司;電熱恒溫水浴箱(HH1600),上海躍進醫(yī)療器械廠;微量振蕩器(ZW-A),常州國華電器有限公司;全自動酶標洗板機(ELx50),美國BIO-TEK公司.

1.5 動物分組及實驗方法 采用抽簽法隨機分為正常組(15只)和造模組(45只).正常組兔子予以正常飼養(yǎng)看護;造模組兔子在常規(guī)術(shù)前準備基礎上行改良Hulth法造模[2].造模成功后再用抽簽法隨機分成3組:模型組、對照組、實驗組,每組15只(表1).模型組兔子予以生理鹽水10 mL/d灌胃處理;對照組兔子則用壯骨關(guān)節(jié)丸水溶液10 mL/d(含壯骨關(guān)節(jié)丸1.12 g)灌胃處理;實驗組給予透骨消痛顆粒水溶液10 mL/d(含生藥量1.12 g)灌胃,共4周.

表1 動物分組及實驗方法 (n=15)

在驅(qū)趕過程中,兔群相互擠壓、踩塌造成外傷致死有2只,分別在模型組和實驗1組;在灌胃過程中,藥物溶液返流導致誤吸死亡4只,模型組、對照組、實驗1、2組各1只.

1.6 標本取材 采用耳緣靜脈麻醉的方法對藥物干預4周的兔子進行麻醉,將麻醉后的兔子于右膝半屈曲位置于實驗臺,定位關(guān)節(jié)腔穿刺點,緩慢注入 1 mL生理鹽水,之后反復活動關(guān)節(jié),待充分接觸后抽取關(guān)節(jié)液至EP管內(nèi),4 000 r/min離心 10 min取上清液,在 -20℃環(huán)境下保存.處死并解剖兔子,觀察關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu).刀片切取大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的內(nèi)側(cè)滑膜組織塊,脛骨、股骨髁關(guān)節(jié)軟骨修成0.5 cm×0.5 cm合適厚度軟骨片.

1.7 組織學及生化檢測 滑膜和軟骨標本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24~48 h,脫水處理并石蠟包埋,3 μm連續(xù)切片后 HE染色、光鏡下組織學觀察.節(jié)液中NO、NOS活性采用分光光度計進行檢測,PEG2采用PGE2(ELISA)試劑盒進行檢測,軟骨和滑膜組織中 iNOS采用iNOS試劑盒測定含量,滑膜、軟骨COX-2表達采用免疫組織化學方法進行檢測.

1.8 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入及分析,計數(shù)資料采用 χ2檢驗,P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)腔大體形態(tài)學觀察 正常組關(guān)節(jié)軟骨外觀呈淺藍白色,半透明;關(guān)節(jié)面光滑平整、色澤明亮,無裂紋及軟化灶;關(guān)節(jié)邊緣整齊規(guī)則,無骨贅形成.滑膜外觀呈白色,潤澤明亮,內(nèi)表面光滑白亮向關(guān)節(jié)腔突出形成常說的滑膜皺襞;關(guān)節(jié)液呈淡黃色純凈液體,量少質(zhì)稠.模型組關(guān)節(jié)軟骨呈淡黃色;關(guān)節(jié)表面粗糙糜爛、潰瘍形成,失去光澤,軟骨缺損淺深不一,以致軟骨剝脫,軟骨下骨質(zhì)暴露;關(guān)節(jié)邊緣不規(guī)則,有明顯骨贅次形成.滑膜外觀明顯增生肥厚粘連;關(guān)節(jié)液明顯增多,色質(zhì)渾濁.對照組關(guān)節(jié)腔大體形態(tài)學變化介于模型組和實驗組之間.實驗組關(guān)節(jié)軟骨呈微黃色,關(guān)節(jié)面光澤尚存,關(guān)節(jié)表面部分粗糙未見明顯糜爛、潰瘍,軟骨部分區(qū)域缺損較表淺,未見大面積剝脫,軟骨下骨質(zhì)未見明顯暴露;關(guān)節(jié)邊緣欠規(guī)則,可見少量骨贅形成.滑膜外觀部分增生肥厚及粘連;關(guān)節(jié)液增多,色質(zhì)稍渾濁.

2.2 滑膜及軟骨組織學觀測 正常組滑膜完整,細胞排列整齊,無充血水腫、無炎性細胞浸潤(圖1A).模型組滑膜肉芽組織纖維化(瘢痕形成),伴有淋巴細胞和漿細胞浸潤(圖1B).對照組滑膜細胞呈乳頭狀增生,滑膜內(nèi)血管增生,肉芽組織形成(圖1C).實驗組滑膜充血水腫,表層細胞增生(圖1D).

圖1 滑膜及軟組織學觀測(×100)

2.3 關(guān)節(jié)液中 NO、NOS、PGE2含量測定 表 2顯示,模型組、對照組、實驗組關(guān)節(jié)液中NO、NOS、PGE2含量均呈高表達,與正常組相比差異具有顯著性(P<0.05),說明在膝 OA早期發(fā)病過程中是重要的炎癥介質(zhì).關(guān)節(jié)液中的 NO、NOS含量對照組、實驗組與模型組有顯著性差異(P<0.05),對照組與實驗組相比有顯著性差異(P<0.05).對照組、實驗組與模型組在關(guān)節(jié)液中 PGE2含量上有顯著差異(P<0.05),且對照組與實驗組兩者相比較,同樣具有差異(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義.

表2 關(guān)節(jié)液 NO、NOS、PGE2測定結(jié)果比較 (±s)

表2 關(guān)節(jié)液 NO、NOS、PGE2測定結(jié)果比較 (±s)

aP<0.05 vs正常組;cP<0.05 vs模型組;eP<0.05 vs對照組.

組別 n NO(mmol/L) NOS(U/mL) PGE2(pmol/L)

2.4 滑膜和軟骨中 iNOS測定 表3顯示,模型組、對照組、實驗組中 iNOS均呈高表達,與正常組相比差異具有顯著性(P<0.05),說明在膝OA早期發(fā)病炎癥病變過程中是重要的酶介質(zhì).滑膜和軟骨中 iNOS含量對照組、實驗組與模型組有顯著性差異(P<0.05),對照組與實驗組相比有顯著性差異(P<0.05).

表3 滑膜和軟骨中 iNOS測定結(jié)果比較±s,u/mg)

表3 滑膜和軟骨中 iNOS測定結(jié)果比較±s,u/mg)

aP<0.05 vs正常組;cP<0.05 vs模型組;eP<0.05 vs對照組.

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2.5 滑膜、軟骨 COX-2表達結(jié)果 表4顯示,正常組、對照組及實驗組均高于模型組(P<0.05);實驗組高于對照組(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義.以上數(shù)據(jù)表明,實驗組 COX-2的陽性表達要弱于模型組及對照組.

表4 滑膜和軟骨中 COX-2陽性表達灰度值(±s)

表4 滑膜和軟骨中 COX-2陽性表達灰度值(±s)

aP<0.05 vs正常組;cP<0.05 vs模型組;eP<0.05 vs對照組.

組別 n 滑膜 軟骨正常組15 213±14 235±23模型組 13 139±14a145±15a對照組 14 225±13ac213±15ac實驗組 14 229±15ace221±13ace

3 討論

膝OA在祖國醫(yī)學中當屬痹證范疇,根據(jù)“痛著不通,不通則痛”的中醫(yī)理論,膝OA出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)疼痛時定有“瘀”,此瘀當責之于肝腎,肝腎氣血虧虛,氣虛則血運無力,漸可致瘀.而且本病多見于老年肥胖女性,中醫(yī)素有“肥人多痰”的理論,故本病尚涉及脾[3-4].治則以補虛為先,陰陽共補,陰中求陽.結(jié)合本病特點,宜壯陽稍強,以求平衡陰陽兼有祛邪;活血化瘀應兼行氣止痛;血不養(yǎng)筋、寒之收引易致筋脈拘攣,所以柔肝舒筋之藥不可少;且勿忘健脾調(diào)胃.以達利濕化痰的目的.所以,本方以補腎作為治療膝 OA的根本法則,兼以補腎養(yǎng)肝,活血健脾,利濕化痰.

國內(nèi)外大量的實驗研究表明,導致膝關(guān)節(jié) OA病理變化的炎癥途徑中,NO和 COX-2起到很重要的作用,兩項由炎癥因子介導的炎癥途徑是通過對滑膜和軟骨營養(yǎng)交換、骨基質(zhì)合成、輕微損傷后修復等途徑的干預和損害,導致OA病理過程中關(guān)節(jié)軟骨的軟化、纖維化、潰瘍,軟骨下骨的硬化與象牙化,骨贅形成和軟骨下骨囊腫,以及滑膜組織損傷和血管擴張,組織滲出,導致滑膜腫脹,造成關(guān)節(jié)腔積液、滑膜增生肥厚粘連軟骨,以上所述病理變化最終導致患者出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)活動功能減退以致障礙[5-7].透骨消痛顆粒是以“腎主骨”、“肝主筋”、“膝為筋之府”等中醫(yī)藥理論為指導,以補腎作為治療膝 OA的根本法則(藥以巴戟天等溫陽補腎之品治本;劉獻祥等在透骨消痛顆粒防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的機理研究中將其簡要的歸納為五要:①補腎要去邪,邪去痹自滅;②補腎要活血,血行痹自解;③補腎藥健脾,脾健痹自去;④補腎藥養(yǎng)肝,肝腎同源,肝腎痛健痹自殲;⑤補腎藥止痛,痛解痹自停.

本實驗研究過程用改良HUILTH法復制兔膝關(guān)節(jié)OA模型,實驗標本采集檢測及觀察,可顯示膝關(guān)節(jié)OA病理變化過程中的軟骨的軟化、纖維化,減少潰瘍和軟骨下骨的硬化與象牙化,降低軟骨下骨囊腫與骨贅形成,控制滑膜組織的損傷和滲出.保護血管,減輕其因擴張而導致的滑膜腫脹、關(guān)節(jié)腔積液、滑膜增生肥厚粘連軟骨等標志性的病變,可以印證大多數(shù)相關(guān)研究中對應病理過程.在相關(guān)各組實驗結(jié)果的對比中可以發(fā)現(xiàn),透骨消痛顆粒在膝 OA病理變化可以起到減輕 OA病理變化中的關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的退變,減輕膝關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛、關(guān)節(jié)功能退變.試驗結(jié)果可證實在兔膝關(guān)節(jié)OA過程中NOS和COX-2途徑起到了重要作用,透骨消痛顆??梢砸种七@兩條炎癥途徑.

[1]劉獻祥,李西海,周江濤.改良 Hulth造模法復制膝骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(12):1104-1106.

[2]鄭永智,孫永強,王上增.關(guān)節(jié)鏡治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎化膿性感染的臨床分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2014,24(15):3815-3817.

[3]黃云梅,陳文列,林如輝,等.透骨消痛膠囊促進成骨細胞的增殖和分化[J].中國組織工程研究,2013,17(33):5923-5928.

[4]陳 燕,肖曉金,包俠萍,等.透骨消痛方鎮(zhèn)痛抗炎作用實驗研究[J].中醫(yī)學報,2013,28(11):1675-1676,1685.

[5]袁望舒,陳麗霞,劉淑芬.負重游泳運動對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨及血清超氧化物歧化酶和丙二醛的影響[J].中華物理醫(yī)學與康復雜,2014,36(2):81-85.

[6]吳汝平,趙品益.中醫(yī)手法聯(lián)合關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉治療膝骨性關(guān)節(jié)炎臨床分析[J].中華中醫(yī)藥學刊,2014,32(5):1219-1221.

[7]甕長水,郭燕梅,陳 蔚,等.80歲及以上膝骨性關(guān)節(jié)炎患者等速肌力與疼痛和功能狀態(tài)的關(guān)系[J].中華老年醫(yī)學雜志,2014,33(7):718-721.

The Experimental Research about granula of penetrating bone removeing pain intervene the expression of COX-2 and iNOS in early stage of osteoarthritis

GAO Xue-Wei
The 672 Hospital of Wuhan,Department of Orthopaedic,Wuhan 430079,China

AIM:To investgate the mechanism of influence about granula of penetrating bone removeing pain intervene the expression of COX-2 and iNOS in early stage of osteoarthritis by animals experiment,to investgate mechanism of granula of penetrating bone removeing pain on treatment of osteoarthritis.METHODS:We devided the New Zealand rabbits into 3 groups randomly after replicated knee osteoarthritis with modified Hulth modeling method:model group,control group,experimental group,with the normal group were 4 groups in total.We execute all rabbits after they were fed intragastically for 4 weekes.Then the following detection were taken out:General Observation of articular cavity;histological Conversation of synovium and cartilage;content of NOS,NO,test of iNOSmRNA,concentration of COX-2 and PGE2 within joint.RESULTS:After four weekes,there was significant contrast(P<0.05)of the concent of NOS,NO,iNOSmRNA,COX-2 and PGE2 of model group,control group,experimental group compared with the normal group;There was significant contrast(P<0.05)of the concent of NOS,NO,iNOSmRNA,COX-2 and PGE2 of experimental groups and control group compared with the model group;There was significant contrast(P<0.05)of the concent of NOS,NO,iNOSmRNA,COX-2 and PGE2 of experimental group compared with control group.CONCLUSION:The granula of penetrating bone removeing pain can control inflammation,relieve pains and alleviate symptoms in early stage of osteoarthritis by inhibiting the expression of COX-2 and iNOS within cartilage and synovium and releving the production of PGE2 and NO which can be inducktived by COX-2 and iNOS.

granula of penetrating bone removeing pain;osteoarthritis;synovium;cartilage;COX-2;Inos;NO;PGE2

R274.32;R684.3

A

2095-6894(2015)01-015-04

2014-12-10;接受日期:2014-12-30

高雪偉.碩士.E-mail:119077056@qq.com

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