高雪偉 （中船武漢六七二醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430079）

透骨消痛顆粒干預OA早期 COX-2和iNOS表達的實驗研究

高雪偉 （中船武漢六七二醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430079）

目的：通過動物試驗探討透骨消痛顆粒對骨性關(guān)節(jié)炎早期環(huán)氧化酶-2（COX-2）和誘導性一氧化氮合酶（iNOS）表達的影響，研究透骨消痛顆粒在膝骨性關(guān)節(jié)炎治療中的相關(guān)作用機制．方法：新西蘭大白兔采用改良Hulth法造模，造模成功后隨機分成3組：模型組、對照組、實驗組，和正常組共4組，分別灌胃給藥4周后處死動物取材，并觀測如下指標：關(guān)節(jié)腔大體觀察，滑膜與軟骨組織學觀察；關(guān)節(jié)液內(nèi) NO、NOS、PGE2含量檢測，滑膜軟骨中iNOS、COX-2含量檢測．結(jié)果：4周后關(guān)節(jié)液中 NO、NOS含量、PGE2濃度，滑膜和軟骨中iNOS、COX-2含量，模型組、對照組、實驗組均呈高表達，與正常組比較差異有顯著性（P＜0．05）；對照組、實驗組與模型組比較差異有顯著性（P＜0．05）；對照組與實驗組比較差異有顯著性（P＜0．05）．結(jié)論：透骨消痛顆?？赏ㄟ^抑制COX-2和 iNOS在 OA早期滑膜和軟骨細胞中的表達及其誘導產(chǎn)物PGE2和 NO的生成，從而達到控制OA早期炎癥、減輕疼痛、緩解癥狀的作用．

透骨消痛顆粒；骨性關(guān)節(jié)炎；滑膜；軟骨；COX-2；iNOS；NO；PGE2

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種多發(fā)病，常見于中老年人群，在我國其患病率40歲以上人群為10%～17%，60歲以上為 50%，75歲以上則達80%，而該病最終致殘率為53%［1］，是影響中老年人活動最常見的原因．透骨消痛顆粒重要成分為杭白芍、巴戟天、川芎和腫節(jié)風，全方具有補肝腎、強筋骨之功效．輔以活血化淤、舒筋通絡、祛風除濕的治療效果，對改善膝 OA的癥狀有著良好療效．本課題擬通過動物試驗探討透骨消痛顆粒對 OA早期環(huán)氧化酶-2（COX-2）和誘導性一氧化氮合酶（iNOS）表達的影響，探討透骨消痛顆粒治療膝 OA療效作用機制．

1 材料和方法

1．1 實驗動物 新西蘭大白兔，6月齡，實驗對象空腹體重為（2 100±100）g，雌性30只、雄性30只，全部由上海醫(yī)用動物實驗中心提供，并安全運輸至實驗地（福建省中西醫(yī)結(jié)合研究院的動物中心進行），動物合格證號：SCXK（滬）2008-0009．經(jīng)過適應性喂養(yǎng)1周．

1．2 藥物制備 透骨消痛顆粒：所需中藥顆粒劑均由福建省第二人民醫(yī)院制劑室提供，制成水煎劑，每10 mL含生藥1．12 g．壯骨關(guān)節(jié)丸（批準文號：國藥準字Z44023377）；鹽酸氯胺酮注射液（批準文號：國藥準字H32O22820）；注射用青霉素鈉80萬 u（批準文號：國藥準字H37021950）；滅菌注射用水（批準文號：國藥準字H44020786）．

1．3 主要試劑 一氧化氮試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20081215）；一氧化氮合成酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20081215）；PGE2（ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，批號：0811165）；誘導型一氧化氮合酶原位雜交試劑盒（武漢博士德生物試劑有限公司提供，批號20080908）；COX-2免疫組化全套試劑盒（武漢博士德生物試劑有限公司，批號：20060408）．

1．4 主要儀器 酶標儀（ELX808U），美國 BIO-TEK公司；半自動生化分析儀（BT224），意大利生物技術(shù)公司；離心機（DDL-5），上海安亭科學儀器廠；醫(yī)用冰箱（MDF-U5410），SANYO；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082），上海精宏實驗設備有限公司；電熱恒溫水浴箱（HH1600），上海躍進醫(yī)療器械廠；微量振蕩器（ZW-A），常州國華電器有限公司；全自動酶標洗板機（ELx50），美國BIO-TEK公司．

1．5 動物分組及實驗方法 采用抽簽法隨機分為正常組（15只）和造模組（45只）．正常組兔子予以正常飼養(yǎng)看護；造模組兔子在常規(guī)術(shù)前準備基礎上行改良Hulth法造模［2］．造模成功后再用抽簽法隨機分成3組：模型組、對照組、實驗組，每組15只（表1）．模型組兔子予以生理鹽水10 mL／d灌胃處理；對照組兔子則用壯骨關(guān)節(jié)丸水溶液10 mL／d（含壯骨關(guān)節(jié)丸1．12 g）灌胃處理；實驗組給予透骨消痛顆粒水溶液10 mL／d（含生藥量1．12 g）灌胃，共4周．

表1 動物分組及實驗方法 （n＝15）

在驅(qū)趕過程中，兔群相互擠壓、踩塌造成外傷致死有2只，分別在模型組和實驗1組；在灌胃過程中，藥物溶液返流導致誤吸死亡4只，模型組、對照組、實驗1、2組各1只．

1．6 標本取材 采用耳緣靜脈麻醉的方法對藥物干預4周的兔子進行麻醉，將麻醉后的兔子于右膝半屈曲位置于實驗臺，定位關(guān)節(jié)腔穿刺點，緩慢注入 1 mL生理鹽水，之后反復活動關(guān)節(jié)，待充分接觸后抽取關(guān)節(jié)液至EP管內(nèi)，4 000 r／min離心 10 min取上清液，在 －20℃環(huán)境下保存．處死并解剖兔子，觀察關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)．刀片切取大小約為0．5 cm×0．5 cm×0．5 cm的內(nèi)側(cè)滑膜組織塊，脛骨、股骨髁關(guān)節(jié)軟骨修成0．5 cm×0．5 cm合適厚度軟骨片．

1．7 組織學及生化檢測 滑膜和軟骨標本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24～48 h，脫水處理并石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片后 HE染色、光鏡下組織學觀察．節(jié)液中NO、NOS活性采用分光光度計進行檢測，PEG2采用PGE2（ELISA）試劑盒進行檢測，軟骨和滑膜組織中 iNOS采用iNOS試劑盒測定含量，滑膜、軟骨COX-2表達采用免疫組織化學方法進行檢測．

1．8 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS18．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入及分析，計數(shù)資料采用 χ2檢驗，P＜0．05時認為差異具有統(tǒng)計學意義．

2 結(jié)果

2．1 關(guān)節(jié)腔大體形態(tài)學觀察 正常組關(guān)節(jié)軟骨外觀呈淺藍白色，半透明；關(guān)節(jié)面光滑平整、色澤明亮，無裂紋及軟化灶；關(guān)節(jié)邊緣整齊規(guī)則，無骨贅形成．滑膜外觀呈白色，潤澤明亮，內(nèi)表面光滑白亮向關(guān)節(jié)腔突出形成常說的滑膜皺襞；關(guān)節(jié)液呈淡黃色純凈液體，量少質(zhì)稠．模型組關(guān)節(jié)軟骨呈淡黃色；關(guān)節(jié)表面粗糙糜爛、潰瘍形成，失去光澤，軟骨缺損淺深不一，以致軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露；關(guān)節(jié)邊緣不規(guī)則，有明顯骨贅次形成．滑膜外觀明顯增生肥厚粘連；關(guān)節(jié)液明顯增多，色質(zhì)渾濁．對照組關(guān)節(jié)腔大體形態(tài)學變化介于模型組和實驗組之間．實驗組關(guān)節(jié)軟骨呈微黃色，關(guān)節(jié)面光澤尚存，關(guān)節(jié)表面部分粗糙未見明顯糜爛、潰瘍，軟骨部分區(qū)域缺損較表淺，未見大面積剝脫，軟骨下骨質(zhì)未見明顯暴露；關(guān)節(jié)邊緣欠規(guī)則，可見少量骨贅形成．滑膜外觀部分增生肥厚及粘連；關(guān)節(jié)液增多，色質(zhì)稍渾濁．

2．2 滑膜及軟骨組織學觀測 正常組滑膜完整，細胞排列整齊，無充血水腫、無炎性細胞浸潤（圖1A）．模型組滑膜肉芽組織纖維化（瘢痕形成），伴有淋巴細胞和漿細胞浸潤（圖1B）．對照組滑膜細胞呈乳頭狀增生，滑膜內(nèi)血管增生，肉芽組織形成（圖1C）．實驗組滑膜充血水腫，表層細胞增生（圖1D）．

圖1 滑膜及軟組織學觀測（×100）

2．3 關(guān)節(jié)液中 NO、NOS、PGE2含量測定 表 2顯示，模型組、對照組、實驗組關(guān)節(jié)液中NO、NOS、PGE2含量均呈高表達，與正常組相比差異具有顯著性（P＜0．05），說明在膝 OA早期發(fā)病過程中是重要的炎癥介質(zhì)．關(guān)節(jié)液中的 NO、NOS含量對照組、實驗組與模型組有顯著性差異（P＜0．05），對照組與實驗組相比有顯著性差異（P＜0．05）．對照組、實驗組與模型組在關(guān)節(jié)液中 PGE2含量上有顯著差異（P＜0．05），且對照組與實驗組兩者相比較，同樣具有差異（P＜0．05），差異有統(tǒng)計學意義．

表2 關(guān)節(jié)液 NO、NOS、PGE2測定結(jié)果比較 （±s）

表2 關(guān)節(jié)液 NO、NOS、PGE2測定結(jié)果比較 （±s）

aP＜0．05 vs正常組；cP＜0．05 vs模型組；eP＜0．05 vs對照組．

組別 n NO（mmol／L） NOS（U／mL） PGE2（pmol／L）

2．4 滑膜和軟骨中 iNOS測定 表3顯示，模型組、對照組、實驗組中 iNOS均呈高表達，與正常組相比差異具有顯著性（P＜0．05），說明在膝OA早期發(fā)病炎癥病變過程中是重要的酶介質(zhì)．滑膜和軟骨中 iNOS含量對照組、實驗組與模型組有顯著性差異（P＜0．05），對照組與實驗組相比有顯著性差異（P＜0．05）．

表3 滑膜和軟骨中 iNOS測定結(jié)果比較±s，u／mg）

表3 滑膜和軟骨中 iNOS測定結(jié)果比較±s，u／mg）

aP＜0．05 vs正常組；cP＜0．05 vs模型組；eP＜0．05 vs對照組．

?

2．5 滑膜、軟骨 COX-2表達結(jié)果 表4顯示，正常組、對照組及實驗組均高于模型組（P＜0．05）；實驗組高于對照組（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計學意義．以上數(shù)據(jù)表明，實驗組 COX-2的陽性表達要弱于模型組及對照組．

表4 滑膜和軟骨中 COX-2陽性表達灰度值（±s）

表4 滑膜和軟骨中 COX-2陽性表達灰度值（±s）

aP＜0．05 vs正常組；cP＜0．05 vs模型組；eP＜0．05 vs對照組．

組別 n 滑膜 軟骨正常組15 213±14 235±23模型組 13 139±14a145±15a對照組 14 225±13ac213±15ac實驗組 14 229±15ace221±13ace

3 討論

膝OA在祖國醫(yī)學中當屬痹證范疇，根據(jù)“痛著不通，不通則痛”的中醫(yī)理論，膝OA出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)疼痛時定有“瘀”，此瘀當責之于肝腎，肝腎氣血虧虛，氣虛則血運無力，漸可致瘀．而且本病多見于老年肥胖女性，中醫(yī)素有“肥人多痰”的理論，故本病尚涉及脾［3－4］．治則以補虛為先，陰陽共補，陰中求陽．結(jié)合本病特點，宜壯陽稍強，以求平衡陰陽兼有祛邪；活血化瘀應兼行氣止痛；血不養(yǎng)筋、寒之收引易致筋脈拘攣，所以柔肝舒筋之藥不可少；且勿忘健脾調(diào)胃．以達利濕化痰的目的．所以，本方以補腎作為治療膝 OA的根本法則，兼以補腎養(yǎng)肝，活血健脾，利濕化痰．

國內(nèi)外大量的實驗研究表明，導致膝關(guān)節(jié) OA病理變化的炎癥途徑中，NO和 COX-2起到很重要的作用，兩項由炎癥因子介導的炎癥途徑是通過對滑膜和軟骨營養(yǎng)交換、骨基質(zhì)合成、輕微損傷后修復等途徑的干預和損害，導致OA病理過程中關(guān)節(jié)軟骨的軟化、纖維化、潰瘍，軟骨下骨的硬化與象牙化，骨贅形成和軟骨下骨囊腫，以及滑膜組織損傷和血管擴張，組織滲出，導致滑膜腫脹，造成關(guān)節(jié)腔積液、滑膜增生肥厚粘連軟骨，以上所述病理變化最終導致患者出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)活動功能減退以致障礙［5－7］．透骨消痛顆粒是以“腎主骨”、“肝主筋”、“膝為筋之府”等中醫(yī)藥理論為指導，以補腎作為治療膝 OA的根本法則（藥以巴戟天等溫陽補腎之品治本；劉獻祥等在透骨消痛顆粒防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的機理研究中將其簡要的歸納為五要：①補腎要去邪，邪去痹自滅；②補腎要活血，血行痹自解；③補腎藥健脾，脾健痹自去；④補腎藥養(yǎng)肝，肝腎同源，肝腎痛健痹自殲；⑤補腎藥止痛，痛解痹自停．

本實驗研究過程用改良HUILTH法復制兔膝關(guān)節(jié)OA模型，實驗標本采集檢測及觀察，可顯示膝關(guān)節(jié)OA病理變化過程中的軟骨的軟化、纖維化，減少潰瘍和軟骨下骨的硬化與象牙化，降低軟骨下骨囊腫與骨贅形成，控制滑膜組織的損傷和滲出．保護血管，減輕其因擴張而導致的滑膜腫脹、關(guān)節(jié)腔積液、滑膜增生肥厚粘連軟骨等標志性的病變，可以印證大多數(shù)相關(guān)研究中對應病理過程．在相關(guān)各組實驗結(jié)果的對比中可以發(fā)現(xiàn)，透骨消痛顆粒在膝 OA病理變化可以起到減輕 OA病理變化中的關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的退變，減輕膝關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛、關(guān)節(jié)功能退變．試驗結(jié)果可證實在兔膝關(guān)節(jié)OA過程中NOS和COX-2途徑起到了重要作用，透骨消痛顆?？梢砸种七@兩條炎癥途徑．

［1］劉獻祥，李西海，周江濤．改良 Hulth造模法復制膝骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（12）：1104－1106．

［2］鄭永智，孫永強，王上增．關(guān)節(jié)鏡治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎化膿性感染的臨床分析［J］．中華醫(yī)院感染學雜志，2014，24（15）：3815－3817．

［3］黃云梅，陳文列，林如輝，等．透骨消痛膠囊促進成骨細胞的增殖和分化［J］．中國組織工程研究，2013，17（33）：5923－5928．

［4］陳 燕，肖曉金，包俠萍，等．透骨消痛方鎮(zhèn)痛抗炎作用實驗研究［J］．中醫(yī)學報，2013，28（11）：1675－1676，1685．

［5］袁望舒，陳麗霞，劉淑芬．負重游泳運動對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨及血清超氧化物歧化酶和丙二醛的影響［J］．中華物理醫(yī)學與康復雜，2014，36（2）：81－85．

［6］吳汝平，趙品益．中醫(yī)手法聯(lián)合關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉治療膝骨性關(guān)節(jié)炎臨床分析［J］．中華中醫(yī)藥學刊，2014，32（5）：1219－1221．

［7］甕長水，郭燕梅，陳 蔚，等．80歲及以上膝骨性關(guān)節(jié)炎患者等速肌力與疼痛和功能狀態(tài)的關(guān)系［J］．中華老年醫(yī)學雜志，2014，33（7）：718－721．

The Experimental Research about granula of penetrating bone removeing pain intervene the expression of COX-2 and iNOS in early stage of osteoarthritis

GAO Xue-Wei
The 672 Hospital of Wuhan，Department of Orthopaedic，Wuhan 430079，China

AIM：To investgate the mechanism of influence about granula of penetrating bone removeing pain intervene the expression of COX-2 and iNOS in early stage of osteoarthritis by animals experiment，to investgate mechanism of granula of penetrating bone removeing pain on treatment of osteoarthritis．METHODS：We devided the New Zealand rabbits into 3 groups randomly after replicated knee osteoarthritis with modified Hulth modeling method：model group，control group，experimental group，with the normal group were 4 groups in total．We execute all rabbits after they were fed intragastically for 4 weekes．Then the following detection were taken out：General Observation of articular cavity；histological Conversation of synovium and cartilage；content of NOS，NO，test of iNOSmRNA，concentration of COX-2 and PGE2 within joint．RESULTS：After four weekes，there was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of model group，control group，experimental group compared with the normal group；There was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of experimental groups and control group compared with the model group；There was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of experimental group compared with control group．CONCLUSION：The granula of penetrating bone removeing pain can control inflammation，relieve pains and alleviate symptoms in early stage of osteoarthritis by inhibiting the expression of COX-2 and iNOS within cartilage and synovium and releving the production of PGE2 and NO which can be inducktived by COX-2 and iNOS．

granula of penetrating bone removeing pain；osteoarthritis；synovium；cartilage；COX-2；Inos；NO；PGE2

R274．32；R684．3

A

2095-6894（2015）01-015-04

2014-12-10；接受日期：2014-12-30

高雪偉．碩士．E-mail：119077056@qq．com