張晶晶, 黃亞麗, 馬 宏, 賈振華, 史延茂, 宋水山

(1. 河北省科學(xué)院生物研究所, 河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心, 石家莊 050081;2. 河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院, 天津 300130)

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木霉Tr-92菌株厚垣孢子發(fā)酵條件的優(yōu)化

張晶晶1,2, 黃亞麗1*, 馬 宏1, 賈振華1, 史延茂1, 宋水山1*

(1. 河北省科學(xué)院生物研究所, 河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心, 石家莊 050081;2. 河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院, 天津 300130)

利用單因素試驗、正交試驗方法對木霉Tr-92厚垣孢子發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,篩選獲得了適合此菌株厚垣孢子產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基組成為：草炭2.5%,玉米漿4.5%,葡萄糖2%,酵母膏0.5%;最佳培養(yǎng)條件為：接種量3%,裝液量75 mL/250 mL,轉(zhuǎn)速為180 r/min,初始pH 5.0,溫度28 ℃,培養(yǎng)時間7 d。在此培養(yǎng)條件下,木霉Tr-92菌株厚垣孢子產(chǎn)量達(dá)到3.01×108個/mL。與優(yōu)化前相比,厚垣孢子產(chǎn)量增長130.80%。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化確定了適合木霉Tr-92菌株產(chǎn)生厚垣孢子的條件,為高效木霉厚垣孢子生防菌劑的研制奠定了基礎(chǔ)。

木霉; 厚垣孢子; 液體發(fā)酵; 培養(yǎng)基; 發(fā)酵條件

木霉(Trichoderma)是一種具有重要經(jīng)濟價值的生防真菌,自1932年Weindling首次發(fā)現(xiàn)木素木霉(Trichodermalignorum)可以寄生于多種植物病原真菌后[1],經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)木霉菌對18個屬的29種病原菌具有拮抗作用[2],其生防機制包括競爭作用[3]、抗生作用[4]、重寄生作用[5]和誘導(dǎo)抗性[6]等,成功研制出了50多種木霉制劑[7],其中以美國的Topshield(哈茨木霉T22)[8]和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)[9]應(yīng)用最為廣泛。

商品化的木霉制劑大多為分生孢子制劑或分生孢子和菌絲的混合制劑,由于分生孢子自身的特點造成木霉分生孢子制劑保質(zhì)期短、田間防效穩(wěn)定性差。厚垣孢子是木霉在逆境情況下產(chǎn)生的一種繁殖體,該類孢子在儲存、萌發(fā)及在逆境情況下的存活能力均遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于分生孢子[10],因此,為了提高木霉制劑的田間施用效果,進(jìn)行木霉厚垣孢子制劑的研制非常必要。然而,與分生孢子相比,木霉厚垣孢子的培養(yǎng)條件較為苛刻,培養(yǎng)時間長且厚垣孢子產(chǎn)生量少,這增加了木霉厚垣孢子制劑的成本、限制了厚垣孢子制劑的開發(fā),所以,亟須進(jìn)行高產(chǎn)厚垣孢子的發(fā)酵條件研究。

木霉Tr-92是由本課題組自植物根際土壤中分離和鑒定的一株拮抗木霉,初步研究發(fā)現(xiàn)該菌對灰霉病菌、立枯絲核菌、鐮刀菌等十余種病原菌均具有較強的拮抗作用[6,11],對灰霉菌生長的抑制作用達(dá)75.2%;顯微鏡觀察拮抗平板發(fā)現(xiàn),木霉Tr-92的菌絲通過纏繞、穿透、緊貼等方式寄生在病原菌的菌絲之上。研究還發(fā)現(xiàn),將該菌株的分生孢子懸液施用于黃瓜根部,可以誘導(dǎo)黃瓜葉部對灰霉病菌的系統(tǒng)抗性,防病效果達(dá)到56%[6,11];這些研究表明該菌株能夠通過土壤施用來防治土傳和葉面病害,是一株具有良好生防潛力的菌株。本研究對木霉Tr-92液體發(fā)酵產(chǎn)厚垣孢子的培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化,以期提高該菌株的厚垣孢子產(chǎn)量,降低成本,為厚垣孢子制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

木霉Tr-92菌株,為本實驗室篩選、保存并鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)燕麥粉培養(yǎng)基：燕麥粉(30目)50 g,加水至1 L;(2)玉米粉培養(yǎng)基[12]：玉米粉(30目)50 g,加水至1 L;(3)草炭+玉米漿培養(yǎng)基：草炭5%,玉米漿3%,葡萄糖2%,酵母膏0.5%,加水至1 L;(4)玉米+大豆培養(yǎng)基：大豆粉(30目)20 g,玉米粉(30目)10 g,加水至1 L;(5) 大豆培養(yǎng)基：大豆粉(30目)20 g,加水至1 L;(6)Gorodkowa培養(yǎng)基[13]：氯化鈉5 g,蛋白胨10 g,葡萄糖2.5 g,牛肉膏10 g,加水至1 L,pH6.0。

1.2 方法

1.2.1 木霉Tr-92的培養(yǎng)及分生孢子懸液的制備

將試管保存的木霉Tr-92菌種接種到PDA平板上,30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,用無菌水沖洗木霉Tr-92平板得到木霉孢子液,充分混勻后用血球計數(shù)板計數(shù),并調(diào)整其濃度為1×106cfu/mL。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對厚垣孢子產(chǎn)量的影響

按照1.1.2中培養(yǎng)基配方進(jìn)行6種培養(yǎng)基的配制,250 mL三角瓶裝液量為50 mL,121 ℃滅菌20 min。按1%的接種量將木霉孢子懸液接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng),每24 h用顯微鏡觀察不同培養(yǎng)基中木霉的生長狀況。待厚垣孢子基本脫落后,吸取1 mL孢子液稀釋合適倍數(shù)后用血球計數(shù)板計數(shù)并計算各處理的厚垣孢子濃度。每個處理重復(fù)3次。以下各項試驗除了已篩出的最佳條件和所測項目外,均與此相同。

1.2.3 草炭+玉米漿培養(yǎng)基成分的正交優(yōu)化

以產(chǎn)厚垣孢子最好的(3)草炭+玉米漿培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基的配方。選用3因素3水平的L9(33)正交表進(jìn)行試驗,正交試驗因素及水平見表1,共安排9個試驗組,每個試驗組3個重復(fù)。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.4 木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子培養(yǎng)條件的優(yōu)化

(1)初始pH對木霉厚垣孢子產(chǎn)生的影響：以優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10進(jìn)行木霉培養(yǎng),測定不同處理中厚垣孢子的數(shù)量,每處理3次重復(fù)。

(2)溫度對木霉厚垣孢子產(chǎn)生的影響：以優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別在20、24、28、32 ℃和36 ℃等溫度下進(jìn)行振蕩培養(yǎng),測定不同溫度處理下厚垣孢子的數(shù)量,每處理3次重復(fù)。

(3)接種量對木霉厚垣孢子產(chǎn)生的影響：用250 mL三角瓶,每瓶裝50 mL優(yōu)化培養(yǎng)基,分別按1%、3%、5%、7%、9%的接種量進(jìn)行振蕩培養(yǎng)8 d,測定不同接種量處理中厚垣孢子的數(shù)量,每處理3次重復(fù)。

(4)裝液量對木霉厚垣孢子產(chǎn)生的影響：用250 mL三角瓶,按裝液量25、50、75、100、125 mL裝入優(yōu)化培養(yǎng)基,恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)8 d,測定不同裝液量處理中厚垣孢子的數(shù)量,每處理3次重復(fù)。

(5)培養(yǎng)時間對木霉厚垣孢子產(chǎn)生的影響：用250 mL三角瓶,按最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng),每天用顯微鏡觀察厚垣孢子的分化情況,測定不同培養(yǎng)時間處理中厚垣孢子的數(shù)量,每處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉Tr-92在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生厚垣孢子的情況

試驗結(jié)果(圖1)表明,供試的6種培養(yǎng)基,除Gorodkowa培養(yǎng)基外,其他5種培養(yǎng)基培養(yǎng)Tr-92均能產(chǎn)生厚垣孢子,其中以草炭+玉米漿培養(yǎng)基中厚垣孢子產(chǎn)量最多,且基本上不產(chǎn)生分生孢子,在玉米培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基中則同時產(chǎn)生大量厚垣孢子和分生孢子,玉米+大豆粉培養(yǎng)基和大豆粉培養(yǎng)基產(chǎn)生的厚垣孢子相對較少。因此,初步確定草炭+玉米漿培養(yǎng)基為適合木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 草炭+玉米漿培養(yǎng)基成分的正交優(yōu)化

以Ki值最優(yōu)的水平為試驗的最佳條件,由表2可知,Tr-92最適發(fā)酵組合為A3(4.5%)B1(2.5%)C2(2%),即該菌的最佳培養(yǎng)基配方為草炭2.5%、玉米漿4.5%、葡萄糖2%。其中,以草炭的含量對厚垣孢子產(chǎn)生數(shù)量的影響最大,其次是葡萄糖,玉米漿的影響最小。

圖1 不同培養(yǎng)基對木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.1 Effects of different media on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

試驗號No.A(玉米漿含量)/%MaizesteepliquorB(草炭含量)/%PeatC(葡萄糖含量)/%Glucose厚垣孢子數(shù)/×108個·mL-1No.ofchlamydospores1A1(1.5)B1(2.5)C1(1)0.022A1(1.5)B2(5.0)C2(2)0.233A1(1.5)B3(7.5)C3(3)0.044A2(3.0)B1(2.5)C2(2)1.245A2(3.0)B2(5.0)C3(3)0.396A2(3.0)B3(7.5)C1(1)0.017A3(4.5)B1(2.5)C3(3)1.268A3(4.5)B2(5.0)C1(1)0.119A3(4.5)B3(7.5)C2(2)0.48K10.292.520.14K21.640.731.95K31.850.531.69k10.100.840.05k20.550.240.65k30.620.180.56R1.561.991.81

2.3 木霉Tr-92厚垣孢子發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 初始pH對木霉Tr-92厚垣孢子產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)8 d后測定木霉Tr-92菌株在不同初始pH的培養(yǎng)基中產(chǎn)生厚垣孢子的情況,結(jié)果表明(圖2),初始pH為5時的厚垣孢子產(chǎn)量最大,達(dá)到1.89×108個/mL;初始pH為4、5、6、7時厚垣孢子產(chǎn)生量差異不大;而從pH 7開始,隨著pH增加,Tr-92產(chǎn)生的厚垣孢子數(shù)量急劇下降,pH為10時厚垣孢子產(chǎn)量最低,僅為0.18×108個/mL,說明偏酸的環(huán)境適合木霉厚垣孢子產(chǎn)生。

圖2 不同初始pH對木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.2 Effects of initial pH on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

試驗過程中也檢測了分生孢子的產(chǎn)生情況,結(jié)果顯示在不同的pH下,分生孢子的產(chǎn)生情況也不同。在pH 3～10處理中均發(fā)現(xiàn)分生孢子的產(chǎn)生,并在pH 10時達(dá)到最大值,在pH 3～7的培養(yǎng)基中分生孢子量很少。因此可以通過初始pH的調(diào)控,有目的地調(diào)控厚垣孢子或分生孢子的產(chǎn)生。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對木霉Tr-92厚垣孢子產(chǎn)量的影響

溫度也是影響木霉厚垣孢子產(chǎn)生的重要因素(圖3),木霉Tr-92在5個試驗溫度下均能產(chǎn)生厚垣孢子,其中以28 ℃產(chǎn)生厚垣孢子的數(shù)量最大,為2.03×108個/mL;在高于32 ℃培養(yǎng)時木霉菌株生長緩慢,菌絲細(xì)弱,培養(yǎng)液內(nèi)菌絲結(jié)團(tuán),產(chǎn)厚垣孢子量相對較少,36 ℃時則僅有少量厚垣孢子產(chǎn)生。

圖3 不同溫度對木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.3 Effects of temperature on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

2.3.3 接種量對木霉Tr-92厚垣孢子產(chǎn)量的影響

不同接種量對木霉厚垣孢子產(chǎn)量的影響相對較小,在接種量為3%時厚垣孢子產(chǎn)量最多,接種量大于3%時各處理的厚垣孢子數(shù)量差異不大。接種量大時,厚垣孢子產(chǎn)量略有下降。

圖4 不同接種量對木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.4 Effects of inoculum size on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

2.3.4 裝液量對木霉Tr-92厚垣孢子產(chǎn)量的影響

不同的裝液量影響微生物培養(yǎng)過程中氧的供應(yīng)量,在250 mL三角瓶中裝入25、50、75、100、125 mL培養(yǎng)基進(jìn)行搖床培養(yǎng),在裝液量為75 mL時厚垣孢子產(chǎn)量達(dá)到最大,厚垣孢子數(shù)量為2.78×108個/mL,其次是裝液量為50 mL時厚垣孢子產(chǎn)量為2.09×108個/mL,在裝液量為125 mL時,厚垣孢子產(chǎn)量最低僅為0.98×108個/mL。說明裝液量過多時,由于溶解氧降低造成厚垣孢子產(chǎn)生能力的下降。

圖5 不同裝液量對木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.5 Effects of medium volume on production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores

2.3.5 最適發(fā)酵條件下木霉Tr-92厚垣孢子的產(chǎn)生情況

選取初始pH、溫度、接種量、裝液量4個因素的最優(yōu)值,進(jìn)行木霉Tr-92的培養(yǎng)。鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)時間在1～3 d時,木霉主要進(jìn)行菌絲的生長,培養(yǎng)基逐漸變稠;培養(yǎng)時間在3～6 d時,厚垣孢子開始產(chǎn)生,數(shù)量緩慢增加;培養(yǎng)時間在6～7 d時,厚垣孢子大量形成并脫落;血球計數(shù)板計數(shù)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)7 d時厚垣孢子產(chǎn)生數(shù)量達(dá)到最大值3.01×108個/mL。與優(yōu)化前相比,厚垣孢子產(chǎn)量增長130.80%;7 d之后,厚垣孢子數(shù)量逐漸減少(見圖6)。

圖6 最優(yōu)發(fā)酵條件下木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子的情況Fig.6 The Production of Trichoderma Tr-92 chlamydospores under optimal fermentation conditions

3 討論

隨著對化學(xué)農(nóng)藥危害的認(rèn)識,生物防治將成為控制植物病害的重要措施。木霉作為一種重要的生防真菌在農(nóng)作物病害生物防治過程中起著重要的作用,但木霉分生孢子制劑在田間穩(wěn)定性和保質(zhì)期方面還存在著一些問題,因此亟須開發(fā)具有良好生防效果的厚垣孢子制劑,以提高木霉的生防價值。

本研究以具有良好生防效果的木霉Tr-92菌株為試驗材料,進(jìn)行該菌株厚垣孢子液體發(fā)酵條件的研究,發(fā)現(xiàn)在不同的培養(yǎng)基中該菌株產(chǎn)生厚垣孢子的能力不同,其中以在草炭+玉米漿培養(yǎng)基中的厚垣孢子產(chǎn)量最大,其次為燕麥粉培養(yǎng)基。鄒勇[14]的研究表明,黃綠木霉T-33在燕麥培養(yǎng)基中也能產(chǎn)生大量的厚垣孢子。秦蕓等[13]采用Gorodkowa培養(yǎng)基培養(yǎng)哈瑞木霉產(chǎn)生大量厚垣孢子,但用該培養(yǎng)基培養(yǎng)哈茨木霉Tr-92時則完全不產(chǎn)生厚垣孢子,說明木霉菌的種或菌株不同產(chǎn)厚垣孢子的最適培養(yǎng)基也存在差異,有必要針對不同的菌株進(jìn)行厚垣孢子產(chǎn)孢條件的優(yōu)化。

初步篩選出適宜木霉Tr-92產(chǎn)生厚垣孢子的培養(yǎng)基后,本研究采用正交試驗方法對培養(yǎng)基組分進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化,試驗發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基3個組分對厚垣孢子產(chǎn)生量影響大小依次為：草炭、葡萄糖和玉米漿,確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為草炭2.5%、葡萄糖2%、玉米漿4.5%、酵母膏0.5%。

在培養(yǎng)條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度、初始pH和裝液量對木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子量的影響較大,當(dāng)溫度為28 ℃、初始pH為5、裝液量為75 mL/250 mL時厚垣孢子產(chǎn)量最高;在250 mL三角瓶內(nèi),相同的接種量下,裝液量過多,則養(yǎng)分過量、溶解氧較少,造成木霉菌絲大量產(chǎn)生,從而使厚垣孢子分化較慢、產(chǎn)量較低;裝液量過少,則木霉菌絲生長不夠豐富,產(chǎn)生厚垣孢子的時間提前,但產(chǎn)生量相對較少,李峰[15]的研究也取得了相似的結(jié)果。真菌喜好偏酸的生長環(huán)境,本研究發(fā)現(xiàn)木霉Tr-92產(chǎn)厚垣孢子的最適初始pH為5,其中pH 4～7之間厚垣孢子產(chǎn)量相差不多,說明該菌株產(chǎn)厚垣孢子的最適條件也為中性偏酸的環(huán)境,與莊敬華[16],顧金剛[17]等的研究結(jié)果相似,而武為平等[18]的研究表明,棘孢木霉的最適產(chǎn)厚垣孢子的pH僅為3,表明不同菌株的最適產(chǎn)孢條件存在差異。微生物的生長繁殖對溫度有著嚴(yán)格的要求,本試驗結(jié)果顯示,木霉Tr-92產(chǎn)生厚垣孢子的溫度范圍在24～32 ℃,培養(yǎng)溫度過低或過高都會抑制厚垣孢子的分化。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),厚垣孢子產(chǎn)生量高時則分生孢子產(chǎn)生量較低,反之依然,這說明木霉厚垣孢子和分生孢子產(chǎn)生有不同的調(diào)控途徑。通過優(yōu)化,木霉Tr-92在發(fā)酵時間為7 d時厚垣孢子產(chǎn)量達(dá)到3.01×108個/mL,有效地提高了木霉厚垣孢子產(chǎn)生效率。該研究結(jié)果為木霉厚垣孢子制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ),對木霉制劑的進(jìn)一步推廣應(yīng)用具有重要的意義。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Optimization of liquid fermentation conditions for production ofTrichodermaTr-92 chlamydospores

Zhang Jingjing1,2, Huang Yali1, Ma Hong1, Jia Zhenhua1, Shi Yanmao1, Song Shuishan1

(1.Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Hebei Engineering and Technology Center of Microbiological Control on Main Crop Diseases, Shijiazhuang 050081, China; 2. School of Chemical Engineering and Technology, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China)

The optimal liquid fermentation conditions for production ofTrichodermaTr-92 chlamydospores were investigated by single factor test and orthogonal test. The results indicated that the optimal conditions for production ofTrichodermaTr-92 chlamydospores were as followed: 2.5% peat, 4.5% maize steep liquor, 2% glucose, 0.5% yeast extract, 3% inoculum, 180 r/min, 28 ℃, initial pH 5.0, and 75 mL liquid medium per 250 mL flask. The actual yield of chlamydospores was 3.01×108spores/mL after 7 days. The chlamydospore production increased by 130.80% compared with the control.

Trichoderma; chlamydospores; fermentation in liquid; culture medium; fermentation condition

2014-04-18

2014-08-14

河北省自然科學(xué)基金(C2010001565)；河北省省級科技計劃專項工作類項目(13256504D)

Q 949.2, S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.005

* 通信作者 E-mail:huangyali2291@163.com；shuishans@hotmail.com