林章凜，張艷，王胥，劉鵬

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合成生物學(xué)研究進展

林章凜，張艷，王胥，劉鵬

（清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京100084）

合成生物學(xué)是以工程化設(shè)計思路，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的元器件和模塊，改造已存在的天然系統(tǒng)或者從頭合成全新的人工生命體系，實現(xiàn)在化學(xué)品合成（包括材料、能源和天然化合物）、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用。人們利用基本的生物學(xué)元件設(shè)計和構(gòu)建了基因開關(guān)、振蕩器、放大器、邏輯門、計數(shù)器等合成器件，實現(xiàn)對生命系統(tǒng)的重新編程并執(zhí)行特殊功能。模塊化處理生物的代謝途徑，并在底盤細胞上進行組裝和優(yōu)化，可以實現(xiàn)大宗化學(xué)品和精細化學(xué)品的合成。目前人們已經(jīng)在丁醇、異丁醇、青蒿素和紫杉醇等化合物的生物合成上取得了重要進展。近年來還發(fā)展了多種基因組編輯和組裝技術(shù)，可精確地對基因組進行編輯，人們還成功地合成了噬菌體基因組、支原體基因組和酵母基因組。在未來的50～100年內(nèi)，合成生物學(xué)將對人類的醫(yī)療、化學(xué)品制造（含藥品）、軍事產(chǎn)生漸進性的、滲透性的但顛覆性的意義。

合成生物學(xué)；生化工程；代謝；元器件；模塊；基因線路；化學(xué)品合成；基因組

引 言

合成生物學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)的研究為基礎(chǔ)，使用“問題導(dǎo)向”和“自下而上”的工程化設(shè)計思路，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的元器件和模塊，改造已存在的天然系統(tǒng)以獲得具有新功能的生物體系，或者從頭合成全新的人工生物體系，其示意圖如圖1所示。合成生物學(xué)在經(jīng)典的基因工程和代謝工程的基礎(chǔ)上整合了工程學(xué)、電子學(xué)、計算機學(xué)、數(shù)學(xué)等多門學(xué)科的內(nèi)容，加深人們對細胞機理、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、生物進化等生命本質(zhì)的認識，還能實現(xiàn)對生命系統(tǒng)的重新編程，執(zhí)行特殊的生物功能。合成生物學(xué)在化學(xué)品合成（包括材料、能源和天然化合物）、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價值。

“合成生物學(xué)”給生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)帶來了空前的變革，被譽為可改變世界的十大新技術(shù)之一[1]。合成生物學(xué)的發(fā)展引起了科學(xué)界和政府的高度重視。如美國國防部最近公布了未來五年的科研戰(zhàn)略部署，包括了合成生物學(xué)在內(nèi)的六大“顛覆性技術(shù)”。他們認為合成生物學(xué)可用于軍用藥物的快速合成、生物病毒戰(zhàn)、基因改良和人體快速損傷修復(fù)等。中國2011年開始規(guī)劃合成生物學(xué)研究計劃，到目前部署了10個合成生物學(xué)國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）項目和1個國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）重大項目。工作重點在元器件庫、化學(xué)品與材料（包括藥品和天然化合物）的合成、腫瘤診治、微生物和植物抗逆、生物固氮等研究。由于啟動比較晚，整體的研究尚處于跟蹤階段。但是可以預(yù)見，合成生物學(xué)研究將對國家的經(jīng)濟和社會發(fā)展帶來重大意義。

1 基本元件

啟動子、基因編碼序列、終止子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白因子、核糖體結(jié)合位點（RBS）、調(diào)控小RNA分子等都是合成生物學(xué)的基本元件。人們開始系統(tǒng)定量表征自然界的天然元件，并開發(fā)了許多基于天然元件的突變?nèi)斯ぴ?。除了上述最基礎(chǔ)的元件外，人們還開發(fā)了一些新型的元件，例如基因間序列元件、DNA位點標(biāo)簽元件、RNA適配子元件等，并著力不斷擴大這些人工元件的種類和數(shù)量。這些元件共同構(gòu)成合成生物學(xué)的元件庫。如圖1所示，借助電路設(shè)計和計算機編程的設(shè)計思路，可以進行人工理性設(shè)計，把這些標(biāo)準(zhǔn)化的元件組裝成功能模塊或者更為復(fù)雜的基因線路[2]。模塊化的基本元件和計算機的輔助設(shè)計，能高效地構(gòu)建出功能體系，減少開發(fā)時間和成本[3]。

圖2給出了一個具體的基因表達模塊例子。啟動子是基因起始轉(zhuǎn)錄的地方，啟動子的強度控制了基因的表達量，終止子在基因的末尾處，負責(zé)停止基因的轉(zhuǎn)錄過程，也是重要的合成生物元件。人們對啟動子進行了工程化的改造，可以構(gòu)建一系列不同強度或誘導(dǎo)時間的人工啟動子，實現(xiàn)對基因表達的精細調(diào)控[4-5]。與啟動子改造工作類似，人們也構(gòu)建了人工終止子元件，這些人工終止子具有序列多樣性，終止強度也不同，有利于設(shè)計和構(gòu)建合成模塊[6]。核糖體結(jié)合位點（RBS）是翻譯的起始位點，使用不同序列的核糖體結(jié)合位點（RBS），能夠在翻譯層次對基因進行調(diào)控[7]。這些啟動子、RBS、基因編碼序列、終止子構(gòu)成了一個基礎(chǔ)的表達模塊，可以通過DNA克隆或者直接化學(xué)合成。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（激活因子或抑制因子）是一種能與DNA序列特異性結(jié)合并且調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，大部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可以直接感受信號，少部分調(diào)控因子需要借助其他信號傳導(dǎo)系統(tǒng)對信號產(chǎn)生響應(yīng)，在接受信號后調(diào)控因子對基因產(chǎn)生激活或抑制的調(diào)控作用。

2 基因線路

近年來，人們利用基本元件開發(fā)了各種基因線路，可以在生物體內(nèi)實現(xiàn)信息處理，例如基因開關(guān)、振蕩器、放大器、邏輯門、計數(shù)器等[2]，構(gòu)建的原理在DNA水平上與圖2類似。以下是一些代表性的基因線路的研究工作。

核糖開關(guān)Riboswitch是天然存在的轉(zhuǎn)錄后層次調(diào)控的基因開關(guān)，通常存在于代謝基因mRNA的非編碼區(qū)域（UTR），能夠感知小分子代謝物的信號，與小分子代謝物結(jié)合后改變RNA的二級結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控代謝基因的表達。人們可以對核糖開關(guān)進行理性設(shè)計，通過體外或體內(nèi)的高通量的篩選方法，獲得小分子配體特異性響應(yīng)的核糖開關(guān)[8]。核糖開關(guān)可用于設(shè)計新型的分子傳感器，例如利用核糖開關(guān)控制報告基因的表達，將酶學(xué)信號轉(zhuǎn)化為更易檢測的信號。也可以將核糖開關(guān)整合進更復(fù)雜的基因線路中實現(xiàn)調(diào)控作用。

除上述基因開關(guān)外，研究人員還開發(fā)了更復(fù)雜的基因開關(guān)系統(tǒng)。例如，美國波士頓大學(xué)的James Collins借鑒電子工程的設(shè)計思路，在生物體內(nèi)構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄水平的雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)。雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)由兩個組成型啟動子和兩個抑制因子組成，兩個啟動子中的任一個都被另一個啟動子所轉(zhuǎn)錄的抑制因子所抑制[9]。這個雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)的結(jié)構(gòu)簡單，所含基因數(shù)和順式調(diào)控元件少，卻能在很寬的范圍內(nèi)達到雙穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，而且“魯棒性”（robustness）很好，對基因表達的內(nèi)在波動不敏感，不容易出現(xiàn)兩個狀態(tài)間的隨機翻轉(zhuǎn)。在沒有啟動子誘導(dǎo)物時，開關(guān)可能處于“開”或“關(guān)”兩種狀態(tài)中的任意一種，但是只要加入誘導(dǎo)物激活相應(yīng)抑制因子的表達，抑制當(dāng)前處于激活狀態(tài)的啟動子，就能將開關(guān)調(diào)節(jié)至另一種狀態(tài)。這樣的合成基因線路有高度簡化和控制度高的特點。

美國加利福尼亞大學(xué)的Christopher Voigt教授研究組利用合成生物學(xué)的思路設(shè)計了一種“大腸桿菌拍照技術(shù)”[10]。通過將外源基因和大腸桿菌中的雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合，在大腸桿菌中構(gòu)成了一個光敏元件。含有該光敏元件的大腸桿菌，在沒有紅光照射時，會生成黑色物質(zhì)；而在有紅光照射時，會保持原色。通過控制光照，可以產(chǎn)生具有清晰對比度的二維圖像，實現(xiàn)給大腸桿菌“照相”的目的。這是首次關(guān)于具備圖像處理功能的基因雙穩(wěn)態(tài)線路的報道，獲得了人們的重點關(guān)注和廣泛報道。

美國普林斯頓大學(xué)的Michael Elowitz和Stanislas Leibler用了3個轉(zhuǎn)錄抑制系統(tǒng)相互抑制的關(guān)系理性設(shè)計了振蕩器。第1個抑制因子LacI抑制第2個抑制因子基因的轉(zhuǎn)錄，第2個抑制因子TetR抑制第3個基因，最后CI抑制第1個抑制因子LacI的轉(zhuǎn)錄，完成循環(huán)。振蕩器的報告蛋白GFP也受到TetR的抑制，振蕩器實現(xiàn)了“人工時鐘”的功能，周期性地誘導(dǎo)表達綠色熒光蛋白[11]。每個周期為幾個小時，比細胞的分裂周期慢，說明振蕩器可以在一代代細胞中傳導(dǎo)信號。

在基因線路中使用正反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以構(gòu)建生物“放大器”。伊利諾伊大學(xué)香檳分校的Goutam Nistala等使用P啟動子和LuxRΔ2-162構(gòu)建了“放大器”，在這個系統(tǒng)中LuxRΔ2-162能激活P啟動子，是正反饋信號。研究人員通過單組分的四環(huán)素感知系統(tǒng)和雙組分的天冬氨酸感知系統(tǒng)，檢測了“放大器”的效果，發(fā)現(xiàn)“放大器”對四環(huán)素信號和天冬氨酸信號的放大效果都很明顯[12]?！胺糯笃鳌笨梢蕴岣邔φT導(dǎo)信號的敏感度和輸出基因的最大表達量，可以用于構(gòu)建更復(fù)雜的合成基因線路。

邏輯門是用于構(gòu)建合成生物學(xué)數(shù)字器件的重要組成部分。倫敦大學(xué)帝國理工學(xué)院的Martin Buck研究小組在大腸桿菌中構(gòu)建了的異源模塊?；蚓€路中包含由不同的啟動子控制的基因和基因，輸出為54依賴的啟動子，只有當(dāng)和都被表達時啟動子才被激活，因此形成了數(shù)字AND門的功能[13]。利用類似的設(shè)計思路，研究人員還將AND門與NOT門組合構(gòu)建了NAND門。這是采用具有正交性生物元件為基礎(chǔ)的工程化模塊構(gòu)建方法，基因邏輯門器件有工程化的可預(yù)測特性。

T7噬菌體的RNA聚合酶（T7 RNAP）可以被分割成兩個部分，用于構(gòu)建邏輯門。分割后的部分分別由不同的誘導(dǎo)型啟動子控制，只有當(dāng)兩個啟動子都被誘導(dǎo)時才能形成完整的有功能的T7 RNAP，構(gòu)建出轉(zhuǎn)錄水平的AND門[14]。T7 RNAP進一步還可以分割成3部分，構(gòu)建出三信號輸入的AND門[15]。T7 RNAP和宿主菌大腸桿菌中不同的σ因子組合還能構(gòu)建出更多信號輸入的調(diào)控模塊[16]。

合成模擬基因線路可以用來構(gòu)建模擬數(shù)字電路，用現(xiàn)代計算的方法來對細胞進行編程。細胞計數(shù)器可以用來完成復(fù)雜的程序。細胞計數(shù)器可以用于精確調(diào)控生物分子過程，有效地維持代謝和生長，對合成生物學(xué)有重要意義。2009年George Church和James Collins合作報道了用大腸桿菌實現(xiàn)最高三次計數(shù)的“計數(shù)器”[17]。計數(shù)器利用誘導(dǎo)啟動子和RNA調(diào)控元件等在轉(zhuǎn)錄層次和翻譯層次實現(xiàn)信號響應(yīng)，然后利用重組酶實現(xiàn)DNA特定位點之間的反轉(zhuǎn)，構(gòu)建出DNA記憶單元，記憶結(jié)果還可以穩(wěn)定遺傳至后代細胞中。2013年麻省理工學(xué)院的Rahul Sarpeshkar和Timothy Lu等利用3種轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建了可執(zhí)行復(fù)雜計算能力的合成模擬基因線路，能進行模擬傳感和加法、除法、對數(shù)和平方根計算[18]。例如分別通過兩個啟動子表達綠色熒光蛋白GFP，可以計算兩個誘導(dǎo)物輸入信號的加法運算。使用復(fù)雜的模擬基因電路可以顯著改變細胞對信號感應(yīng)、基因表達、計算和控制的效果。

3 化學(xué)品合成

生物代謝的多樣性為發(fā)展生物制造提供了理論基礎(chǔ)。將來源不同的生物制造相關(guān)的代謝途徑模塊化，并在底盤細胞上進行組裝，設(shè)計合適的生物合成途徑，提高代謝途徑的效率，降低大規(guī)模生物催化反應(yīng)的成本。在化學(xué)品合成領(lǐng)域，合成生物學(xué)有別于傳統(tǒng)代謝工程，主要體現(xiàn)在如下幾個方面：①合成生物學(xué)開始大規(guī)模使用跨種屬的基因組合；②使用人工元件對合成通路進行優(yōu)化，例如采用不同強度的啟動子或基因間序列優(yōu)化基因的表達量，從而達到優(yōu)化代謝通路和提高產(chǎn)品產(chǎn)量的目的；③可以根據(jù)天然酶反應(yīng)和化學(xué)逆合成分析而設(shè)計自然界不存在的合成通路；④利用合成生物學(xué)的組裝工具能把不同組合的大片段DNA快速組裝成完整代謝通路，進行測試。

3.1 正丁醇和異丁醇

在大宗化學(xué)品的生物合成方面，最有代表性的工作是美國加州大學(xué)洛杉磯分校的James Liao研究組的丁醇類物質(zhì)的合成生物學(xué)研究。丁醇和異丁醇是重要的基礎(chǔ)化工原料，也是一種極具工業(yè)潛力的生物燃料，用以替代傳統(tǒng)的化石燃料，其熱值及辛烷值與汽油相當(dāng)，遠高于乙醇。研究人員使用了合成生物學(xué)的方法在工程菌株中構(gòu)建丁醇和異丁醇的合成通路，實現(xiàn)了丁醇和異丁醇的生物生產(chǎn)。

野生型梭狀芽孢桿菌（）可以首先生成丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A，然后再經(jīng)過一系列的反應(yīng)生成正丁醇。但是目前梭狀芽孢桿菌不是工業(yè)菌株，不適用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵的應(yīng)用，德國馬爾堡大學(xué)的Rudolf Thauer研究組將梭狀芽孢桿菌的正丁醇合成通路引入到大腸桿菌，在大腸桿菌中構(gòu)建了正丁醇的合成通路。然而來源于梭狀芽孢桿菌的丁酰輔酶A脫氫酶電子傳遞黃素蛋白（Bcd/Etf）復(fù)合體無法在大腸桿菌中進行有效的活性組裝[19]，導(dǎo)致大腸桿菌工程菌株的正丁醇產(chǎn)量遠低于野生型梭狀芽孢桿菌。James Liao研究組成功地在大腸桿菌菌株中使用了梭狀芽孢桿菌的反式- 2-enoyl-輔酶A（-2-enoyl-CoA）還原酶的通路來替代Bcd/Etf復(fù)合體的巴豆酰基輔酶A還原通路，最終有效地增加了正丁醇的產(chǎn)量，達到了800～1600 mg·L-1·d-1，遠遠超過使用依賴Bcd/Etf的正丁醇合成途徑的產(chǎn)量（150 mg·L-1·d-1）[20]。雖然目前通過生物法生產(chǎn)的正丁醇產(chǎn)量還不足以應(yīng)用在大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵行業(yè)，但是利用合成生物學(xué)的改造方法，有望在不遠的將來實現(xiàn)正丁醇生物合成的工業(yè)生產(chǎn)。

在異丁醇的生物合成技術(shù)方面，James Liao研究組在大腸桿菌中引入兩個異源酶，分別是來源于乳酸乳球菌（）的2-酮異戊酸脫羧酶KivD和來源于釀酒酵母（）的乙醇脫氫酶AdhA，在大腸桿菌纈氨酸合成通路的一個中間代謝產(chǎn)物（2-酮異戊酸）節(jié)點上將碳通量分流進入異丁醇的合成通路，實現(xiàn)大腸桿菌的異丁醇的生物合成[21]。此外通過應(yīng)用PLlacOI啟動子過表達基因增加了上游途徑中2-酮異戊酸的表達量，使大腸桿菌的異丁醇產(chǎn)量達到22 g·L-1[21]。實驗室水平的進一步發(fā)酵條件優(yōu)化可以將異丁醇的產(chǎn)量提高到55 g·L-1[22]。

3.2 青蒿素

合成生物學(xué)技術(shù)采用綠色、可持續(xù)發(fā)展的方式規(guī)?；a(chǎn)天然化合物，是未來天然化合物制備的發(fā)展方向之一。美國加州大學(xué)伯克利分校化學(xué)與生物分子工程系的Jay Keasling教授在天然化合物合成生物學(xué)方面做出了突出貢獻。2006年，Jay Keasling課題組在酵母細胞中設(shè)計并整合了青蒿酸的生物合成途徑，在基因工程的原理上引入了模塊化設(shè)計的理念，利用之前設(shè)計的甲羥戊酸途徑模塊、前體法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）合成模塊、紫穗槐-4, 11-二烯合成模塊共同構(gòu)成青蒿酸生物合成代謝通路。通過對各模塊關(guān)鍵酶特別是P450酶和代謝通路的優(yōu)化，目前已經(jīng)成功利用微生物實現(xiàn)了瘧疾治療藥物青蒿素的高效生產(chǎn)[23-24]。其中，代謝通路的優(yōu)化，主要基于一種調(diào)節(jié)多基因操縱子中基因相對表達量的方法，即利用可調(diào)基因間序列（tunable intergenic regions，TIGR）在轉(zhuǎn)錄后層次對基因表達進行調(diào)控[25]。2013年，Christopher Paddon等在Jay Keasling成果的基礎(chǔ)上，引入來源于黃花蒿植物的脫氫酶和細胞色素P450酶，進一步將青蒿素的產(chǎn)量提高到工業(yè)化水平[26]。合成生物學(xué)技術(shù)對青蒿素的成功制備不僅可能解決該藥物來源窄、價格昂貴等問題，還能保證生產(chǎn)過程不受環(huán)境和土地的制約，穩(wěn)定世界市場上青蒿素的供應(yīng)。

2009年，Jay Keasling課題組將工程化的人工蛋白支架用于代謝工程，利用蛋白支架與同源多肽配體的特異性結(jié)合，將代謝途徑的相關(guān)酶以設(shè)定的方式在空間上進行排列整合，提高反應(yīng)過程中代謝中間產(chǎn)物的局部濃度，進而提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[27]。該方案還解決了異源代謝通路在工程菌中缺乏調(diào)控機制所導(dǎo)致的代謝流失衡的問題。該技術(shù)成功優(yōu)化了甲羥戊酸生物合成途徑中3種酶的空間布局和數(shù)量配比，使甲羥戊酸產(chǎn)量提高77倍，同時降低了對酶表達量的需求，減輕了工程菌的代謝負擔(dān)。Jay Keasling課題組進一步利用該策略使得葡糖二酸的產(chǎn)量在原已高產(chǎn)的基礎(chǔ)上又提高至3倍的生產(chǎn)水平，并設(shè)想其成果對其他代謝途徑的代謝流微調(diào)控具有通用性和可設(shè)計性。

3.3 紫杉醇

紫杉醇廣泛用作抗癌藥物，但是天然紫杉醇類物質(zhì)產(chǎn)量有限。2010年，麻省理工學(xué)院的Gregory Stephanopoulos課題組成功地在大腸桿菌中合成了紫杉醇的前體物紫杉二烯[28]。通過開發(fā)多元模塊代謝工程的方法，將紫杉醇藥物中間體紫杉二烯代謝途徑分成兩個模塊，宿主菌自身上游合成IPP（isopentenyl pyrophosphate）的MEP（methylerythritol- phosphate）途徑和異源下游萜類合成途徑，并通過不同拷貝數(shù)（單拷貝基因組整合，質(zhì)粒pSC101、p15A、pBR322）、不同啟動子（Trc、T5、T7）的組合分別對兩個模塊的代謝流進行微調(diào)，優(yōu)化紫杉烯合成的代謝平衡，減少中間抑制物吲哚的積累。通過Trc啟動子控制4個限速酶基因（--）的表達并整合到染色體上，優(yōu)化了上游MEP途徑，通過T7啟動子在質(zhì)粒pSC101上表達異源GGPP合酶基因和紫杉烯合酶基因優(yōu)化了下游萜類合成途徑。最終紫杉二烯的產(chǎn)量提高15000倍，1 L發(fā)酵罐中的產(chǎn)量達到1 g·L-1。這種多元模塊代謝工程的方法將整個代謝途徑分為多個小的模塊，并進行分別調(diào)節(jié)，可以有效地在一個較小的組合范圍內(nèi)獲得優(yōu)化的代謝流平衡，為紫杉醇及萜類天然產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3.4 無細胞合成技術(shù)

弗吉尼亞理工學(xué)院和州立大學(xué)的Percival Zhang[29]系統(tǒng)地闡述了“基于無細胞合成酶的生物轉(zhuǎn)化途徑”的概念，在體外組裝大量酶和輔酶以實現(xiàn)復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化。這種無細胞合成酶催化體系具有反應(yīng)條件較溫和、易于調(diào)控、產(chǎn)率高的特點。該課題組成功構(gòu)建了由13個酶和輔酶因子組成的多酶產(chǎn)氫耦合體系[30]，以淀粉和水為底物，30℃條件下，采用耦合13種酶的多酶組合體把淀粉和水轉(zhuǎn)化為氫氣和二氧化碳，1 mol 淀粉葡萄糖和水能夠生成12 mol 氫分子，新的糖氫轉(zhuǎn)化技術(shù)為大規(guī)模工業(yè)產(chǎn)氫提供有益參考。亞利桑那大學(xué)的Bradley Moore研究組首次報道了組裝Ⅱ型聚酮化學(xué)物合成酶催化的天然全合成途徑，并利用此體外多酶全合成體系在單一的反應(yīng)釜內(nèi)把底物苯甲酸和丙二酸酯轉(zhuǎn)化為天然抗生素腸道菌素，避免了復(fù)雜的菌株代謝調(diào)控，有利于工業(yè)生產(chǎn)放大[31]。

4 人工合成生態(tài)系統(tǒng)(多細胞體系)

構(gòu)建具有良好協(xié)調(diào)行為的多細胞體系的人工合成生態(tài)系統(tǒng)，能夠解決單一細胞難以高效完成的復(fù)雜功能。認識微生物之間相互作用機制，為構(gòu)建人工合成生態(tài)系統(tǒng)提供了基礎(chǔ)。合成生物學(xué)的一些基本器件特別是基因線路，則為相關(guān)設(shè)計提供了新工具。設(shè)計合成生態(tài)系統(tǒng)時，可以參考自然條件下不同細胞間的關(guān)系，例如互惠共生、拮抗、競爭等，和構(gòu)成這些關(guān)系的分子基礎(chǔ)，例如環(huán)境抑制物、細胞通信信號分子、共同底物、互補代謝物等。Frederick Balagaddé等模擬捕食-被捕食生態(tài)系統(tǒng)，通過合成基因線路和acyl-HSL信號聯(lián)系共同培養(yǎng)的大腸桿菌，捕食者通過誘導(dǎo)捕食基因殺死被捕食者，同時被捕食者可以通過激發(fā)捕食者的解藥蛋白表達援救捕食者。兩種群之間存在互相依賴的關(guān)系，可通過化學(xué)物誘導(dǎo)使得兩種大腸桿菌的數(shù)量出現(xiàn)波動[32]。Mark Eiteman 等構(gòu)建了兩種底物專一性的大腸桿菌，分別可以利用葡萄糖和木糖。通過對這兩種菌的混合培養(yǎng)，解決了單一菌株的碳代謝抑制問題，實現(xiàn)對兩種糖源的共同代謝，而且這種方法適用于不同濃度比例的兩種糖源的體系，因此有希望實現(xiàn)對纖維素水解液等糖混合體系的高效利用[33]。

5 基因組編輯和組裝

近些年基因組編輯技術(shù)發(fā)展很快。人們利用合成生物學(xué)的器件設(shè)計思路，基于ZF（zinc finger）、TALE（transcriptional activator-like effector）和CRISPR/Cas （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR associated proteins）系統(tǒng)開發(fā)了基因組編輯相關(guān)的“分子手術(shù)刀”。通過ZF、TALE、CRISPR/Cas對目標(biāo)基因序列的特異性的識別作用，可以完成對基因的敲除和替換的編輯[34-37]，還可以進行基因的甲基化修飾，也可以構(gòu)建人工的轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)對基因表達的抑制或激活[38]。其中，CRISPR/Cas系統(tǒng)是近些年研究最為熱門的技術(shù)，有望發(fā)展為最有前景的基因組編輯技術(shù)。

工程應(yīng)用上，MAGE（multiplex automated genome engineering）較為成熟。它利用細胞的復(fù)制機理進行連續(xù)的基因組編輯[39]，能將合成的DNA片段導(dǎo)入基因組對基因組進行編輯。通過MAGE技術(shù)，可以對啟動子[40]、核糖體結(jié)合位點（RBS）[39]進行替換從而優(yōu)化合成路徑。在MAGE的基礎(chǔ)上，Geroge Church課題組開發(fā)了CAGE（conjugative assembly genome engineering）技術(shù)，可以對整個基因組進行改編，如利用CAGE將整個基因組范圍內(nèi)的TAG終止密碼子改為TAA密碼子[41]。

對于合成生物學(xué)來說，將元件DNA片段組裝成為大片段是必需的步驟。近些年發(fā)展出了一些快速進行DNA組裝的方法?？梢苑譃轶w內(nèi)組裝和體外組裝的方式[42]。體內(nèi)DNA組裝是利用細胞的重組機制，如利用酵母重組機制的DNA Assembler技術(shù)[43]及TAR（transformation-associated recombination）克隆技術(shù)，利用枯草芽孢桿菌（）重組機制的OGAB（ordered gene assembly in）技術(shù)[44]和Domino技術(shù)[45]。體內(nèi)重組進行DNA組裝的優(yōu)點是可以進行多片段同時組裝和大片段的組裝。體外DNA組裝技術(shù)是依賴于核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、聚合酶、重組酶等工具酶進行體外組裝的技術(shù)，如利用同尾酶的BioBrickTM克隆、利用重組酶的CPEC技術(shù)[46-47]、利用Ⅱ型內(nèi)切酶的Golden Gate技術(shù)[48-49]和BglBricks技術(shù)，以及同時利用核酸外切酶、聚合酶和重組酶的Gibson Assembly技術(shù)[50-52]等。

合成基因組是合成生物學(xué)近年來的重要研究進展之一，為未來利用合成生物學(xué)設(shè)計部分或者全新生命體提供技術(shù)支撐。其中最具代表性的是美國Craig Venter研究組的工作。2003年，他們成功地合成了ΦX174噬菌體基因組[53]，拉開了人工合成噬菌體基因組的序幕。2008年，他們又成功地使用寡核苷酸合成了蕈狀支原體（）全基因組[54]。為了進一步研究人工基因組的生物活性，在2010年，Craig Venter等將人工合成的蕈狀支原體基因組導(dǎo)入山羊支原體（）細胞中，發(fā)現(xiàn)含人工基因組的山羊支原體細胞不僅能存活，而且經(jīng)歷一定生長周期后，從山羊支原體細胞中可以產(chǎn)生與蕈狀支原體非常相似的個體[55]。該工作成功地證明了人工基因組的生物活性，也證明了通過合成生物學(xué)能夠?qū)崿F(xiàn)基因組的人工進化。

2014，由美、英、法等多國研究人員組成的科研小組在《科學(xué)》雜志上發(fā)文宣布，他們歷時7 年成功構(gòu)造了源于釀酒酵母的synⅢ的染色體。研究小組對這條人工合成的酵母染色體進行了500多處修改，使其簡化、穩(wěn)定并便于外源基因的插入[56]。這將有助于更快地培育新的酵母合成菌株，用于制造稀有藥物，以及高效生產(chǎn)生物燃料等諸多方面。這是人類首次合成真核生物的完整染色體，是向合成人造微生物等生命體邁出的重要一步。

近年來，探究細胞維持正常生存所需最小基因組的工作相繼被報道。通過基因組簡化有助于理解基因組的功能，降低細胞代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的冗余程度、提高外源基因的穩(wěn)定性、優(yōu)化細胞代謝途徑提高對細胞的物質(zhì)和能量利用率。Hiroshi Mizoguchi等通過對大腸桿菌進行多個基因組合敲除實驗，得到基因組減少22%的MGF-01菌株，MGF-01與野生株相比對數(shù)期有相同的生長速率，但穩(wěn)定期最終菌體濃度可達到野生型的1.5倍，而且可以使菌株的蘇氨酸生產(chǎn)能力提高1倍[57]。Takuya Morimoto等通過刪除枯草桿菌基因組的非必需片段，得到刪減了20.7%的簡化菌株MGB874，該菌株有更高的纖維素酶和蛋白酶生產(chǎn)量[58]。

6 合成生物學(xué)與化學(xué)工程

如果把中華文明的5000年歷史看作一天的話（24 h），那么以合成氨（1902年）為標(biāo)志的現(xiàn)代物質(zhì)文明階段僅為34 min，以基因工程（1973年）為標(biāo)志的現(xiàn)代生物技術(shù)文明階段僅為12 min。或者說，人們熟悉的現(xiàn)代文明才剛剛開始，合成生物學(xué)的未來有無限的可能性。在未來的50～100年內(nèi)，合成生物學(xué)將對人類的醫(yī)療、化學(xué)品制造（含藥品）、軍事產(chǎn)生漸進性的、滲透性的但顛覆性的意義。如，未來合成生物學(xué)的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用有望與合成化學(xué)的歷史貢獻相媲美。值得關(guān)注的是，杜邦公司作為最大的化學(xué)品公司之一，已經(jīng)轉(zhuǎn)向生物化學(xué)品。

然而，合成生物學(xué)發(fā)展也存在一些深層問題。首先，目前基因線路的模塊設(shè)計大多局限于簡單的、演示性的人工器件，這種IT模式的模塊有其局限性，未來其主流應(yīng)用可能在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。相反，人們對宿主的自然模塊和網(wǎng)絡(luò)的定量認識還不足，還無法真正基于定量模型進行人工生命體系的設(shè)計。未來只有更多地使用物理和數(shù)學(xué)的方法加深對這些自然模塊、網(wǎng)絡(luò)和系統(tǒng)的認識，才能實現(xiàn)理性設(shè)計。另外，由于跨物種的元器件標(biāo)準(zhǔn)化難以實現(xiàn)，目前需要更多地關(guān)注同物種的標(biāo)準(zhǔn)化器件?；瘜W(xué)工程學(xué)科的發(fā)展，對合成生物學(xué)有重要啟示?；瘜W(xué)工程經(jīng)歷了75年的發(fā)展歷史才成為一門成熟的學(xué)科。如圖3所示，1887年以化學(xué)學(xué)科為基礎(chǔ)，英國人George Davis提出了化學(xué)工程的概念，1905年麻省理工學(xué)院的William Walker教授，結(jié)合機械工程，提出了單元操作，1960年威斯康辛大學(xué)麥迪遜分校的Byron Bird教授，利用物理和數(shù)學(xué)的方法，發(fā)展了傳遞原理，對化學(xué)工程過程進行了分子水平的分析和表述，至此，化學(xué)工程發(fā)展成為一門成熟的基礎(chǔ)工程學(xué)科，并形成了世界最重要的制造業(yè)之一。合成生物學(xué)可以借鑒和學(xué)習(xí)化學(xué)工程的發(fā)展過程，以生物學(xué)科為基礎(chǔ)，整合數(shù)學(xué)、物理、化學(xué)等學(xué)科，然后逐步發(fā)展為成熟的“合成生物學(xué)”學(xué)科和工程產(chǎn)業(yè)。這里面，化學(xué)工程師將有重要的機會。事實上，目前合成生物學(xué)的一個重要分支，即化學(xué)品合成，基本是由歐美的化學(xué)工程系研究人員完成的。

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Recent advances in synthetic biology

LIN Zhanglin，ZHANG Yan，WANG Xu，LIU Peng

Department of Chemical EngineeringTsinghua UniversityBeijingChina

Synthetic biology is the engineering design and construction of standardized parts, devices and modules to modify the natural life systems or thesynthesis of new life systems. Synthetic biology has been widely applied to the fields of chemical synthesis (including materials, biofuels and natural compounds), medical industry, agriculture and environmental protection. Biological parts are used to construct synthetic modules such as toggle switch, synthetic oscillator, genetic amplifier, biologic gates and cellular counter. These synthetic modules reprogram life systems to perform specific functions. Modularized metabolic pathways are optimized in the cellular chassis to realize the biological production of bulk and fine chemicals, such as butanol, isobutanol, artemisinin, and taxol. In recent years, researchers have also developed several genome-editing and DNA assembly techniques, making it possible to perform the precise editing and synthesis of genomes. Moreover, genomes of bacteriophage,andhave also been successfully synthesized. In the next 50—100 years, synthetic biology will have significant influence on medical industry, chemical (including drugs) synthesis and military affairs. Synthetic biology will have a gradual but disruptive meaning to the world.

synthetic biology；biochemical engineering；metablism; parts and devices；modules；genetic circuit；chemical synthesis；genome

2015-05-21.

Prof. LIN Zhanglin, zhanglinlin@mail.tsinghua. edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157. 20150648

Q 81

A

0438—1157（2015）08—2863—09

林章凜（1967—），男，教授。

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目（2013CB733900）。

2015-05-21收到初稿，2015-05-28收到修改稿。

supported by the National Basic Research Program of China (2013CB733900).