呂波，馮旭東，李春

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-葡萄糖醛酸苷酶鍵選擇性高效篩選體系的構(gòu)建與應(yīng)用

呂波，馮旭東，李春

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物工程系，北京 100081）

分子改造是提高-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）在生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）過程中的鍵選擇性的有效方法，但高通量篩選方法的缺失是限制其發(fā)展的重要瓶頸。為解決該問題，在大腸桿菌中構(gòu)建了組成型表達-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E），利用溫度誘導(dǎo)表達噬菌體裂解酶SRRz實現(xiàn)原位裂解的一鍋法（one-pot）甘草酸鍵選擇性篩選體系（CELS）；同時考察了啟動子強度對PGUS-E外源表達的效果，優(yōu)化了不同溫度下裂解酶SRRz的表達對酶釋放效率的影響。結(jié)果表明，CELS篩選體系成功實現(xiàn)了集培養(yǎng)、產(chǎn)酶、裂解和反應(yīng)于一體化工藝，并將其應(yīng)用于PGUS-E的非理性改造，獲得了一系列鍵選擇性顯著提高的突變酶。研究證明，TIM 桶狀結(jié)構(gòu)域中螺旋結(jié)構(gòu)的變化對甘草酸鍵選擇性的改善有很大的影響。

-葡萄糖醛酸苷酶；生物催化；分子生物學(xué)；優(yōu)化設(shè)計；鍵選擇性

引 言

甘草酸（glycyrrhizin，GL）是甘草中最主要的有效活性成分之一，由五環(huán)三萜皂苷通過-1,2-糖苷鍵和-1,3-糖苷鍵與兩分子葡萄糖醛酸相連構(gòu)成，具有抗炎癥[1]、抗病毒[2]、抗高血壓[3]、抗衰老、增強機體免疫力、改善高血脂癥和維持體內(nèi)水鹽代謝平衡等功效。單葡萄糖醛酸基甘草次酸（glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG）是甘草酸外側(cè)的-1,2-糖苷鍵通過水解一分子的葡萄糖醛酸得到的產(chǎn)物，與甘草酸相比，其極性適中，甜度更高[4]，具有更好的甜度藥理活性和生物安全性[5-6]，被廣泛應(yīng)用于食品[7]、化妝品[8]以及潛在的精細化工領(lǐng)域。

目前，GAMG的生產(chǎn)主要有化學(xué)法[9]和生物 法[10]兩種。與化學(xué)法相比，生物法具有反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好以及收率高等特點，符合環(huán)境和健康的可持續(xù)發(fā)展。生物法制備GAMG主要是利用微生物所產(chǎn)生的-葡萄糖醛酸苷酶（-glucuronidase，-GUS）水解甘草酸制備得到[11-13]。然而，目前酶法制備GAMG普遍存在發(fā)酵周期長、酶的產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高和鍵選擇性低等問題[12]。本課題組通過基因克隆構(gòu)建-葡萄糖醛酸苷酶的大腸桿菌[.BL21 (DE3)]異源表達體系[14]，發(fā)現(xiàn)重組的-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）存在鍵選擇性差的問題，不僅能夠催化甘草酸生成GAMG，也能同步水解GAMG生成甘草次酸（GA），無法形成GAMG的大量積累，大大限制了酶法制備GAMG的工業(yè)化應(yīng)用。

目前，蛋白工程的定向進化和理性設(shè)計的成功應(yīng)用賦予酶分子功能的多樣性[15]，其主要步驟包括突變庫的建立、突變體酶的表達和高通量篩選方法的建立。其中，能否建立一個高靈敏、高通量和易操作的高效篩選方法是蛋白成功改造的關(guān)鍵[16]。然而，并不是所有的分子改造都能建立相應(yīng)的高通量篩選方法。同時，在突變酶的重組表達過程中涉及多步驟操作，如誘導(dǎo)劑的添加、離心、細胞破碎等，在大規(guī)模的篩選過程（＞103）中無疑增加了篩選的工作量。利用基因工程技術(shù)和過程集成，對篩選的工藝進行一系列改進，可以減少篩選的工作量，提高篩選效率，為酶的工業(yè)化應(yīng)用提供新的支持。

本文以大腸桿菌為宿主，以-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）為研究對象，建立了一種組成型表達-葡萄糖醛酸苷酶，溫度誘導(dǎo)表達噬菌體裂解酶SRRZ實現(xiàn)原位裂解，集培養(yǎng)、產(chǎn)酶、裂解和反應(yīng)于一體的一鍋法（one-pot）甘草酸鍵選擇性篩選體系（CELS）（圖1），并將其成功運用于-葡萄糖醛酸苷酶的定向進化的篩選中，獲得了一系列鍵選擇性顯著提高的突變酶，為分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了理論依據(jù)。

圖1 PGUS-E篩選工藝的改進

1 材料和方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

.DH5α（ΔuidA）由實驗室構(gòu)建并保存。重組大腸桿菌[.BL21(DE3)/pET-28a(+)-PGUS]由實驗室前期構(gòu)建。pUC19載體購自Takara公司，溫度敏感型質(zhì)粒pEAS-1a載體由清華大學(xué)的林章凜教授惠贈[17]。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g·L-1）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15（固體培養(yǎng)基)和氨芐青霉素100 μg·ml-1。篩選培養(yǎng)基CPGYG： KH2PO43.0 g·L-1、Na2HPO47.0 g·L-1，(NH4)2SO43.0 g·L-1, 酪蛋白胨 30.0 g·L-1，谷氨酸鈉5.0 g·L-1，酵母提取物5.0 g·L-1, 甘油50.0 g·L-1, MgSO41.0 g·L-1, 檸檬酸鈉1.0 g·L-1，甘草酸 1 g·L-1，pH 6.8；于121℃下滅菌20 min備用。

1.3 主要試劑

PCR相關(guān)試劑如rTaq DNA聚合酶、 dNTP等購自Takara公司；PCR產(chǎn)物純化、酶切產(chǎn)物純化提取試劑盒購自北京百泰克生物有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒和核酸分子量標準（DNAMarker）購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶等購自Fermentas公司，氨芐青霉素等試劑購自北京鼎國生物工程公司，TransStart FastPfu DNA Polymerase購自北京金式金生物技術(shù)有限公司；本實驗用到的引物由金唯智生物科技有限公司合成，測序工作也由金唯智公司完成。

1.4-葡萄糖醛酸苷酶突變體的表達和篩選

通過易錯PCR方法構(gòu)建突變體文庫[18]，采用96微孔板進行表達。將LB固體培養(yǎng)基平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到含有200 μl CPGY培養(yǎng)基（含100 μg·L-1Amp）的96孔板中，于30℃、170 r·min-1培養(yǎng)24 h。然后將96孔板轉(zhuǎn)入40℃的搖床中，170 r·min-1，熱誘導(dǎo)表達噬菌體裂解酶SRRz裂解細胞進行酶反應(yīng)，反應(yīng)時間為24 h。接著，篩選鍵選擇性提高的-葡萄糖醛酸苷酶突變體，初篩通過薄層色譜（TLC）檢測各體系中GL、GAMG和GA的含量，通過初篩的轉(zhuǎn)化子利用HPLC進行復(fù)篩。

1.5-葡萄糖醛酸苷酶酶活測定方法

以甘草酸為底物測定-葡萄糖醛酸苷酶的 活力[19]。準確移取100 μl酶液到400 μl甘草酸 1 g·L-1緩沖溶液中，40℃反應(yīng) 10 min，所得產(chǎn)物用甲醇按1:9的比例進行稀釋，用高效液相色譜儀檢測GL、GAMG和GA的含量，采用外標法對GL、GAMG和GA進行定量。檢測儀器參數(shù)為：島津LC-10A；色譜柱Shim-pack，VP-ODS（150×46）；檢測器SPD；檢測波長254 nm；流動相甲醇:重蒸水（pH 2.85）81:19；進樣量10 μl；流速1 ml· min-1；柱溫箱40℃；工作站：LCsolution。每個-葡萄糖醛酸苷酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘消耗 1 nmol甘草酸所需要的酶量。

圖2 PGUS-E篩選表達載體的構(gòu)建

1.6-葡萄糖醛酸苷酶的底物特異性定義

在一定時間內(nèi)，GL轉(zhuǎn)化率>90%以上，產(chǎn)物GAMG在產(chǎn)物中的摩爾比定義為-葡萄糖醛酸苷酶的鍵選擇性，具體計算公式如下[20]

式中，0為甘草酸的初始濃度；t為甘草酸的剩余濃度；GL為甘草酸的轉(zhuǎn)化率，%；GAMGmol為GAMG的濃度；GAmol為GA的濃度；cb為GAMG的鍵選擇性，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙功能質(zhì)粒的構(gòu)建

載體構(gòu)建選用了氨芐抗性基因和pUC19的復(fù)制起始序列作為載體的基本骨架序列，用于原核生物.的陽性克隆篩選和擴增。載體主要包含3部分：原核生物抗性基因和復(fù)制起始位點序列、含有溫度誘導(dǎo)的啟動子cIts857/pR控制的噬菌體裂解基因SRRz和不同組成型啟動子控制的GUS酶基因，各片段直接通過設(shè)計的酶切位點進行連接，具體的構(gòu)建策略如圖2所示。根據(jù)啟動子的不同將構(gòu)建的載體分別命名為pHce-GUS，pTac-GUS和pGap-GUS。載體中的各目的片段分別通過PCR方法獲得，其中Amp-ori片段長度為2125 bp（Ⅰ/Ⅰ），cIts857/pR-SRRz片段長度為2579 bp （Ⅰ/Ⅰ），Hce-GUS-rrnB片段長度為2435 bp（Ⅰ/Ⅰ），Gap-GUS-rrnB片段長度為2487 bp（Ⅰ/Ⅰ），Tac-GUS-rrnB片段長度為2413 bp（Ⅰ/Ⅰ），通過將各自的片段進行膠回收、酶切過夜再回收，控制連接片段的摩爾比在16℃下定向連接過夜，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌.DH5α/ΔuidA感受態(tài)細胞中，在Amp抗性平板上 30℃培養(yǎng)過夜生長單菌落，通過菌落PCR進一步篩選陽性克隆，將獲得陽性克隆送北京金唯智生物公司測序。

2.2 啟動子對-葡萄糖醛酸苷酶表達的效果

大腸桿菌的啟動子是控制外源基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控元件，在一定條件下，外源基因轉(zhuǎn)錄的啟動效率取決于RNA聚合酶與啟動子的作用強度。為了研究不同啟動子強度對PGUS-E的組成型外源表達的影響，構(gòu)建了3種不同啟動子重組菌株，.DH5α（ΔuidA）/pHce-GUS，.DH5α（ΔuidA）/ pTac-GUS和.DH5α（ΔuidA）/pGap-GUS。SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示，不同啟動子調(diào)控的重組菌在70×103處出現(xiàn)明顯的條帶，與理論的-葡萄糖醛酸苷酶的大小相符，說明Tac、Hce和Gap啟動子成功地表達了-葡萄糖醛酸苷酶（圖3）。同時，SDS-PAGE蛋白電泳圖顯示，.DH5α（ΔuidA）/pHce-GUS的蛋白表達量是最高的。比較不同來源啟動子表達的-葡萄糖醛酸苷酶的酶活發(fā)現(xiàn)，來源于的pHce啟動子控制的.DH5α（ΔuidA）/pHce-GUS的重組-葡萄糖醛酸苷酶的酶活最高（圖4），達到17.2 U·ml-1，達到了誘導(dǎo)性表達pET-28a(+)-PGUS的70%左右，滿足了后續(xù)高通量篩選的需要。

2.3 溫度對噬菌體裂解酶裂解效率的影響

噬菌體裂解酶SRRz的表達受溫度誘導(dǎo)的啟動子cIts857/pR控制，隨著溫度的升高，阻遏蛋白cIts857 因熱失活，并引起噬菌體裂解基因SRRz的表達，達到溶菌的效果。將構(gòu)建成功的.DH5α（ΔuidA）/pHce-GUS接種后30℃過夜培養(yǎng)，以 1%接種量轉(zhuǎn)接到300 ml（Amp濃度100 μg·L-1）CPGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)-葡萄糖醛酸苷酶酶活測定方法，將含有.DH5α（ΔuidA）/ pHce-GUS的菌體分別在35～42℃之間的多個溫度下反應(yīng)，終止反應(yīng)后測定酶活，考察在不同溫度和不同時間下-葡萄糖醛酸苷酶酶活的變化，結(jié)果見圖5。噬菌體裂解基因SRRz酶嚴格受到溫度的調(diào)控，當(dāng)溫度低于37℃時，阻遏蛋白 cIts857抑制了pR的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)溫度高于37℃時，阻遏蛋白 cIts857開始失活，噬菌體裂解基因SRRz酶開始表達，在40℃誘導(dǎo)2 h后，以超聲破碎的菌株為對照，溶菌率達到99.64%。

圖3 不同啟動子重組菌的SDS-PAGE分析

lane M—protein marker; lane1—.; lane 2—pTac-GUS;lane 3—pHce-GUS; lane 4—pGap-GUS

圖4 不同啟動子重組PGUS-E的活力比較

圖5 不同溫度下的裂解效率

2.4 集培養(yǎng)、產(chǎn)酶、裂解和反應(yīng)于一體的突變酶的篩選

將建立的高通量篩選方法應(yīng)用于-葡萄糖醛酸苷酶的定向進化，通過對約10000個克隆單菌落進行大規(guī)模的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生的PGUS-E相比，約有14個突變體可能具有鍵選擇性改進的潛力（圖6）。其中C9、F72和M51突變體鍵選擇性明顯高于其他的突變體，分別為25%、37%和41%。將3株鍵選擇性提高的目標菌株送上海生工測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上，C9發(fā)生V257I和E261K的突變，F(xiàn)72發(fā)生A47S、D60S和K587R的突變，M51發(fā)生E87A、T195S和R434H的突變。

2.5 鍵選擇性提高的突變體酶的結(jié)構(gòu)分析

進一步分析氨基酸突變對PGUS-E結(jié)構(gòu)和功能的影響。PGUS-E結(jié)構(gòu)由3個結(jié)構(gòu)域組成，分別是N端1～180 位氨基酸組成的糖基結(jié)合域（sugar- binding domain），C 端 275～593 位氨基酸組成的(/)8桶狀結(jié)構(gòu)域（TIM-barrel domain）以及在兩者之間的181～274位氨基酸組成的免疫球蛋白狀-三明治結(jié)構(gòu)域（immunoglobulin-like-sandwich domain）。利用PyMOL軟件分析結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，突變位點R434H和 K587R均位于TIM-barrel domain的-螺旋上，分析Arg434和Lys587與周圍氨基酸的相互作用發(fā)現(xiàn)（圖7），Arg434與周圍的Asp462、Leu460、Pro430和Lys431存在6個氫鍵的相互作用，Lys587與周圍His583、Leu584和Asn591也存在復(fù)雜的氫鍵的相互作用，同時Lys587與相鄰亞基的Lys587也有相互作用力，推測螺旋的突變影響相鄰氨基酸的空間結(jié)構(gòu)，從而影響TIM- barrel的空間結(jié)構(gòu)，造成-葡萄糖醛酸苷酶的鍵選擇性顯著 提高。

圖6 β-葡萄糖醛酸苷酶不同突變體的底物特異性

Fig 6 Comparison of substrate specificity of-glucuronidase mutants

圖7 β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）突變位點分析

3 結(jié) 論

為了簡化-葡萄糖醛酸苷酶轉(zhuǎn)化甘草酸的鍵選擇性的篩選步驟，提高篩選效率，降低篩選成本，建立了一種利用組成型表達-葡萄糖醛酸苷酶，溫度誘導(dǎo)表達噬菌體裂解酶SRRz裂解細胞，集培養(yǎng)、產(chǎn)酶、裂解和反應(yīng)于一體的一鍋法（one-pot）甘草酸鍵選擇性篩選體系（CELS），并將其成功應(yīng)用于-葡萄糖醛酸苷酶的定向進化的篩選。

（1）成功構(gòu)建了溫度誘導(dǎo)表達噬菌體裂解酶SRRz，不同啟動子強度調(diào)節(jié)的組成型表達-葡萄糖醛酸苷酶載體pHce-GUS、pTac-GUS和pGap-GUS。其中，-葡萄糖醛酸苷酶的表達受組成型啟動子的強度影響，pHce-GUS載體表達的酶活最高，酶活力為17.2 U·ml-1。對噬菌體裂解酶SRRz酶的溶解能力進行了考察，溫控啟動子cIts857/pR的起始誘導(dǎo)溫度為37℃，40℃以上2 h內(nèi)溶菌率達到99.64%，具有良好的酶釋放效果。

（2）將建立的高通量篩選方法應(yīng)用于-葡萄糖醛酸苷酶的定向進化，獲得了一系列鍵選擇性顯著提高的突變酶，對甘草酸鍵選擇性提高到41%。突變位點結(jié)構(gòu)分析表明PGUS-E TIM 桶狀結(jié)構(gòu)域中螺旋結(jié)構(gòu)的變化對鍵選擇性的改善有很大的影響。

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Construction and application of expression system for high-throughput screening of-glucuronidase with high bond selectivity

Lü Bo, FENG Xudong, LI Chun

Department of Biological EngineeringSchool of Life ScienceBeijing Institute of TechnologyBeijingChina

To improve the bond selectivity of-glucuronidase towards glycyrrhetic acid 3--mono--D-glucuronide (GAMG), a one-pot selecting system (CELS) was established for the high-throughput screening. The system is consisted of the constitutive expression of fungal-glucuronidase and the bacteriophage lyase SRRz under the temperature-induced promoter in.. Then, the expression efficiency of PGUS-E with promoters of different strengths as well as the effect of the expression of bacteriophage lyase SRRz on lysis were investigated. In addition, a directed evolution based on the established screening system (CELS)was introduced to improve the bond selectivity of PGUS-E. The results indicated that CELS effectively integrated the strain culture, protein expression, cell lysis and the reaction. And a series of positive mutants with improved bond selectivity towards GAMG were obtained. It is concluded that the changes inhelix structure of TIM barrel domain have a strong influence on the improvement of the bond selectivity.

-glucuronidase; biocatalysis; molecular biology; optimal design; bond selectivity

2015-06-01.

Prof.LIChun, lichun@bit.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20150788

Q 816

A

0438—1157（2015）08—3189—06

李春。

呂波（1985—），男，博士研究生。

國家自然科學(xué)基金項目（21376028， 21176028，21425624）。

2015-06-01收到初稿，2015-06-08收到修改稿。

supported by the National Natural Science Foundation of China (21376028, 21176028, 21425624).