許本善 雷 寧 馬 萍 陳靖婕 吳 誠(chéng) 童衛(wèi)杭

解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088

復(fù)方痔瘡栓的定性鑒別與定量分析方法研究

許本善 雷 寧 馬 萍 陳靖婕 吳 誠(chéng) 童衛(wèi)杭

解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088

目的完善復(fù)方痔瘡栓的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，保障制劑質(zhì)量。 方法采用薄層色譜法對(duì)復(fù)方痔瘡栓制劑中的黃連、三七、冰片、血竭進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法對(duì)制劑中的鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定。色譜條件：色譜柱為WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH至3.0）（30∶70），流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。 結(jié)果薄層色譜法斑點(diǎn)清晰，分離度良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；鹽酸小檗堿線性范圍為2.7148～173.7468 μg/mL（r=0.9999，n=6），平均加樣回收率為102.43%，RSD= 0.34%（n=6）。 結(jié)論該方法簡(jiǎn)便易行，適用于醫(yī)院制劑復(fù)方痔瘡栓的定性鑒別與定量測(cè)定。

復(fù)方痔瘡栓；鹽酸小檗堿；薄層色譜法；高效液相色譜法；定性鑒別；定量分析

復(fù)方痔瘡栓系解放軍第二炮兵總醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）特色制劑[總制字（2011）F07005]，具有活血化瘀、收斂、消炎止痛作用，用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期內(nèi)痔手術(shù)后、直腸炎、肛竇炎等。該制劑是將黃連、三七粉、冰片、血竭、龍骨、兒茶、煅赤石脂、醋乳香、醋沒(méi)藥共9味藥材細(xì)粉，與熱熔的混合脂肪酸甘油酯混勻至近凝后，注入模具冷卻制得，該制劑來(lái)源于我院多年臨床經(jīng)驗(yàn)，療效確切。該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂于20世紀(jì)90年代，未對(duì)其中主要藥味及其活性成分進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。為了更好地控制制劑質(zhì)量，本研究?jī)?yōu)化了制劑中黃連、三七、冰片的薄層鑒別方法，并增加了血竭的薄層鑒別方法，同時(shí)考察并建立了制劑中鹽酸小檗堿的高效液相色譜法含量測(cè)定方法。本研究結(jié)果表明，所建立的定性鑒別和定量測(cè)定方法具有較好的靈敏度和重現(xiàn)性，且操作簡(jiǎn)便，能夠?yàn)獒t(yī)院制劑復(fù)方痔瘡栓的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供研究依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)（LC-20A型，日本Shimadzu公司，包括DGU-20A3脫氣機(jī)、LC-20AT二元泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10A柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、SPD-20A紫外檢測(cè)器以及LCSoLution色譜工作站）；電子天平（JM-B20002型，浙江省余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；十萬(wàn)分之一分析天平（CP225D型，德國(guó)Sartorius公司）；電熱恒溫水浴鍋（HWS28型，上海一恒科技有限公司）；超聲波發(fā)生器（KQ-500V型，蘇州昆山超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A型，上海一恒科技有限公司）；紫外分光光度儀（ZF-I型，上海顧村電光儀器廠）；薄層色譜掃描成像系統(tǒng)（Reprostar 3型，瑞士CAMAG公司）；超純水系統(tǒng) （Synergy UV型，美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

復(fù)方痔瘡栓（批號(hào)：20120320、20141024、201503-183，我院藥學(xué)部）；黃連、三七、血竭對(duì)照藥材（批號(hào)分別為120913-201310、120941-201108、120906-200609，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鹽酸巴馬?。兌龋?6.2%，批號(hào)：110732-201108）、鹽酸小檗堿（純度：86.7%，批號(hào)：110713-201212）、冰片（鑒別，批號(hào)：743-8902）、三七皂苷R1（純度：94.0%，批號(hào)：0754-200008）、人參皂苷Rg1（純度：95.0%，批號(hào)：0703-200117）、人參皂苷Re（純度：92.7%，批號(hào)：0754-9913）、人參皂苷Rb1（純度：93.7%，批號(hào)：110704-200420）、血竭素高氯酸鹽（純度：99.2%，批號(hào)：0811-9302）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；表小檗堿（純度：98.02%，批號(hào)：130413）、黃連堿（純度：98.55%，批號(hào)：130809）對(duì)照品均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、乙醇、正丁醇、香草醛、冰醋酸、鹽酸、硫酸、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、甲苯、石油醚（60～90℃）、二氯甲烷均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 黃連

取本品1粒，切碎，加甲醇25 mL，密塞，水浴（60℃）30 min，冷卻，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取黃連對(duì)照藥材0.05 g，加甲醇25 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述6種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-甲醇-冰醋酸-水（14∶7∶2∶1）為展開(kāi)劑[1-2]，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法分離效果好，斑點(diǎn)清晰，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃連的薄層色譜圖（紫外光365 nm）

2.1.2 三七

取本品15粒，加二氯甲烷50 mL，溶解，濾過(guò)，棄去濾液，殘?jiān)鼡]干溶劑，加適量水浸潤(rùn)并攪勻，再加水飽和正丁醇20 mL，超聲提取30 min，濾過(guò)，殘?jiān)俪曁崛?次，合并3次濾液并蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取三七對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取三七皂苷R1對(duì)照品，人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10，下層）為展開(kāi)劑[3-4]，展開(kāi)，晾干溶劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置紫外燈（365 nm）和日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)或斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法分離效果好，斑點(diǎn)清晰，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖2～3。

圖2 三七的薄層色譜圖（紫外光365 nm）

圖3 三七的薄層色譜圖（日光）

2.1.3 冰片

取本品1粒，切碎，加石油醚（60～90℃）5 mL，浸泡10 min濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取冰片對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.02 g的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲苯（3∶17）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[5]。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法分離效果好，斑點(diǎn)清晰，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 冰片的薄層色譜圖（日光）

2.1.4 血竭

取本品1粒，切碎，加二氯甲烷5 mL，溶解，濾過(guò)，作為供試品溶液。另取血竭對(duì)照藥材0.05 g，加二氯甲烷5 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.26 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（19∶1）為展開(kāi)劑[3-6]，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法分離效果好，斑點(diǎn)清晰，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 血竭的薄層色譜圖（紫外光365 nm）

2.2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH至3.0）（30∶70）[7-8]；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品10.02 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液定容至刻度，作為鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液，濃度為173.75 μg/mL。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品切碎，混勻，再取約1.0 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液95 mL，60℃水浴15 min，超聲處理（功率 500 W，頻率 40 kHz，溫度60℃）30 min，放冷，加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液至刻度，搖勻，冰箱（4℃）冷藏4 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量比例及制備工藝，取缺黃連的其他藥材制備陰性樣品。精密稱取陰性樣品，按照“2.2.2.2”項(xiàng)下的方法制備陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取上述溶液和甲醇-鹽酸 （100∶1）溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，復(fù)方痔瘡栓樣品中其他成分對(duì)鹽酸小檗堿的測(cè)定無(wú)干擾。

圖6 各溶液的高效液相色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2.1”項(xiàng)下的鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液5 mL，置10 mL量瓶，加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液定容至刻度，搖勻，再?gòu)闹芯芰咳? mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇-鹽酸（100∶1）的溶液定容至刻度，搖勻。依此法梯度稀釋，依次得到濃度為2.7148、5.4296、10.8592、21.7184、43.4367、86.8734、173.7468 μg/mL的鹽酸小檗堿系列對(duì)照品溶液。將系列對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值（Y）對(duì)濃度（X，μg/mL）進(jìn)行回歸，得鹽酸小檗堿的回歸方程為：Y=43758X-14744（r=0.9999），鹽酸小檗堿的濃度在2.7148～173.75 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品13.20 mg，加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液定容至50 mL，得鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液，濃度為228.888 μg/mL。按“2.2.4”項(xiàng)下的方法配制濃度為114.444 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，取該溶液，按上述色譜條件分別重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定，并記錄鹽酸小檗堿的峰面積積分值，計(jì)算其RSD=0.57%，結(jié)果表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20141024），按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積積分值，計(jì)算其RSD=1.66%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20141024），按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定含量。結(jié)果顯示，樣品中鹽酸小檗堿的平均含量為2.6603 mg/g，RSD=1.52%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：201503183）約0.5 g，共6份，分別置100 mL量瓶中，再分別精密加入鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液（0.1673 mg/mL）各5 mL，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備即得。精密吸取上述供試液10 μL注入色譜儀，測(cè)定含量，結(jié)果平均回收率為102.43%，RSD=0.34%（n=6）。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 含量測(cè)定

取不同批次復(fù)方痔瘡栓，分別按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法處理制劑樣品并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每批制劑樣品中鹽酸小檗堿的含量。見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 展開(kāi)劑的選擇

該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中黃連的薄層鑒別采用了“苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）”為展開(kāi)體系，試劑苯因毒性較大已經(jīng)在《中國(guó)藥典》中被禁止使用；本研究根據(jù)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)篩選，優(yōu)化展開(kāi)系統(tǒng)為“正丁醇-甲醇-冰醋酸-水（14∶7∶2∶1）”[9-12]，能夠?qū)?lái)自黃連的四種生物堿類成分同板鑒別，且陰性無(wú)干擾。

3.2 提取方法的選擇

本研究在供試品溶液制備中選擇了甲醇-鹽酸（100∶1）作為提取溶劑，并先后考察了溶劑用量和提取時(shí)間，結(jié)果表明1.0 g制劑以100 mL溶劑60℃水浴15 min，超聲處理30 min，鹽酸小檗堿的提取效率最高；同時(shí)，由于栓劑基質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響，實(shí)驗(yàn)中還考察了栓劑基質(zhì)的分離方法，結(jié)果表明將樣品提取液采用“4℃冷藏4 h”的處理過(guò)程能夠最大限度地使栓劑基質(zhì)混合脂肪酸甘油脂與待測(cè)成分分離，從而減少其對(duì)于測(cè)定結(jié)果的影響以及對(duì)色譜柱的污染。

3.3 流動(dòng)相的選擇

研究曾選用乙腈-0.2%磷酸（每1 L加三乙胺1 mL）[13-15]作為流動(dòng)相，結(jié)果目標(biāo)峰與雜質(zhì)分離度不佳；改用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH=3.0）[7-8]后待測(cè)成分與雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)了基線分離，并獲得了較好的峰形和較高的理論塔板數(shù)。

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Study on the methods of qualitative identification and quantitative analysis of Compound Zhichuang Suppository

XU Benshan LEI Ning MA Ping CHEN Jingjie WU Cheng TONG Weihang
Department of Pharmacy,the Second Artillery General Hospital of Chinese People's Liberation Army,Beijing 100088, China

Objective To improve the quality standard of Compound Zhichuang Suppository,so as to ensure the quality of preparations.Methods Rhizoma Coptidis,Radiχ Notoginseng,Borneolum Syntheticum and Sanguis Draconis of Compound Zhichuang Suppository were identified by thin layer chromatography.The high performance liquid chromatography method was used to determine the content of berberine hydrochloride.Chromatographic condition:the chromatographic column was WondaSil C18-WR(4.6 mm×250 mm,5 μm),the mobile phase was acetonitrile-0.05 mol/L NaH2PO4solution(pH was adjusted to 3.0 by phosphoric acid)(30∶70).The flow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was at 40℃and the detection wavelength was 345 nm.Results The thin layer chromatography had clear spots and it was well-separated without negative interference.The good linear correlation existed within the range of 2.7148-173.7468 μg/mL for berberine hydrochloride(r=0.9999,n=6)and the average recovery was 102.43%,with RSD of 0.34%(n=6).Conclusion The method is simple and accurate,which can be used for qualitative identification and quantitative analysis of Compound Zhichuang Suppository.

Compound Zhichuang Suppository;Berberine hydrochloride;Thin layer chromatography;High performance liquid chromatography;Qualitative identification;Quantitative analysis

R284.1

A

1673-7210（2015）11（c）-0008-05

2015-07-21本文編輯：張瑜杰）

全軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題面上項(xiàng)目（13ZJZ19-2）。

雷寧（1978-），女，博士，副主任藥師；研究方向：天然藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。