張海敏，楊文嘉，王慶亞，孫建云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京210095)

不同耐鉻性青菜中Cr6+的亞細(xì)胞分布及其耐性機(jī)理

張海敏，楊文嘉，王慶亞，孫建云*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京210095)

摘要:為探明青菜對(duì)Cr6+的吸收及其耐性機(jī)理，選取2個(gè)不同耐鉻(Cr)性青菜品種‘美加華’(Cr耐性品種)和‘三月慢’(Cr敏感品種)進(jìn)行水培試驗(yàn)，比較0、10、50和100 μmol·L-1Cr6+處理下青菜地上部和根系Cr含量、Cr的亞細(xì)胞分布、非蛋白巰基(NPT)、植物螯合肽(PCs)和抗氧化酶活性的差異。結(jié)果表明：(1)2個(gè)青菜品種地上部Cr含量顯著小于根系的含量，且‘美加華’根系Cr含量、Cr的根系滯留率、地上部和根系細(xì)胞壁中Cr含量與總Cr含量的比值均顯著大于‘三月慢’，而其可溶性Cr含量與總Cr含量的比值顯著小于‘三月慢’。(2)Cr6+處理顯著增加了青菜地上部NPT和PCs的含量，且‘美加華’增加的幅度顯著高于‘三月慢’。(3)低濃度的Cr6+(10 μmol·L-1)能夠提高青菜SOD、POD和CAT的活性，且‘美加華’的增幅大于‘三月慢’；而高濃度的Cr6+(100 μmol·L-1)顯著降低了SOD、POD和CAT的活性，且‘美加華’的降幅小于‘三月慢’。研究認(rèn)為，在Cr6+脅迫條件下，與青菜品種‘三月慢’相比品種‘美加華’能將更多的Cr分布于根和細(xì)胞壁中，減少了跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Cr，并且具有較高的抗氧化酶活性和PCs含量，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐Cr6+性。

關(guān)鍵詞:青菜; Cr6+; 亞細(xì)胞分布; 非蛋白巰基; 抗氧化酶

隨著電鍍、印染、石油化工、油漆和涂料等工業(yè)的迅速發(fā)展，導(dǎo)致含有大量重金屬鉻(Cr)的廢水、廢渣排出，致使空氣、土壤、水體和生物遭到不同程度的Cr污染[1]。Cr在自然條件下有多種價(jià)態(tài)，其中Cr3+和Cr6+最為穩(wěn)定和最為常見。Cr6+毒性比Cr3+高100倍，是一種很強(qiáng)的致畸、致突變劑，因此它被國(guó)際公認(rèn)為3種致癌金屬物之一[2]。在自然環(huán)境中，Cr6+常以Cr2O72-和CrO42-形式存在。過量Cr能降低植物對(duì)水和營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，抑制植株生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株死亡，并且Cr可以通過食物鏈危害人類健康[3-4]。青菜(Brassica chinensisL.)又稱小白菜，是中國(guó)大眾化的蔬菜之一，在蔬菜周年供應(yīng)中占有重要地位。因此，研究青菜對(duì)Cr的吸收以及耐性機(jī)制具有重要意義。

Cr進(jìn)入植物體內(nèi)后，主要富集在植物根部，被限制運(yùn)輸?shù)街参锴o葉，但是植物對(duì)Cr的吸收和積累在物種和品種上存在顯著差異[5]。植物對(duì)Cr的束縛力決定于細(xì)胞壁對(duì)Cr的固定和液泡對(duì)Cr的鈍化[6]。細(xì)胞壁是重金屬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的第一道屏障，重金屬穿過細(xì)胞壁時(shí)，與細(xì)胞壁上的纖維素、半纖維素和果膠等大分子物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而被固定下來(lái)[7]。當(dāng)重金屬在植物細(xì)胞壁上達(dá)到飽和后，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重金屬能與大量的有機(jī)配位體(螯合物、蛋白質(zhì)等)結(jié)合形成穩(wěn)點(diǎn)的螯合物，并被運(yùn)送至液泡中儲(chǔ)藏，降低細(xì)胞內(nèi)的自由重金屬離子的濃度，從而降低其毒性[8]。這些金屬絡(luò)合體主要包括有機(jī)酸、氨基酸及其衍生物、金屬硫蛋白(MTs) 和植物螯合肽(PCs)等[9]。不同植物種類或品種對(duì)重金屬的耐性有很大差異，其對(duì)重金屬的耐性機(jī)制也有所不同。目前，Cr在其它植物中的吸收及其耐性機(jī)理研究較多，而關(guān)于青菜對(duì)Cr的吸收以及耐性機(jī)理的報(bào)道并不多見。本研究以耐Cr性不同的2個(gè)青菜品種為試材，研究Cr在青菜體內(nèi)的亞細(xì)胞分布和Cr6+對(duì)非蛋白巰基含量、抗氧化酶活性的影響，旨在明確2個(gè)青菜品種對(duì)Cr的吸收及生理響應(yīng)的差異，探討植物耐Cr6+機(jī)理，為無(wú)公害蔬菜的選育及栽培提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

通過前期實(shí)驗(yàn)比較了Cr6+對(duì)41個(gè)青菜品種干物質(zhì)重抑制的差異，篩選出2個(gè)耐Cr6+性不同的青菜品種‘美加華’(Cr6+耐性品種)和‘三月慢’(Cr6+敏感品種)，并以這2個(gè)品種為試材。青菜種子均購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選大小一致的種子經(jīng)5%NaClO消毒5min，沖洗干凈后將種子均勻平鋪在干凈濕潤(rùn)的紗布上，放入光照培養(yǎng)箱避光萌發(fā)，晝夜溫度分別為24 ℃和20 ℃。露白后將種子轉(zhuǎn)入裝有黃沙的周轉(zhuǎn)箱中繼續(xù)生長(zhǎng)，10d后挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移植在含5L營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)缽中培養(yǎng)，每培養(yǎng)缽移苗20棵。培養(yǎng)液為Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。先用1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)3d，再用全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，保持通氣，每2d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，每天用HCl調(diào)節(jié)pH在5.1左右[10]。四葉一心時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行不同濃度鉻處理。Cr處理濃度 [以Cr6+計(jì)] 設(shè)置0、10、50、100μmol·L-1等4個(gè)水平，每個(gè)處理濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。Cr6+以重鉻酸鉀(K2Cr2O7)形式添加到營(yíng)養(yǎng)液中，自然光照。處理10d后收獲，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1生物量每處理分別取4株，將其根系置于10%EDTA-Na2的溶液中浸泡30min，取出，用自來(lái)水和去離子水徹底清洗，將地上部和根系分開，105 ℃殺青， 70 ℃烘箱中烘干至恒重，稱重。

1.3.2Cr含量將干樣磨成粉，再用硝酸和雙氧水(4∶1)消煮，采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定Cr含量。

1.3.3Cr的亞細(xì)胞分布準(zhǔn)確稱取冷凍鮮樣1g，加10mL提取液[0.25mol/L蔗糖+50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5)+lmmol/L赤鮮糖醇]，冰浴研磨至勻漿，然后用差速離心法[11]將樣品分為細(xì)胞壁(F1)、細(xì)胞器(F2)和細(xì)胞可溶部分(F3)，以硝酸和雙氧水(4∶1)消煮，采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定Cr含量。

1.3.4非蛋白巰基(NPT)含量取0.5g植物鮮樣，加5.0mL預(yù)冷的0.15%(W/V)抗壞血酸鈉溶液，冰浴研磨至勻漿，冰浴30min，然后離心(20 000×g，4℃)20min，取上清液為樣液。參照KumariBhoomika[12]方法測(cè)定非蛋白巰基(NPT)含量。

1.3.5谷胱甘肽(GSH)和植物螯合肽(PCs)含量取1g植物鮮樣，加5.0mL預(yù)冷的10% (W/V) 三氯乙酸，冰浴研磨至勻漿，然后離心(15 000×g，4 ℃) 15min，取上清液為待測(cè)樣液。參照HamidHassanpour[13]方法測(cè)定。

PCs含量=NPT含量-GSH含量[14]

1.3.6丙二醛含量丙二醛(MDA) 含量采用硫代巴比妥反應(yīng)法[15]測(cè)定。

1.3.7抗氧化酶活性稱取青菜鮮樣0.5g，加入5mL0.1mmol·L-1的磷酸緩沖液(pH7.0，內(nèi)含0.1mmol·L-1EDTA、1%PVP)，冰浴研磨至勻漿，然后離心(15 000×g，4 ℃)15min取得酶粗液，參照陳柳君[16]方法測(cè)定SOD、POD、CAT活性。

1.3.8Cr耐受性計(jì)算根系對(duì)重金屬的滯留率[17](Retentionrate，%)=(地下部分重金屬含量—地上部分重金屬含量)/地下部分重金屬含量×100%

轉(zhuǎn)移率(Translocationratio，%)=(地上部分Cr含量/根系Cr含量)×100%

1.4數(shù)據(jù)處理和作圖

采用SPSS13.0和Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性測(cè)驗(yàn)。采用Sigmaplot10.0 作圖。

2結(jié)果與分析

2.1Cr6+處理對(duì)青幼苗菜生物量的影響

由表1可見，Cr6+處理顯著降低了2個(gè)青菜品種幼苗地上部和根系的干物質(zhì)重，且隨著Cr6+處理濃度的增加，降低程度越來(lái)越明顯(P<0.05)。與對(duì)照相比，10～100μmol·L-1Cr6+處理下，地上部和根系各處理平均抑制率，‘美加華’分別為32.6% 和35.3%，‘三月慢’分別為 56.5%和52.5%，Cr6+脅迫對(duì)‘三月慢’生長(zhǎng)的抑制更為明顯，品種間差異顯著(P<0.05)。同時(shí)，從冠根比(地上部/根系)看，與對(duì)照相比，‘美加華’在100μmol·L-1Cr6+脅迫下顯著增加，表明Cr6+對(duì)‘美加華’根系的抑制程度超過地上部，而‘三月慢’則在50μmol·L-1Cr6+脅迫下顯著降低，表明‘三月慢’根系對(duì)Cr6+的耐性大于地上部。

2.2青菜幼苗對(duì)Cr6+的吸收和積累特征

由表2可見，2個(gè)青菜品種地上部和根系Cr含量均隨著Cr6+處理濃度的增加而顯著增加(P<0.05)。10～100μmol·L-1Cr6+處理下，地上部和根系中的Cr含量各處理平均值，‘美加華’分別為115.5和2 791.3mg·kg-1，‘三月慢’分別為145.2和2 261.0mg·kg-1，在相同濃度的Cr6+處理下，

表1　Cr6+處理對(duì)青菜生物量的影響

注：同列中不同字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；生物量以干重計(jì)。

Note:Differentlettersinthesamecolumnindicatesignificantdifferenceat0.05level;Thebiomassisdryweight.

表2　青菜Cr的含量、滯留率、累積量和轉(zhuǎn)移率

注：nd表示沒有檢測(cè)到。同列中不同字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；鉻含量以干重計(jì)。

Note:ndindicatesnotdetectable.Differentlettersinthesamecolumnindicatesignificantdifferenceat0.05level;TheCrcontentcalculatesbydryweight.

‘美加華’根系中的Cr含量均顯著高于‘三月慢’，而地上部中的Cr含量顯著低于‘三月慢’(10μmol·L-1除外；P<0.05)；2個(gè)青菜品種根系Cr含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地上部(P<0.01)，表明根系對(duì)Cr有較強(qiáng)的滯留作用。同時(shí)，2個(gè)青菜品種Cr的滯留率隨著Cr6+處理濃度的增加而顯著降低(P<0.05)。10～100μmol·L-1Cr6+處理下，‘美加華’和‘三月慢’滯留率各處理平均值分別為96.4%和94.6%，且在50 和100μmol·L-1Cr6+處理下，‘美加華’滯留率顯著高于‘三月慢’(P<0.05)。另外，2個(gè)青菜品種Cr的轉(zhuǎn)移率和地上部Cr累積量都隨著Cr6+處理濃度的增加而顯著增加(P<0.05)。10～100μmol·L-1Cr6+處理下，Cr的轉(zhuǎn)移率各處理平均值在‘美加華’和‘三月慢’中分別為43.5%和46.8%，且在50 和100μmol·L-1Cr6+處理下，‘美加華’Cr轉(zhuǎn)移率顯著小于‘三月慢’(P<0.05)，而兩品種Cr的累積量在相同濃度Cr6+處理下差異不顯著(P>0.05)；兩品種青菜根系Cr累積量也明顯高于地上部。以上結(jié)果說(shuō)明Cr被青菜吸收后，主要滯留在根系，且‘美加華’具有更強(qiáng)的阻遏Cr向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，從而更好的保護(hù)青菜不受或減輕Cr毒害。

2.3Cr在青菜亞細(xì)胞組分中的分布特征

由表3可見，青菜亞細(xì)胞的細(xì)胞壁(F1)、細(xì)胞器(F2)和細(xì)胞可溶性(F3)組分中Cr含量(總鉻含量)均隨Cr6+處理濃度的升高而顯著增加。在50和100μmol·L-1Cr6+處理下，‘美加華’地上部和根系細(xì)胞壁組分(F1)中的Cr含量分別是相同Cr6+處理濃度下‘三月慢’的1.56倍、1.44倍和1.48倍、1.44倍，而其細(xì)胞可溶性組分(F3)中的Cr含量分別是相同Cr6+處理濃度下‘三月慢’的0.37倍、0.83倍和0.36倍、0.82倍，品種間差異顯著(P<0.05)，細(xì)胞器組分(F2)中的Cr含量，‘美加華’地上部分別是相同Cr6+處理濃度下‘三月慢’的0.40倍和0.60倍，顯著低于‘三月慢’，而其根系則是相同Cr6+處理濃度下‘三月慢’的1.68倍和1.86倍，顯著高于‘三月慢’。Cr在青菜各亞細(xì)胞組分中分布的比例上，2個(gè)品種存在顯著的差異(P<0.05)。其中，地上部分布比例在‘美加華’表現(xiàn)為F1>F3>F2，而在‘三月慢’則是F3>F1>F2；在2個(gè)品種根系中分布比例情況相似，均是F1中最高，F(xiàn)2中最低。在相同的Cr6+處理濃度下，Cr在‘美加華’地上部和根系細(xì)胞壁組分(F1)中(50μmol·L-1濃度除外)的分配比例顯著高于‘三月慢’，而在可溶性組分(F3)中的分配比例顯著低于‘三月慢’(P<0.05)；Cr在細(xì)胞器中所占的比例，‘美加華’地上部顯著低于‘三月慢’，而其根系(100μmol·L-1Cr6+處理下)中顯著高于‘三月慢’(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明‘美加華’的細(xì)胞壁具有更強(qiáng)的積累Cr的能力，減少了進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Cr，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐Cr6+性。

2.4Cr6+處理對(duì)青菜非蛋白巰基含量的影響

如圖1所示，隨著Cr6+處理濃度的增加，2個(gè)青菜品種地上部非蛋白巰基含量均呈先增高后降低的趨勢(shì)，并在50μmol·L-1Cr6+處理下出現(xiàn)最大值，隨后下降，但仍顯著高于對(duì)照(P<0.05)；而它們根系中非蛋白巰基含量在Cr6+處理前后均沒有顯著變化(P>0.05)。與對(duì)照相比，10～100μmol·L-1Cr6+處理下，地上部非蛋白巰基含量增幅在‘美加華’中為51.7%～114.9%，平均為85.9%，而在‘三月慢’中增幅范圍為44.6%～97.8%，平均為66.4%，‘美加華’增幅顯著高于‘三月慢’，品種間差異顯著(P<0.05)。相同濃度Cr6+處理下，2品種根系中非蛋白巰基含量差異不顯著(P>0.05)。

同時(shí)，2個(gè)青菜品種地上部和根系中谷胱甘肽(GSH)的含量隨Cr6+處理濃度的增加而逐漸降低，且處理間的差異大多達(dá)到顯著水平(P<0.05)。與對(duì)照相比，10～100μmol·L-1Cr6+處理下，地上部和根系中GSH含量，‘美加華’降幅范圍為16.9%～46.7%和22.9%～63.8%，平均為28.2%和46.6%，‘三月慢’降幅范圍為34.4%～77.4%和37.1%～ 78.8%，平均為56.3%和59.4%，‘美加華’降幅顯著低于‘三月慢’，且品種間差異顯著(P<0.05)。

表3　Cr6+ 處理下2個(gè)青菜品種亞細(xì)胞組分中Cr含量及其分配比例

注：同列中同一植株部位不同字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。 鉻含量以鮮重計(jì)。F1為細(xì)胞壁組分；F2為細(xì)胞器組分；F3為細(xì)胞可溶性組分。

Note:Differentlettersofthesameplantsiteinthesamecolumnindicateasignificantdifferenceat0.05level.TheCrcontentcalculatesbyfreshweight.Cellswereseparatedintodifferentfractions:cellwall(F1),organelle(F2),solublefraction(F3)bygradientcentrifugationtechniqueat4 ℃.

另外，與對(duì)照相比，10～100μmol·L-1Cr6+處理顯著增加了2個(gè)青菜品種地上部和根系內(nèi)植物螯合肽(PCs)的含量，其增幅范圍分別為115.9%～267.2%和52.1%～100%。地上部的增幅顯著大于根系(P<0.05)。兩品種地上部中PCs的含量在50μmol·L-1Cr6+處理下達(dá)到最大值。50和100μmol·L-1Cr6+處理下，‘美加華’地上部PCs的含量分別比對(duì)照增加242.2%和219.9%，‘三月慢’分別增加267.1%和203.5%，‘美加華’的含量顯著高于相同Cr6+處理濃度下‘三月慢’的含量(P<0.05)；2個(gè)品種根系內(nèi)PCs的含量在相同濃度Cr6+處理下無(wú)顯著差異(P>0.05)。

綜合以上分析可知Cr6+誘導(dǎo)了青菜體內(nèi)PCs和NPT的合成，且‘美加華’地上部能合成更多含巰基物質(zhì)與Cr螯合，這也許是其具有較強(qiáng)解毒能力的原因之一。

2.5Cr6+處理對(duì)青菜MDA含量和抗氧化酶活性的影響

首先，隨著Cr6+處理濃度的增加，2個(gè)青菜品種地上部和根系MDA含量都呈上升趨勢(shì)(圖2)。兩品種地上部的MDA含量在低濃度(10μmol·L-1)Cr6+處理下與對(duì)照均無(wú)顯著差異，而在中、高濃度(50、100μmol·L-1)Cr6+處理下均比對(duì)照顯著增加，‘美加華’和‘三月慢’增幅范圍分別為12.1%～24.1%和21.9%～43.3%，‘美加華’的增幅顯著低于同處理濃度下‘三月慢’的增幅(P<0.05)。2品種根系中MDA含量在Cr6+處理下均比對(duì)照顯著增加，‘美加華’和‘三月慢’在10～100μmol·L-1Cr6+處理下的增幅范圍分別為6.3%～47.4%和11.9%～64.8%。在相同濃度Cr6+處理下，‘三月慢’植株內(nèi)(地上部和根系)MDA含量均顯著高于‘美加華’的含量(P<0.05)。

圖1　Cr6+處理對(duì)青菜地上部(A、C、E)和根系(B、D、F)中非蛋白巰基、谷胱甘肽和植物螯合肽含量的影響Fig. 1　Effects of Cr treatments on non-protein thiols, GSH and PCs contents in shoots (A,C,E) and roots (B,D,F) of B. chinensis

其次，與對(duì)照相比，隨著Cr6+處理濃度的增加，2個(gè)青菜品種地上部和根系SOD活性呈先增高后降低的趨勢(shì)，并在50μmol·L-1(地上部)和10μmol·L-1(根系)Cr6+處理下達(dá)到最大值，此時(shí)‘美加華’增幅分別是35.7%(地上部)和7.9%(根系)，‘三月慢’增幅分別是21.2%(地上部)和4.6%(根系)。隨后，2個(gè)青菜品種地上部和根系SOD活性均下降，但至100μmol·L-1Cr6+處理時(shí)，地上部的SOD活性仍顯著高于對(duì)照(‘美加華’增幅為28.0%，‘三月慢’增幅為9.0%)，而根系則顯著低于對(duì)照(‘美加華’降幅為8.8%，‘三月慢’降幅為67.8%)。在10～100μmol·L-1Cr6+脅迫處理下，‘美加華’地上部和根系(除10μmol·L-1Cr6+外)內(nèi)SOD活性均顯著高于相同濃度下‘三月慢’的活性(P<0.05)。

再次，與對(duì)照相比，2個(gè)青菜品種地上部和根系中POD活性隨著Cr6+處理濃度的增加均呈先增高后降低的趨勢(shì)，且‘三月慢’和‘美加華’地上部酶活性分別在10和50μmol·L-1Cr6+處理下達(dá)到最大值，而它們根系中酶活性均在10μmol·L-1Cr6+時(shí)達(dá)到最大值(‘三月慢’增幅為42.1%，‘美加華’增幅為56.4%)；隨后下降，但至100μmol·L-1Cr6+處理時(shí)，2個(gè)品種地上部和根系中酶活性仍顯著高于對(duì)照(‘美加華’地上部和根系增幅分別是33.3%和 33.9%，‘三月慢’相應(yīng)增幅則分別是13.2%和12.4%)。在10～100μmol·L-1Cr6+處理下，‘美加華’植株內(nèi)(地上部和根系)POD活性均顯著高于相同濃度下‘三月慢’的活性(P<0.05)。

另外，與對(duì)照相比，2個(gè)青菜品種地上部和根系中CAT活性均隨著Cr6+處理濃度的增加也呈先增高后降低的趨勢(shì)，并在50μmol·L-1(地上部)和10μmol·L-1(根系)Cr6+處理下出現(xiàn)最大值(‘美加華’地上部和根系增幅分別是27.4 %和138%，‘三月慢’相應(yīng)增幅分別是17.7%和87.4%)，隨后下降，至100μmol·L-1Cr6+時(shí)，‘三月慢’地上部和根系中酶活性已顯著低于對(duì)照，而‘美加華’地上部中CAT活性仍顯著高于對(duì)照。在10～100μmol·L-1Cr6+處理下，‘美加華’地上部和根系內(nèi)CAT活性均顯著高于相同濃度下‘三月慢’的活性(P<0.05)。

以上結(jié)果說(shuō)明‘美加華’植株在Cr6+脅迫條件下具有更強(qiáng)的清除ROS的能力，以降低Cr對(duì)植物造成的氧化脅迫，這也是其耐Cr6+較強(qiáng)的機(jī)理之一。

3結(jié)論與討論

Cr是植物生長(zhǎng)的非必需元素。進(jìn)入體內(nèi)的Cr6+對(duì)所有生物都有毒害[1]。Cr6+能夠抑制植物根系細(xì)胞的分裂，阻礙水分吸收，從而抑制根的生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致植株葉片泛黃，植物的光合作用、呼吸作用等各種生理代謝發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致生物量降低[4]。本研究表明，與對(duì)照相比，Cr6+處理顯著降低了青菜地上部和根系的生物量，表明Cr6+對(duì)青菜植株產(chǎn)生毒害作用；在相同濃度Cr6+處理下，‘美加華’地上部和根系生長(zhǎng)的受抑程度均顯著小于‘三月慢’，表明‘美加華’對(duì)Cr6+脅迫具有較強(qiáng)的抗性機(jī)制。

圖2　Cr6+ 處理對(duì)青菜地上部(A、C、E、D)和根系(B、D、F、H)中MDA的含量及SOD、POD和CAT活性的影響Fig. 2　Effects of Cr6+ treatments on the MDA content and the activities of SOD, POD and CAT in shoots (A,C,E,D) and roots (B,D,F,H) of B. chinensis

植物對(duì)各種重金屬的抗性機(jī)制不盡相同，但總體上看，一般通過兩條基本途徑實(shí)現(xiàn)：一是金屬外部排斥機(jī)制，即避免過量有毒重金屬被吸收進(jìn)入植物細(xì)胞，或者阻礙重金屬在植物體內(nèi)的運(yùn)輸；另一途徑是內(nèi)部耐受機(jī)制，即重金屬在植物體內(nèi)以不具生物活性的解毒形式存在，如結(jié)合到細(xì)胞壁上、主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入液泡、或與某些有機(jī)酸和蛋白質(zhì)結(jié)合等[4]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cr被青菜吸收后，主要滯留在根系，向地上部運(yùn)輸較少，屬于典型的外部排斥機(jī)制。與‘三月慢’相比，耐性品種‘美加華’根系對(duì)Cr的滯留率更高，表明其具有更強(qiáng)的阻遏Cr向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，從而較好地保護(hù)青菜不受或減輕Cr毒害。

除排斥機(jī)制外，植物細(xì)胞內(nèi)的耐受機(jī)制在植物抗重金屬脅迫中也起重要作用。其中將有毒離子區(qū)室化是細(xì)胞內(nèi)重要的解毒途徑之一，而細(xì)胞壁和液泡是區(qū)室化的兩個(gè)主要位點(diǎn)[11]。本實(shí)驗(yàn)中，在Cr亞細(xì)胞分布上，10～100μmol·L-1Cr6+處理青菜根系和地上部(‘三月慢’除外)細(xì)胞壁組分所占的比例平均在60%以上(表3)，表明細(xì)胞壁在青菜耐Cr6+毒中起重要作用。這與劉婷婷和Zhu等[18-19]研究結(jié)果一致。同時(shí)，耐性品種‘美加華’，無(wú)論根系和地上部，在相同的Cr6+處理濃度下，其細(xì)胞壁上的Cr含量均顯著高于敏感品種‘三月慢’，結(jié)果暗示了‘美加華’的細(xì)胞壁具有更強(qiáng)的積累Cr的能力，從而減少了進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Cr，這也許是其具有較強(qiáng)耐Cr6+毒害的原因之一。然而，在本實(shí)驗(yàn)青菜總Cr含量中，約有60%(‘三月慢’地上部)和30%(‘美加華’地上部和根系及‘三月慢’根系)的Cr通過細(xì)胞壁進(jìn)入原生質(zhì)內(nèi)(表3)。其中，約20%(‘美加華’地上部和根系及‘三月慢’根系)和40%的(‘三月慢’地上部)Cr分布在可溶態(tài)中?？扇軕B(tài)主要是指液泡[20]。植物通過將細(xì)胞質(zhì)中的Cr轉(zhuǎn)運(yùn)并儲(chǔ)藏在液泡中，降低Cr在細(xì)胞內(nèi)的離子活度，避免Cr對(duì)其它細(xì)胞器生理功能的干擾[21]。

進(jìn)入到原生質(zhì)內(nèi)的有毒金屬離子能被區(qū)室化在液泡中，細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)配體發(fā)揮了重要作用。這些有機(jī)配體包括氨基酸、有機(jī)酸和富含半胱氨酸的多肽，它們可與金屬離子螯合，然后將其轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡內(nèi)儲(chǔ)存。非蛋白巰基(NPT)富有半胱氨酸殘基(-SH)，其 -SH可與金屬離子螯合。植物螯合肽(phytochelatins,PCs)屬于NPT，其與重金屬絡(luò)合被廣泛認(rèn)為是植物細(xì)胞內(nèi)解除重金屬毒害的重要機(jī)制[22]。有研究表明，Cr6+增加了P.stratiotes 根中半胱氨酸(PCs的組成成分)的含量[23]。在本研究中，10～100μmol·L-1Cr6+濃度下，青菜地上部NPT含量和PCs含量均顯著高于對(duì)照組，且‘美加華’增加的幅度更大，表明Cr6+誘導(dǎo)了青菜體內(nèi)PCs和NPT的合成，且‘美加華’地上部能合成更多含巰基物質(zhì)與Cr螯合，這也許是其具有較強(qiáng)解毒能力的另一原因。GSH是PCs合成的底物，由PC合成酶催化產(chǎn)生[24]。受到重金屬脅迫后，GSH含量由于PCs的合成而下降在多種植物中都有報(bào)道[25]。本實(shí)驗(yàn)中，雖然我們觀察到2個(gè)青菜品種根系和葉片中GSH的含量由于PCs的合成而逐漸下降，但增加的PCs的含量遠(yuǎn)高于減少的GSH，說(shuō)明Cr6+能刺激新的GSH的合成。在Cr6+脅迫處理下，與對(duì)照相比，2個(gè)青菜品種GSH的含量均呈下降的趨勢(shì)，但‘三月慢’下降的幅度更為明顯，這可以部分解釋‘三月慢’和‘美加華’的耐Cr6+性差異。GSH除了可以螯合植物體內(nèi)的重金屬外，它也是一種很重要的低分子抗氧化劑，與SOD、POD和CAT等抗氧化酶一起構(gòu)成植物的抗氧化系統(tǒng)，防御活性氧的傷害，維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)[26]。

當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的金屬離子超過了細(xì)胞內(nèi)有機(jī)配體對(duì)其的螯合能力時(shí)，游離的金屬離子會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的氧化脅迫。Cr可以誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的活性氧自由基(ROS)，它們與核酸、脂膜、蛋白質(zhì)、氨基酸等發(fā)生反應(yīng)，引起不可逆的傷害及細(xì)胞死亡[27]。MDA是膜中不飽和脂肪酸分解的產(chǎn)物之一，被認(rèn)為是反映植物在逆境環(huán)境下細(xì)胞膜過氧化程度的重要指標(biāo)。SOD、CAT、POD是植物體內(nèi)清除活性氧重要的細(xì)胞保護(hù)酶類，其活性高低可以反映植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力[28]。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照相比，低濃度Cr6+(10μmol·L-1)處理下，青菜地上部分SOD、POD、CAT活性顯著增高，且MDA含量沒有顯著變化，說(shuō)明在此濃度下，青菜地上部產(chǎn)生的ROS能被抗氧化系統(tǒng)清除；隨著Cr處理濃度的進(jìn)一步提高，地上部抗氧化酶(除‘三月慢’CAT外)活性仍顯著高于對(duì)照，然而MDA含量亦顯著增加，說(shuō)明植物對(duì)Cr脅迫的抵御是有一定限度的，超過此限度植物就會(huì)受到傷害，這與Kale[29]和Adrees等[30]的研究結(jié)果相似；另外，在低濃度Cr6+(10μmol·L-1)處理下，青菜根系MDA含量顯著升高，說(shuō)明根系受到比地上部更大的氧化脅迫。在相同濃度的Cr處理(CK除外)下，耐性品種‘美加華’植株內(nèi)的MDA含量低于‘三月慢’，而SOD、POD、CAT活性顯著高于‘三月慢’，暗示了美加華具有更強(qiáng)的清除ROS的能力，以降低Cr對(duì)植物造成的氧化脅迫，這也是其耐Cr6+較強(qiáng)的機(jī)理之一。

綜上所述，在Cr6+脅迫下，青菜生長(zhǎng)受到顯著抑制；青菜首先能通過根系固定Cr，阻遏Cr向地上部的運(yùn)輸，以降低植株地上部Cr含量；其次能通過細(xì)胞壁結(jié)合Cr，以減少進(jìn)入原生質(zhì)體的Cr；再次也許通過PCs螯合Cr離子，并將其轉(zhuǎn)移到液泡內(nèi)，使其生物活性鈍化；另外，還通過增強(qiáng)植株體內(nèi)抗氧化酶活性，以降低活性氧等對(duì)質(zhì)膜的傷害，從而更好地維持細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性和完整性。與‘三月慢’相比，青菜品種‘美加華’具有更強(qiáng)的固定、螯合Cr和抗氧化的能力，這可能是其抗Cr6+性較強(qiáng)的重要原因。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

TheSub-cellularChromium(Cr6+)DistributionandToleranceMechanismtoChromiumStressinDifferentTolerantBrassica chinensisL.Cultivars

ZHANGHaimin,YANGWenjia,WANGQingya,SUNJianyun*

(CollegeofLifeScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

Abstract:In order to elucidate absorption, distribution and tolerance mechanisms of Brassica chinensis L. to chromium (Cr6+) stress, we grew two Brassica cultivars; ‘Meijiahua’(Cr6+-stress tolerant) and ‘Sanyueman’(Cr6+-stress sensitive) hydroponically in Hoagland 0, 10, 50 and 100 μmol·L-1Cr6+. The differencesin Cr absorbed contents and subcellular distribution, non-proteinthiol, phytochelatins(PCs) and antioxidant enzyme activities in shoots and roots were studied. The results were as follows: (1) the contents of Cr in shoots were significantly lower than those in the roots in both cultivars. The Cr root contents, Cr retention rate and the ratio of wall-bounded Cr to total Cr in shoots and roots of ‘Meijiahua’ were significantly higher than those in ‘Sanyueman’, but the ratio of water soluble Cr to total Cr was opposite. (2) Cr6+treatments at all concentrations significantly increased the concentrations of non-protein thiol and phytochelatins (PCs) in shoots of both cultivars, but the increment in ‘Meijiahua’ was significantly higher than that in ‘Sanyueman’. (3) Under low concentration of Cr6+(10 μmol·L-1)，the activities of SOD, POD and CAT were significantly increased, but the extent of increase was significantly higher in ‘Meijiahua’ than that in ‘Sanyueman’. The activities of SOD, POD and CAT were significantly downregulated under high concentration of Cr6+(100 μmol·L-1), but the magnitude of downregulation in ‘Meijiahua’ was significantly lower than that in ‘Sanyueman’. These results indicated that under Cr6+stress, as compared to ‘Sanyueman’, more Cr was distributed in cell walls in shoot and root in ‘Meijiahua’ to inhibit the transmembrane Cr to intracellular flow. Moreover, it has higher antioxidant enzyme activities and PCs content, so it showed a stronger tolerance to Cr6+.

Key words:Brassica chinensis L.; Cr6+; subcellular distribution; non-protein thiol; antioxidant enzyme.

文章編號(hào):1000-4025(2016)05-0954-10

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0954

收稿日期:2016-02-18;修改稿收到日期:2016-05-11

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31471443)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140705)

作者簡(jiǎn)介:張海敏(1989-)，男，碩士，主要從事植物生理研究。E-mail：zhanghaimin0514@163.com *通信作者:孫建云，副教授，主要研究方向?yàn)橹参飳?duì)有毒元素的吸收、缺乏或過量的適應(yīng)性反應(yīng)機(jī)理及其耐性機(jī)理。E-mail：sunjianyun@njau.edu.cn

中圖分類號(hào):Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A