胡彬 倪娜娜 呂雅琳 陳浩 劉毅 孫建方

Cbl-b基因shRNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定

胡彬 倪娜娜 呂雅琳 陳浩 劉毅 孫建方

目的 構(gòu)建小鼠Cbl-b基因RNA干擾（RNAi）的真核表達(dá)質(zhì)粒，并初步鑒定其干擾效果，為后續(xù)研究Cbl-b在黑素瘤免疫治療中的作用奠定基礎(chǔ)。方法 根據(jù)基因庫提供的Cbl-b cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成4對(duì)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)DNA序列，克隆至載體PGPU6/GFP/Neo構(gòu)建重組質(zhì)粒，并予以DNA測(cè)序鑒定。重組干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功后，將干擾質(zhì)粒與Cbl-b過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48 h，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各質(zhì)粒對(duì)Cbl-b基因的表達(dá)抑制效應(yīng)。結(jié)果 測(cè)序分析證實(shí)，4對(duì)shRNA寡核苷酸序列分別成功插入至shRNA真核表達(dá)載體PGPU6/GFP/Neo中，將構(gòu)建成功的PGPU6/GFP/Neo-shRNA質(zhì)粒與Cbl-b真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR法及Western印跡測(cè)定，發(fā)現(xiàn)4條shRNA序列對(duì)Cbl-b的表達(dá)均有一定的抑制效應(yīng)，其中以1號(hào)shRNA序列重組質(zhì)粒對(duì)Cbl-b表達(dá)的抑制程度最高（P＜0.05）。結(jié)論 成功構(gòu)建并篩選出沉默效應(yīng)最高的Cbl-b shRNA真核細(xì)胞表達(dá)載體。

泛素蛋白連接酶類；RNA，小分子干擾；黑色素瘤；基因，Cbl-b

Cbl-b屬于泛素連接酶E3家族中的成員，近年的研究發(fā)現(xiàn)，其直接參與了T細(xì)胞的活化及免疫耐受過程，是體內(nèi)介導(dǎo)T細(xì)胞免疫無能的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子之一［1-2］。我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，參照Cbl-b CDS區(qū)序列，設(shè)計(jì)了4條siRNA候選序列，并據(jù)此設(shè)計(jì)了其相應(yīng)的發(fā)夾狀shRNA序列，構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體，然后通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)Cbl-b沉默效率最高的shRNA表達(dá)載體。

一、試劑與材料

1.試劑：載體pGPU6/GFP/Neo（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；pdsRed1-N1-cb1b過表達(dá)質(zhì)粒由本室構(gòu)建；DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物公司）；293T細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞所）；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國 Gibco公司）；脂質(zhì)體 LipofbctamineTM2000、Trizol Reagent（美國Invitrogen公司）；SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）；Cbl-b的單克隆抗體（sc-8006）（美國Santa Cruz公司）；HRP標(biāo)記的IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；PCR引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；其余為國產(chǎn)分析純。

2.實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；低溫離心機(jī)、醫(yī)用超低溫冷凍箱、酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；凝膠成像及分析裝置，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀，聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽，微型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；超純水儀（美國Millipore公司）。

二、方法

1.Cbl-b基因shRNA表達(dá)模板序列設(shè)計(jì)及合成：針對(duì)Cbl-b的CDS區(qū)設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)不同靶位點(diǎn)的siRNA序列，并根據(jù)siRNA序列設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的shRNA序列。在shRNA中的循環(huán)結(jié)構(gòu)選擇TTCAAGAGA，避免終止信號(hào)的形成，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)選用T6結(jié)構(gòu)。shRNA正向鏈的5′添加CACC序列，與Bbs I酶切后形成的粘末端互補(bǔ)；反向鏈的5′添加了GATC，與BamH I酶切后形成的粘末端互補(bǔ)。如果siRNA的第1個(gè)堿基不是G，則在CACC序列后補(bǔ)加1個(gè)G。另設(shè)計(jì)隨機(jī)序列作為陰性對(duì)照，并經(jīng)BLAST比較沒有發(fā)現(xiàn)同源序列，命名為NC。

2.shRNA載體的構(gòu)建及鑒定：分別取2μl上述合成的DNA正義和反義鏈表達(dá)模板，加入16μl退火緩沖液，94℃水浴5min，自然冷卻至室溫，使互補(bǔ)的正、反向鏈模板結(jié)合形成雙鏈。將退火后形成雙鏈的寡核苷酸鏈與經(jīng)BamH I和Bbs I雙酶切后的載體pGPU6/GFP/Neo用T4 DNA連接酶連接過夜。以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，在氨芐西林抗性平板上篩選陽性克隆，并對(duì)挑選的克隆經(jīng)質(zhì)粒小提后行酶切電泳并送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

3.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用完全培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，1.5×106細(xì)胞/孔接種6孔板；混勻后于37℃、5%CO2培養(yǎng) 24 h。將 0.8μg干擾表達(dá)載體質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA1，pGPU6/GFP/Neo-shRNA2，pGPU6/GFP/Neo-shRNA3，pGPU6/GFP/Neo-shRNA4及陰性對(duì)照載體質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-NC分別與0.8μg Cbl-b過表達(dá)載體pdsRed1-N1-Cbl-b混勻后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染程序按lipofectamin2000操作說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)立過表達(dá)組、過表達(dá)陰性對(duì)照組（過表達(dá)載體及陰性對(duì)照載體共轉(zhuǎn)染）、空載對(duì)照組、陰性對(duì)照組（只轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組）。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)mRNA水平變化：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞加入Trizol液提取細(xì)胞總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。然后以各組cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線得到各實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)和內(nèi)參基因的閾值循環(huán)數(shù)（Ct值），采用△△Ct的方法進(jìn)行相對(duì)定量。擴(kuò)增Cbl-b基因所用上游引物為5′-GTGACTGGGGACGGCAATATCCTAC-3′；下游引物 5′-TAAA GATAAAAGCCTTCCCT GCTAC-3′。β肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增上游引物為5′-CCCTGGCACCCAGCA C-3′。下游：5′-GCCGAT CCACACGGAGTAC-3′。擴(kuò)增條件：95℃2min；95 ℃ 10 s；62 ℃ 40 s；40個(gè)循環(huán)后行熔解曲線分析。

5.蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Cbl-b蛋白表達(dá)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)胰酶消化，4℃離心5min，收集各組細(xì)胞，并用預(yù)冷PBS洗3次。根據(jù)細(xì)胞蛋白提取試劑盒操作步驟提取各組細(xì)胞蛋白。上樣前蛋白樣品與等量2×加樣緩沖液混勻，煮沸5min，上樣到10%SDS-PAGE中，每孔按20μl上樣。電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用加樣緩沖液封閉轉(zhuǎn)印膜2 h，加入適當(dāng)稀釋的Cbl-b一抗，4℃孵育過夜，次日TBST漂洗3次后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯色。用Cbl-b與內(nèi)參灰度比值表示Cbl-b蛋白的相對(duì)表達(dá)量，使用Gel-Pro Analyzer軟件分析處理。

三、結(jié)果

1.Cbl-b-shRNA序列的設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)小鼠Cbl-b基因的編碼序列設(shè)計(jì)的4對(duì)siRNA序列，經(jīng)BLAST分析小鼠基因庫中同源序列，未發(fā)現(xiàn)包含該序列的其他基因，說明4個(gè)靶點(diǎn)特異性較好。然后結(jié)合shRNA載體的結(jié)構(gòu)及shRNA設(shè)計(jì)原則，由siRNA序列設(shè)計(jì)并合成了相應(yīng)shRNA序列（表1）。同時(shí)設(shè)計(jì)相應(yīng)的陰性對(duì)照序列。

表1 針對(duì)小鼠Cbl-b基因設(shè)計(jì)的4對(duì)shRNA寡核苷酸序列

2.重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果：由4對(duì)shRNA序列構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定構(gòu)建成功，插入的序列和目標(biāo)序列完全一致，沒有插入、缺失、突變等異常（圖1）。

3.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果：pdsRed1-N1-Cbl-b轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Cbl-b的表達(dá)水平明顯升高（Cbl-b過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組，Cbl-b載體與陰性對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組），而pdsRed1-N1-Cbl-b與各干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，Cbl-b mRNA的水平則明顯下降（Cbl-b過表達(dá)載體+pGPU6/GFP/NeoshRNA1，Cbl-b 過表達(dá)載體 +pGPU6/GFP/Neo-shRNA2，Cblb過表達(dá)載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA3，Cbl-b過表達(dá)載體 +pGPU6/GFP/Neo-shRNA4），其中以shRNA-1載體對(duì)Cbl-b基因mRNA的沉默效率最高（圖2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P＜0.05）。

4.蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果：結(jié)果顯示（圖3），pdsRed1-N1-Cbl-b轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞高表達(dá)Cbl-b蛋白，而共轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組Cbl-b蛋白的表達(dá)水平則明顯減低，其中shRNA-1載體對(duì)Cbl-b蛋白的沉默為最高，其蛋白表達(dá)水平經(jīng)灰度分析下調(diào)了 88%（n=3，P<0.05）。

圖1 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果 插入的序列和目標(biāo)序列完全一致，沒有插入、缺失、突變等異常

圖2 各組Cbl-b基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) C：Cbl-b過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組；C+N：Cbl-b載體與陰性對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組；B：空白細(xì)胞組；N：陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；K：Cbl-b載體對(duì)應(yīng)空載組；1：Cbl-b過表達(dá)載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA1；2：Cbl-b過表達(dá)載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA2；3：Cbl-b過表達(dá)載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA3；4：Cbl-b過表達(dá)載體 +pGPU6/GFP/Neo-shRNA4

圖3 蛋白印跡檢測(cè)各組Cbl-b基因蛋白水平的表達(dá) 1：Cbl-b過表達(dá)載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1組；2：Cbl-b過表達(dá)載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA-2組；3：Cbl-b過表達(dá)載體+pGPU6/FP/Neo-shRNA-3組；4：Cbl-b過表達(dá)載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA-4組；5：Cbl-b載體對(duì)應(yīng)空載組；6：Cbl-b過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組；7：Cblb載體與陰性對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組；8：陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；9：空白細(xì)胞組

四、討論

Cbl-b是泛素連接酶E3家族的重要成員，可使細(xì)胞內(nèi)許多重要信號(hào)分子泛素化，使其失去功能或介導(dǎo)其通過泛素-蛋白酶體/溶酶體途徑降解。Cbl-b在免疫耐受、變態(tài)反應(yīng)及細(xì)胞分化等過程中起重要作用［3-4］。Cbl-b控制著T細(xì)胞對(duì)弱抗原肽反應(yīng)活化的閾值［5］，其表達(dá)的下調(diào)可降低T細(xì)胞對(duì)免疫抑制信號(hào)的反應(yīng)性。當(dāng)外來抗原刺激時(shí)，即使在沒有共刺激信號(hào)分子的輔助下，Cbl-b缺陷T細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞因子分泌能力也有所增強(qiáng)［6-7］。另外，除了參與控制近端抗原受體信號(hào)途徑外，Cbl-b可能還介導(dǎo)某些特定的T細(xì)胞活化途徑，如由Vav1介導(dǎo)的免疫突觸的形成［8］。體外抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cbl-b-/-CD4+T細(xì)胞對(duì)Treg及TGFβ介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)均可產(chǎn)生一定的抵抗力［9］。對(duì)Cbl-b分子的深入研究，有助于尋求腫瘤免疫治療中的新的靶標(biāo)分子。

RNA干擾技術(shù)是一項(xiàng)依賴RNA的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，能通過雙鏈RNA（dsRNA）特異性地抑制與其序列同源的靶基因mRNA的表達(dá)［10］。它作為一種簡(jiǎn)便、高效、特異地抑制靶基因表達(dá)的新技術(shù)而廣泛應(yīng)用于基因功能分析、抗病毒和腫瘤治療的研究中。常用體外化學(xué)合成小片段siRNA，此法操作簡(jiǎn)單快速，但其RNA干擾效應(yīng)僅呈瞬時(shí)效應(yīng)，難以持久。shRNA表達(dá)載體系統(tǒng)產(chǎn)生短發(fā)夾型RNA來完成RNA干擾，其DNA表達(dá)框轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)形成siRNA［11-12］。針對(duì)同一基因的不同靶點(diǎn)而產(chǎn)生不同的干擾效果，提示RNA干擾具有一定的靶點(diǎn)效應(yīng)，同時(shí)也說明利用RNA干擾進(jìn)行相關(guān)研究前，首先需要對(duì)干擾序列進(jìn)行篩選。本實(shí)驗(yàn)的目的基因?qū)氩捎幂d體法，針對(duì)小鼠Cbl-b基因設(shè)計(jì)合成4條編碼目標(biāo)shRNA的DNA，并插入適用于RNAi實(shí)驗(yàn)的表達(dá)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo，構(gòu)建編碼目的shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒。這比直接導(dǎo)入siRNA能產(chǎn)生更持久的沉默效應(yīng)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，我們所制備的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定，插入的序列和目標(biāo)序列一致，沒有插入、缺失、突變等異常，表明成功構(gòu)建了攜帶shRNA的真核表達(dá)載體，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，設(shè)計(jì)的shRNA都能在一定程度上沉默靶基因mRNA以及蛋白的表達(dá)，其中以shRNA1的沉默效應(yīng)最強(qiáng)，其功能有待進(jìn)一步探討。

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2014-05-22）

（本文編輯：吳曉初）

Construction and identification of a short hairpin RNA expression vector targeting the Cbl-b gene

Hu Bin,Ni Nana,Lyu Yalin,Chen Hao,Liu Yi,Sun Jianfang.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Sun Jianfang,Email:Sunjf57@163.com;Liu Yi,Email:dr.liuyi@gmail.com

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression plasmid vector encoding Cbl-b gene-specific short hairpin RNAs （shRNAs）,and to evaluate its interference effect,so as to lay a foundation for further study on the role of Cbl-b in the immunotherapy of malignant melanoma.MethodsAccording to the sequence of Cbl-b cDNA,4 pairs of shRNAs targeting the Cbl-b gene were designed and synthesized,and then inserted into the plasmid PGPU6/GFP/Neo to construct recombinant plasmids.After identification by DNA sequencing,the 4 shRNA expression vectors were cotransfected into 293T cells with the Cbl-b gene eukarytic expresson plasmid,respectively.The knockdown efficiency of these shRNA expression plasmids on Cbl-b expression was evaluated by real-time（RT）fluorescence-based quantitative PCR and Western blot at 48 hours aftert transfection.ResultsSequencing analysis revealed that all the 4 pairs of shRNAs were successfully inserted into the eukarytic expression vector PGPU6/GFP/Neo.As RT-PCR and Western blot showed,all the 4 shRNA-expressing vectors could downregulate Cbl-b expession,and the NO.1 shRNA-expressing vector displayed the strongest interference effect（P＜0.05）.ConclusionsA eukaryotic expression plasmid vector was successfully constructed for Cbl-b gene-specific shRNAs,and the most effective shRNA was selected in this study.

Ubiquitin-protein ligases;RNA,small interfering;Melanoma;Genes,Cbl-b

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.018

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81171513）

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

孫建方，Email：sunjf57@163.com；劉毅，Email：dr.liuyi@gmail.com