王沛 周城 王雨馨 溫廣東 劉萍 于聰 廖文俊 張建中

常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)一例及其家系基因突變研究

王沛 周城 王雨馨 溫廣東 劉萍 于聰 廖文俊 張建中

目的 報道國內首例常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，對患者及其父母橋粒芯糖蛋白4編碼基因（DSG4）進行突變研究。方法 抽取1例念珠狀發(fā)患兒及其父母外周血，提取血液基因組DNA，同時取100例健康漢族人基因組DNA樣品作對照，采用PCR方法擴增DSG4基因16個外顯子，并對產物進行測序分析。結果 患兒DSG4基因存在2個雜合突變，突變1為第8外顯子移位突變c.837delA（p.E280Rfs*4），突變2為第16外顯子無義突變c.2389C＞T（p.R797*）。對其父母的基因分析證明，突變1來自其父親，突變2來自其母親。100例健康對照均未發(fā)現該雜合突變。結論 DSG4基因的2個雜合突變c.837delA（p.E280Rfs*4）和c.2389C＞T（p.R797*）導致該常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)家系的臨床表型，2個突變均導致DSG4基因翻譯的提前終止。

念珠形發(fā)；稀毛癥；皮膚疾病,遺傳性；橋粒芯糖蛋白質類；突變；橋粒芯糖蛋白4基因

念珠狀發(fā)（monilethrix，OMIM：158000）是一種罕見的毛干結構異常伴毛囊改變的先天性禿發(fā)癥，屬于單基因遺傳性疾病。念珠狀發(fā)多以常染色體顯性方式遺傳，已發(fā)現常染色體顯性遺傳念珠狀發(fā)的致病基因為3種Ⅱ型毛發(fā)角蛋白的編碼基因：KRTHB1（KRT81）、KRTHB3（KRT83）和 KRTHB6（KRT86），國內外已有多個家系報道證實［1-2］。近年來，國外報道了數例以常染色體隱性遺傳伴有念珠狀發(fā)樣改變的先天性稀毛癥家系，部分學者將其命名為常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，并發(fā)現其致病基因為橋粒芯糖蛋白 4（desmoglein 4，DSG4）編碼基因［3］。目前常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)在國內尚無報道，本文報道1例常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，并對其進行DSG4基因的突變研究。

對象與方法

一、臨床資料

先證者男，11歲，漢族?；純撼錾鷷r頭皮正常，無頭發(fā)，出生后逐漸有少量頭發(fā)長出，睫毛、眉毛正常。8個月大時頭皮開始出現針尖樣丘疹，與毛囊分布一致，其上毛發(fā)變細、斷裂，留下毛囊角化性丘疹，類似的皮損也逐漸增多并擴展至頸部和四肢伸側。1歲余時睫毛和眉毛開始脫落、變短，顏色變淡，逐漸出現和頭皮類似的毛囊角化性丘疹。脫發(fā)情況春重冬輕。指（趾）甲正常，齲齒較多，牙齒上有裂紋。外院曾診為小棘狀毛壅癥，使用中藥及抗真菌藥物治療無效?；純荷L發(fā)育與同齡兒無異，身高、體重、智力均正常。父母均體健，非近親結婚，家族中無類似疾病患者。皮膚科檢查：頭發(fā)稀疏，頭皮、頸部可見成片的毛囊性丘疹，針頭大小，中央可見一黑色角栓，剝出角栓可見其內含有碎毛，毛囊周圍可見紅斑；眉毛和睫毛稀疏、短?。▓D1、2）；脫落的頭發(fā)無毛囊，多為從毛干下部斷裂形成的斷發(fā)。光鏡下可見部分頭發(fā)粗細不均，頭發(fā)彎折、斷裂。牙齒無光澤，有裂紋，指（趾）甲正常。皮膚鏡下可見黑點征樣改變，粗大的毛發(fā)大致正常，部分頭發(fā)細小、折斷，可見串珠樣改變（圖3、4）。父母毛發(fā)密度和分布均正常。初步診斷：念珠狀發(fā)。

對照組100例來自于北京大學人民醫(yī)院皮膚科收集的無先天性禿發(fā)表現或家族史的正常人，均為漢族。

圖1 患者頭皮毛發(fā)和眉毛稀疏、短小

圖2 患者后頸部散在片狀毛囊角化性丘疹，毛囊周圍可見紅斑

圖3 皮膚鏡下可見大量斷發(fā)，黑點征樣改變（×10）

圖4 部分細小毛發(fā)可見串珠樣改變（×20）

二、實驗方法

1.DNA提?。菏軝z者簽署知情同意書后，取家系先證者及其父母外周血5ml，2%乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，使用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技公司）提取基因組DNA。

2.PCR及測序：擴增DSG4基因片段，按照文獻［4］提供的序列合成DSG4基因特異性PCR引物，共15對，覆蓋DSG4基因所有16個外顯子及其側翼序列。以基因組DNA為模板進行擴增，采用50μl體系，擴增條件為：95℃預變性7min后，94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃后延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。

3.DSG4基因擴增產物測序：PCR擴增產物經凝膠電泳回收純化后，送北京天一輝遠生物科技有限公司測序，測序方法為Sanger雙脫氧鏈終止法（Sanger法）。測序結果采用 BLAST軟件及DNAMAN6.0軟件與DSG4基因序列進行比對。

4.驗證：100例毛發(fā)正常受試者每例取外周血3ml作為對照組，按上述方法提取基因組DNA，并擴增患者發(fā)生突變的相應外顯子進行測序。

結 果

所有引物在模板DNA中均擴增出目標條帶，產物切膠純化后測序，結果清晰無雜峰干擾。將所測得的序列與UCSC數據庫（http://genome.ucsc.edu）公布的正常序列進行對比，排除已知單核苷酸多態(tài)性（SNP）之后得到如下結果：先證者第8外顯子存在1個雜合移碼突變c.837delA（p.E280Rfs*4）（突變1），該突變導致第280位密碼子由GAG變?yōu)锳GA，并在其后形成翻譯提前終止密碼子（PTC）；第16外顯子存在一雜合突變c.2389C＞T（p.R797*）（突變2），導致第797位密碼子CGA變成了TGA，編碼的氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼，形成另一處PTC。測序結果見圖5。

隨后對先證者父母DSG4基因突變進行驗證，結果發(fā)現其父親存在c.837delA（p.E280Rfs*4），母親存在c.2389C＞T（p.R797*），先證者DSG4的2個突變分別來自于其父母。在100例健康對照中未發(fā)現此雜合突變。測序結果見圖5。

圖5 DSG4第8和第16號外顯子測序結果 A：患兒第8號外顯子c.837delA突變；B：其父第8號外顯子c.837delA突變；C：第8號外顯子健康對照；D：患兒第16號外顯子c.2389C＞T突變；E：其母第16號外顯子c.2389C＞T突變；F：第16號外顯子健康對照

討 論

本文報道國內首例DSG4基因突變所致的常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，在使用毛發(fā)鏡和突變分析前該患者長期被誤診為小棘狀毛壅癥。臨床診斷念珠狀發(fā)的關鍵是找到典型的發(fā)干結構改變，但由于念珠狀發(fā)脆性增加，所以通常有明顯異常的毛干在長出頭皮不久即在近毛根處發(fā)生斷裂，尤其是當發(fā)生典型念珠狀發(fā)改變的毛發(fā)比例較少時，采集進行光鏡或掃描電鏡檢查的較長頭發(fā)往往因外觀正常而容易漏診。常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)的典型念珠狀發(fā)改變常常僅發(fā)生于非常細小的頭發(fā)，更易漏診和誤診。

過去認為念珠狀發(fā)為常染色體顯性遺傳，其致病基因為3種角蛋白基因 KRT81、KRT83和KRT86。近年來國際上相繼報道了數例常染色體隱性遺傳的念珠狀發(fā)，并發(fā)現其致病基因為橋粒芯糖蛋白4［4］。橋粒是角質形成細胞間連接的基本結構，橋粒芯糖蛋白是其組成部分之一。毛囊細胞的分化需要骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、膜信號轉導因子、生長因子在內的多種分子通路的參與，細胞間的聯接網絡為這些信號誘導細胞增殖和分化提供了最基礎的保障［5］。2003年 Whittock 等［6］從基因水平定位描述了一個和橋粒芯糖蛋白1、2、3同源的新人類橋粒芯糖蛋白，并將其命名為橋粒芯糖蛋白4，其編碼基因為DSG4基因，DSG4位于18號染色體18q12、DSG1與DSG3的編碼基因之間，由16個外顯子組成，cDNA全長3.6 kb。

DSG4屬于鈣黏蛋白超家族，是橋粒的重要部分，常在表皮和毛囊表達。Kljuic等［5］最早通過兩個巴基斯坦家系的研究發(fā)現，DSG4的突變導致局限性常染色體隱性遺傳性稀毛癥（localized autosomal recessive hypotrichosis,LAH）的發(fā)病。LAH臨床表現和常染色體顯性遺傳念珠狀發(fā)相似，但病發(fā)毛干在電鏡下未發(fā)現念珠狀結構。2006年Shimomura等［4］、Zlotogorski等［7］和 Schaffer等［8］分別報道了 DSG4 基因突變導致的伴串珠樣結構異常的先天性禿發(fā)病例，其臨床表現與常染色體顯性遺傳念珠狀發(fā)也非常相似，篩查Ⅱ型角蛋白基因結果為陰性，后將該病命名為念珠狀發(fā)樣先天性稀毛癥。近年來部分學者認為該病為念珠狀發(fā)的一種常染色體隱性遺傳的亞型。由于常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)和LAH的致病基因均為DSG4，臨床表現非常相似，差異僅為毛干是否存在念珠狀發(fā)樣改變，這兩種疾病是否實為同一疾病，尚存在爭議。Wajid等［9］報道的LAH家系中雖沒有出現典型的念珠樣發(fā)，但毛干偶爾也可以觀察到念珠發(fā)樣的凸起結構。我們認為常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)和LAH是同一種疾病，使用皮膚鏡能比電鏡更容易發(fā)現細小的、比例較少的、有念珠狀發(fā)樣改變的毛發(fā)，但還需要更多的病例報告和突變研究來證實。

目前我們所知，與常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)和LAH相關的DSG4基因突變共11種，包括錯義突變、無義突變、堿基的缺失突變、插入突變、剪接位點突變和大片段缺失突變等［4，7-13］（圖6）。其中LAH的DSG4基因突變報道都為純合子突變，念珠狀發(fā)幾乎均為雜合子突變（僅1例純合P267R突變例外）。不同的突變位點會導致臨床癥狀的表現不一，純合突變癥狀相對較重，有明顯的臨床異質性。本研究中突變c.837delA和c.2389C＞T分別發(fā)生在細胞外第3結構域和細胞內結構域（圖6）。根據Peltz等［14］提出的無義介導的mRNA降解原則（nonsense-mediated mRNA decay，NMD），異常 mRNA將被細胞識別并清除，但在哺乳動物細胞中，PTC下游至少有一個外顯子-外顯子連接（exon-exon junction，EEJ）才能啟動清除［15］。本文患者的第1 個PTC位于第8外顯子，根據該定律，其翻譯產物將被大量降解，不會形成蛋白產物。第2個PTC位于第16外顯子，由于位于基因最末外顯子，所以我們認為它很可能躲避NMD監(jiān)控而形成一個縮短的產物，從而保留部分DSG4的功能，因此臨床表現相對較輕，該突變導致橋粒芯糖蛋白C-端結構的缺失，影響DSG和橋粒斑珠蛋白（PG）的連接，導致細胞間連接系統(tǒng)的缺陷［16］。

圖6 DSG4結構域模式圖及已經報道過的突變位點。其中S為信號結構域，P為前蛋白結構域，ECⅠ～ECⅣ為細胞外結構域，EA為細胞外錨定結構域，TM為跨膜結構域，IC為細胞內結構域。a：為本家系新發(fā)現的2個突變位點

本研究在國內首次報道常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，并通過對其進行基因突變分析，發(fā)現了2個DSG4基因的新突變，c.837delA和c.2389C＞T，豐富了該病的遺傳及臨床數據庫，并為該病臨床上的正確診斷、將來基因型與表型的相互關系研究以及DSG4在毛囊生長中的功能研究提供了依據。

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2014-05-05）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

Autosomal recessive monilethrix:a case report and mutation analysis

Wang Pei*,Zhou Cheng,Wang Yuxin,Wen Guangdong,Liu Ping,Yu Cong,Liao Wenjun,Zhang Jianzhong.*Department of Dermatology,Peking University People′s Hospital,Beijing 100044,China

Zhang Jianzhong,Email:rmzjz@126.com

ObjectiveTo report the first case of autosomal recessive monilethrix in China,and to study the mutations in the desmoglein 4 （DSG4）gene in the patient and his parents.MethodsPeripheral blood samples were obtained from an 11-year-old boy with monilethrix,his parents and 100 healthy human controls of Han nationality.Genomic DNA was extracted from these samples,and PCR was performed to amplify 16 exons of the DSG4 gene followed by DNA sequencing.ResultsThere were 2 heterozygous mutations in the DSG4 gene in the patient,including a translocation mutation c.837delA（p.E280Rfs*4）in exon 8 and a nonsense mutation c.2389C ＞ T（p.R797*）in exon 16.Gene analysis in the parents revealed that the translocation mutation and nonsense mutation were inherited from the father and mother respectively.Neither of the two mutations was found in the 100 healthy controls.ConclusionsThe two heterozygous mutations c.837delA （p.E280Rfs*4）and c.2389C ＞T （p.R797*）in the DSG4 gene,both of which lead to premature termination of translation of the DSG4 gene,may be responsible for the clinical phenotype of autosomal recessive monilethrix in this family.

Monilethrix;Hypotrichosis;Skin diseases,genetic;Desmogleins;Mutation;Desmoglein 4 gene

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.004

國家自然科學基金（81201221）

100044北京大學人民醫(yī)院皮膚科（王沛、周城、王雨馨、溫廣東、劉萍、于聰、張建中）；第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院（廖文俊）

張建中，Email：rmzjz@126.com