張俊峰 王彥春 魏殿軍

冷凝集是指患者血液中含冷凝集素，當(dāng)?shù)陀谀硞€(gè)溫度時(shí)血細(xì)胞發(fā)生凝集，當(dāng)溫度恢復(fù)到37℃時(shí)，凝集消失，這種可逆的現(xiàn)象稱為冷凝集現(xiàn)象。隨著血液分析儀的更新?lián)Q代、檢測(cè)準(zhǔn)確度的不斷提高以及標(biāo)準(zhǔn)化操作流程的規(guī)范使得血常規(guī)的復(fù)檢率很低。對(duì)門診量較大的醫(yī)院，血常規(guī)常采用即采即測(cè)的方式，當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果明顯異常時(shí)，可能是標(biāo)本出現(xiàn)冷凝集現(xiàn)象，一般認(rèn)為重新采血后立即上機(jī)檢測(cè)可以排除冷凝集素的干擾，但筆者在工作中仍發(fā)現(xiàn)3例“即采即凝”（血液離體后即發(fā)生凝集，立即上機(jī)檢測(cè)結(jié)果異常，但凝塊要在數(shù)分鐘后才會(huì)出現(xiàn)）的冷凝集標(biāo)本。此類標(biāo)本在門診很容易漏檢，特別是當(dāng)采血管管壁呈細(xì)顆粒狀時(shí)，外觀與正常血相似，不容易發(fā)現(xiàn)異常，而且本文研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱水浴處理后的某些標(biāo)本仍能對(duì)不同血細(xì)胞分析儀的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。在實(shí)際工作中，雖然此類標(biāo)本很少，但若不及時(shí)發(fā)現(xiàn)，容易發(fā)出錯(cuò)誤的報(bào)告，影響臨床診療，甚至?xí)霈F(xiàn)嚴(yán)重的醫(yī)療事故，因此需引起重視。本文對(duì)我院3例冷凝集標(biāo)本的檢測(cè)處理方法進(jìn)行總結(jié)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集3例即采即凝的血液標(biāo)本，其中2例為我院門診檢測(cè)血常規(guī)的患者，1號(hào)標(biāo)本來自男性患者，2號(hào)標(biāo)本來自女性患者，年齡為40～50歲；另1例為我院在社區(qū)義診時(shí)檢測(cè)血常規(guī)的女性患者，68歲，自述多次檢查RBC數(shù)偏低。3例標(biāo)本均無脂血、溶血、黃疸，且排除其他特征性疾病。

1.2 儀器與試劑 采用日本SYSMEX 800i和SYSMEX XN－2000自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套試劑，邁瑞B(yǎng)C－3000血細(xì)胞分析儀及配套試劑檢測(cè)WBC、RBC、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、平均紅細(xì)胞容積（mean corpuscular volume，MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin contentration，MCHC）和血小板（platelet，PLT）；采用 OLYMPUS CX21雙目顯微鏡進(jìn)行WBC、RBC和PLT計(jì)數(shù)。儀器使用前均已校準(zhǔn)，測(cè)定配套質(zhì)控物，結(jié)果也均在靶值允許的范圍內(nèi)。

1.3 方法

1.3.1 儀器法 采用EDTA－K2抗凝劑的真空采血管于肘靜脈處采集靜脈血2 ml，混勻后立即用SYSMEX 800i血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室溫度恒定在25℃。首先，標(biāo)本檢測(cè)完后放在37℃水浴，30 min后觀察未發(fā)現(xiàn)管內(nèi)壁有凝集顆粒，混勻后立即上機(jī)檢測(cè)，其次，對(duì)于結(jié)果異常的標(biāo)本分別用SYSMEX 800i，SYSMEX XN2000和邁瑞 BC－3000血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程進(jìn)行嚴(yán)格保溫。每種儀器重復(fù)做3次，取平均值。

1.3.2 手工法 嚴(yán)格按照《臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》第2版［1］操作規(guī)程分別對(duì)RBC、WBC、PLT進(jìn)行計(jì)數(shù)。37℃水浴30 min后同時(shí)制備血涂片3張，推片后立即置于37℃烘箱內(nèi)烘干，采用瑞氏染色進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)［2］，載玻片也應(yīng)提前進(jìn)行預(yù)熱。

1.4 冷凝集素滴度測(cè)定 用生理鹽水將血漿在32孔板上依次做 1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32…倍比稀釋，每孔 200 μl，并于各孔加4%的自身RBC懸液50μl，置4℃冰箱過夜，取出后輕輕搖動(dòng)，觀察有無RBC凝塊。若無凝塊判為陰性，有凝塊判為陽(yáng)性，并報(bào)告無凝塊時(shí)的最高稀釋倍數(shù)。

1.5 MCH、MCHC 的計(jì)算 采用 Laboman EasyAcess6.0 軟件對(duì)MCH、MCHC進(jìn)行分析，MCH、MCHC的計(jì)算公式如下。

MCH＝Hb／RBC

MCHC＝Hb／HCT＝Hb／MCV×RBC

當(dāng)發(fā)生冷凝集時(shí)，RBC諸多參數(shù)會(huì)受到影響，由于MCV可能升高，也可能正常；Hb相對(duì)恒定，MCH、MCHC變化較為明顯且能體現(xiàn)RBC參數(shù)的基本信息，因此以MCH、MCHC為代表進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

表1 3例標(biāo)本水浴前后SYSMEX 800i檢測(cè)結(jié)果

表2 3種儀器與手工鏡檢法對(duì)3號(hào)標(biāo)本檢測(cè)的結(jié)果比較

2.1 3例冷凝集標(biāo)本對(duì)同種血液分析儀的影響 由表1可見，3例冷凝集標(biāo)本經(jīng)熱水浴后，1號(hào)標(biāo)本和2號(hào)標(biāo)本的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均恢復(fù)正常；3號(hào)標(biāo)本的RBC和PLT參數(shù)恢復(fù)正常，而WBC較水浴前有所降低。3例標(biāo)本RBC聚集形成的凝塊大小均隨滴度的增加有增大的趨勢(shì)。3號(hào)標(biāo)本因冷凝集素對(duì)WBC產(chǎn)生不同影響，故選用不同血液分析儀進(jìn)行分析。

2.2 不同血液分析儀對(duì)3號(hào)冷凝集標(biāo)本檢測(cè)的比較 以手工鏡檢法為標(biāo)準(zhǔn)，三種儀器檢測(cè)結(jié)果與手工鏡檢法結(jié)果分別進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，3種儀器的PLT與手工鏡檢法結(jié)果無明顯區(qū)別，而邁瑞 BC－3000和SYSMEX 800i的 NEUT%及LYMPH%的檢測(cè)結(jié)果與手工鏡檢法有所不同，邁瑞B(yǎng)C－3000的RBC偏低，而SYSMEX 800i的WBC偏高。SYSMEX XN 2000的RBC、WBC、NEUT%和LYMPH%結(jié)果與手工鏡檢法結(jié)果基本一致，見表2。

2.3 3號(hào)標(biāo)本水浴后三種儀器直方圖與散點(diǎn)圖的比較 邁瑞B(yǎng)C－3000的RBC偏低且RBC直方圖的右側(cè)有一個(gè)小波峰，而其他兩臺(tái)儀器并沒有出現(xiàn)，說明RBC檢測(cè)過程中又重新發(fā)生了聚集，記錄該實(shí)驗(yàn)室室溫為18℃（該患者為社區(qū)義診時(shí)發(fā)現(xiàn)的，該實(shí)驗(yàn)室儀器為邁瑞 BC－3000）；SYSMEX 800i的WBC計(jì)數(shù)偏高，散點(diǎn)圖顯示異常；SYSMEX XN2000的WDF和WNR散點(diǎn)圖完整清晰，見圖1～圖3。

2.4 顯微鏡濕片觀察法檢測(cè)3號(hào)標(biāo)本的結(jié)果 將3號(hào)標(biāo)本推片后立即在顯微鏡下觀察，可以看到均勻的血細(xì)胞逐漸分裂開并以各自的中心聚集，各個(gè)細(xì)胞團(tuán)之間仍存在散在的單個(gè)細(xì)胞，見圖4。

2.5 MCH、MCHC的檢測(cè)結(jié)果 用SYSMEX NX2000自帶的Laboman EasyAcess6.0軟件對(duì)我院2013年11月到2014年5月期間SYSMEXNX－2000上的15 474份血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行篩查性分析。當(dāng)結(jié)果過濾條件設(shè)置為MCH＞48 pg（超過上限值的50%）時(shí)仍有5例，而某些透析的患者M(jìn)CH可達(dá)50 pg以上，無特異性；當(dāng)設(shè)置為MCHC＞400 g／L（超過上限值的10%）時(shí)，僅有待篩查的冷凝集標(biāo)本與之吻合。

圖1 邁瑞B(yǎng)C－3000檢測(cè)3號(hào)標(biāo)本的血細(xì)胞直方圖

圖2 SYSMEX 800i檢測(cè)3號(hào)標(biāo)本的血細(xì)胞直方圖和WBC散點(diǎn)圖

3 討論

圖3 SYSMEX XN2000檢測(cè)3號(hào)標(biāo)本的WDF、WNR散點(diǎn)圖和RBC、PLT直方圖

圖4 顯微鏡濕片觀察法觀察3號(hào)標(biāo)本的血細(xì)胞狀態(tài)（×400，瑞氏染色）

目前，冷凝集現(xiàn)象的報(bào)道已較為常見，如何解決冷凝集對(duì)血常規(guī)檢測(cè)的影響，在以往的研究中多偏向于熱水浴的方法，本實(shí)驗(yàn)中有3例冷凝集標(biāo)本，1例經(jīng)熱水浴后并不能完全解決問題，這與以往的報(bào)道［3］相一致。3號(hào)標(biāo)本對(duì)3種不同儀器的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生不同的影響，這可能與不同儀器的檢測(cè)原理和所受的干擾因素不同有關(guān)。①邁瑞B(yǎng)C－3000無論重新采血還是熱水浴后，RBC均偏低且RBC直方圖的右側(cè)有一個(gè)小波峰，而其他兩臺(tái)儀器并沒有出現(xiàn)，說明RBC經(jīng)溫度較低的進(jìn)樣針、反應(yīng)器、檢測(cè)器時(shí)又重新發(fā)生了聚集，這與室溫有關(guān)，可見保證實(shí)驗(yàn)室溫度很重要［4］。而WBC在分類時(shí)也發(fā)生錯(cuò)誤，這與三分類分析儀的分類原理有關(guān)。冷凝集素不僅可以凝集RBC，也可凝集WBC和PLT［5］。冷凝集素通過影響WBC大小而影響其分類。邁瑞B(yǎng)C－3000作為三分類分析儀的代表仍廣泛使用于一級(jí)醫(yī)院，除直方圖外可供參考的信息較少，很容易誤診漏診。②SYSMEX 800i采用核酸熒光染色和前向散色光兩種方法同時(shí)對(duì)WBC進(jìn)行計(jì)數(shù)，WBC計(jì)數(shù)偏高主要與RBC膜質(zhì)溶解不全有關(guān)［6］；③SYSMEX XN2000采用雙熒光染料、3R復(fù)檢規(guī)則、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，從而保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般來說，設(shè)計(jì)更精密的儀器由于方法學(xué)上的先進(jìn)性使其受干擾的因素少，從而結(jié)果準(zhǔn)確性更高［7］。

本文研究認(rèn)為即采即凝標(biāo)本的發(fā)現(xiàn)要比解決冷凝集素干擾更具有臨床意義，而冷凝集標(biāo)本的判定不能僅從肉眼對(duì)標(biāo)本的外觀來判斷，應(yīng)選擇一種有效的篩查方法最大范圍的避免臨床的誤診漏診。由于SYSMEX XN2000的準(zhǔn)確度和重復(fù)性較好，所以用其自帶的Laboman EasyAcess6.0軟件進(jìn)行篩查，由于該儀器采血量大，篩查標(biāo)本排除5歲以下兒童及新生兒。選用MCHC作為篩選指標(biāo)有3個(gè)理由：①通過軟件篩查發(fā)現(xiàn)MCHC相對(duì)特異；②公式計(jì)算法：MCHC＝HB／HCT＝HB／RBC×MCV＝HB／RBC×（V1＋V2＋V3＋……Vn）／RBC＝HB／V1＋V2＋V3＋……Vn，n＝RBC 數(shù)，正常情況下血液分析儀是把細(xì)胞看作或者處理為球形檢測(cè)的，冷凝集時(shí)，正常RBC為雙凹盤狀，可抽象的看成“碟子”，冷凝集的程度與“碟子”疊在一起的程度有關(guān)；③叢玉隆等［8］認(rèn)為MCHC是一個(gè)相對(duì)恒定的值，其浮動(dòng)均值可以用于質(zhì)控的監(jiān)測(cè)。所以當(dāng)SYSMEX XN2000上MCHC＞400 g／L時(shí)要高度懷疑是冷凝集標(biāo)本，此時(shí)可重新采血后立即濕片鏡檢，觀察顯微鏡下RBC是否發(fā)生聚集。由此可見，MCHC不僅可以作為貧血指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，而且應(yīng)作為一個(gè)常規(guī)指標(biāo)對(duì)冷凝集進(jìn)行篩查。

溫度、滴度與冷凝集現(xiàn)象存在一定的關(guān)系。冷凝集素具有寬熱輻的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外［9－12］有 37 ℃、35.6 ℃及 4 ℃時(shí)發(fā)生冷凝集的報(bào)道，且本文中3例標(biāo)本溫度閾值較高。冷凝集素滴度在很低時(shí)亦可發(fā)生凝集，國(guó)外［12，13］有滴度在 1∶8，1∶64 時(shí)發(fā)生凝集的文獻(xiàn)報(bào)道。當(dāng)?shù)味却笥?∶2000時(shí)出現(xiàn)肉眼可見的凝塊［14］，結(jié)合本文研究的結(jié)果，我們認(rèn)為凝集塊的大小與冷凝集素的滴度有關(guān)，凝集發(fā)生與否與溫度有關(guān)。

對(duì)冷凝集標(biāo)本處理的方案有很多種，并沒有固定的模式，應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況考慮。目前主要方法有重新采血立即檢測(cè)法、37℃熱水浴法、血漿置換法、血漿置換和水浴結(jié)合法，本文研究采用熱水浴加高型號(hào)SYSMEX XN系列分析儀，結(jié)合WDF、WNR散點(diǎn)圖也得到滿意的檢測(cè)結(jié)果。

綜上所述，雖然現(xiàn)在的血液分析儀已達(dá)到了相當(dāng)完善的程度，但儀器提供的信息只是一種提示，不能代表標(biāo)本的真實(shí)情況。在標(biāo)本量較大的醫(yī)院，尤其是門診可先用MCHC加濕片觀察法進(jìn)行篩查，然后嘗試熱水浴后用SYSMEX XN系列進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合WDF、WNR散點(diǎn)圖和儀器提示信息進(jìn)行判斷，以提高實(shí)驗(yàn)室的工作效率。但我們?cè)诠ぷ髦胁荒苊つ康囊蕾嚈C(jī)器，必要時(shí)仍需要手工鏡檢確認(rèn)、修正后才能發(fā)出完整的檢驗(yàn)報(bào)告，為臨床的診治提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 劉玉成，主編.臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003，14－15，27－31.

2 叢玉隆，王淑娟，主編.今日臨床檢驗(yàn)學(xué).第1版.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1998，73－74.

3 張時(shí)民.一例嚴(yán)重冷凝集樣本的血常規(guī)檢驗(yàn)解決方案.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志，2011，2：122－124.

4 駱婷婷.一例冷凝集標(biāo)本在不同溫濕度中檢測(cè)結(jié)果分析.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，28：955－956.

5 唐仁強(qiáng).紅細(xì)胞冷凝集對(duì)全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢驗(yàn)結(jié)果的影響.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34：767.

6 陳斌，周小棉.全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀中白細(xì)胞假性計(jì)數(shù)研究進(jìn)展.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，30：240－241，244.

7 曾素根，余江，曾婷婷，等.Sysmex公司血液分析儀的干擾因素分析判斷及處理程序.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25：244－246.

8 叢玉隆，金大鳴，王鴻利，等.中國(guó)人群成人靜脈血細(xì)胞分析參考范圍調(diào)查.中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，83：1201－1205.

9 趙玉平，徐艷，沈琳，等.Ham＇s試驗(yàn)陽(yáng)性的自身免疫性溶血性貧血實(shí)驗(yàn)指標(biāo)分析.罕少疾病雜志，2004，11：1－3.

10 曾令軍，李莉，吳慶，等.高效價(jià)冷凝集素對(duì)血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的影響及消除方法探討.罕少疾病雜志，2011，18：2－6.

11 Jeong J，Lee HK，Choi ES，etal.Acute exacerbation of cold agglutinin diseaseduringoperation.Korean JAnesthesiol，2013，65：S125－S126.

12 Kalra A，Singh K，Sahoo M，etal.Cold agglutinin disease detected during open heart surgery.Indian J Hematol Blood Transfus，2014，30：62－63.

13 Ercan S，Caliskan M，Koptur E.70－year old female patient with mismatch between hematocrit and hemoglobin values：the effects of cold agglutinin on completeblood count.Biochem Med（Zagreb），2014，24：391－395.

14 Heni M，Saur SJ.Blood clottingat roomtemperaturein cold agglutinin disease.Blood，2013，121：4975.