童傳旺，季慕寅，許月明，曹 侃

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

視覺功能是高等哺乳類動(dòng)物獲取外界信息的重要途徑(約占信息總量的70%以上)。伴隨年齡增長過程，視覺功能亦會(huì)出現(xiàn)非病理性的衰退現(xiàn)象[1]。關(guān)于視覺衰老的神經(jīng)機(jī)制探討研究，也成為腦機(jī)制研究熱點(diǎn)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain－derived neurotrophic factor，BDNF)及其受體介導(dǎo)的對于腦功能活動(dòng)方面的影響機(jī)制研究獲得了較為廣泛的認(rèn)識。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF及其受體是參與神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元發(fā)育、存活、損傷修復(fù)、突觸可塑性等機(jī)理的重要調(diào)節(jié)因素[2]。初級視皮層作為處理視覺信息的高級中樞，衰老對其腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)的年齡表達(dá)差異情況尚未有報(bào)道。

本研究以視覺系統(tǒng)研究的傳統(tǒng)模型動(dòng)物貓初級視皮層為研究對象，采用免疫組織化學(xué)方法，比較青年組與老年組貓初級視皮層體中BDNF的表達(dá)情況，觀察與定量比較實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，以期揭示視皮層水平上的視覺功能衰退影響因素及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料試劑

本研究選取貓作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，動(dòng)物個(gè)體體重2～3.5kg，為排除眼疾對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物須經(jīng)嚴(yán)格的眼部篩查。選取1～3齡貓4只組成青年組，10～13齡貓4只組成老年組。按40mg/kg體重注射鹽酸氯胺酮至動(dòng)物深度麻醉后，立即開胸經(jīng)心臟灌注0.9%生理鹽水，觀察到肝臟發(fā)白，續(xù)灌注含10%福爾馬林與2.5%戊二醛混合的0.1mol/L磷酸緩沖液(200mL/kg體重，PBS pH7.2～7.4)預(yù)固定組織。開顱取出腦干至上述預(yù)固定液中固定2h。依照貓腦立體定位圖譜冠狀切取初級視皮層組織，將組織塊移入30%蔗糖溶液(含2.5%戊二醛、10%福爾馬林)中靜置至組織塊沉底。冰凍切片機(jī)作50μm厚連續(xù)冠切片，每隔3片取2片為一組，分別用于BDNF免疫組織化學(xué)標(biāo)記及陰性對照，每只貓取10組。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

按常規(guī)免疫組織染色步驟，依次將冰凍切片以3%H2O2孵育處理后蒸餾水沖洗;再以含0.3%TritonX－100 PBS溶液孵育處理后，再滴加5%胎牛血清蛋白繼續(xù)孵育處理;傾去血清后，滴加一抗(兔抗鼠BDNF抗體，稀釋度1∶100)，4℃孵育處理;再滴加二抗(羊抗兔IgG工作液)，室溫孵育處理后;最后滴加三抗SABC試劑，室溫孵育處理;沖洗后DAB顯色，梯度酒精脫水后二甲苯透明處理，最后以中性樹膠封片。陰性對照片處理時(shí)，除滴加一抗時(shí)以PBS液替代，其余步驟同步操作。

實(shí)驗(yàn)所用BDNF抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB均購于武漢博士德公司。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察及數(shù)據(jù)采集分析

分別隨機(jī)選取切片青、老年組BDNF免疫反應(yīng)切片各20張，置于Olympus BX－51型顯微鏡下觀察，Image－Pro Express 6.0圖像分析軟件采集圖像，定量統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)形態(tài)學(xué)參數(shù)，統(tǒng)計(jì)初級視皮層中各層BDNF免疫陽性細(xì)胞密度及免疫陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱指標(biāo)(免疫反應(yīng)吸光度值)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)人員在未知分組情況下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和吸光度測量。

將BDNF免疫染色切片先置于低倍鏡(×40)下獲取有效圖像，再調(diào)至高倍鏡(×100)下觀察分層結(jié)構(gòu)，最后至高倍鏡(×400)下分別于各層中選取10個(gè)視野(50μm×50μm)計(jì)數(shù)BDNF免疫陽性細(xì)胞數(shù)目，取均值換算為細(xì)胞密度(cells/mm2)。計(jì)數(shù)為一個(gè)BDNF免疫陽性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)是胞體含明顯的免疫陽性物質(zhì)且具有細(xì)胞核。每張免疫反應(yīng)切片，隨機(jī)選取的20個(gè)視野采集圖像后借助Image－Pro Express 6.0圖像分析軟件測量平均吸光度值，測量值作為免疫陽性反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)。采集數(shù)據(jù)由SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以P＜0.01為標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫染色切片觀察結(jié)果

青年組及老年組貓初級視皮層各層(自初級視皮層表面向內(nèi)可分為六層:分別為分子層I、外顆粒層II、外錐體層III、內(nèi)顆粒層IV、內(nèi)錐體層V和多形層VI)中均可見棕黃或黃褐色的BDNF陽性細(xì)胞胞體及纖維分布(圖1)。

2.2 組內(nèi)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

組內(nèi)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，無論青年貓與老年貓初級視皮層中，BDNF免疫陽性細(xì)胞密度呈現(xiàn)層次差異性:第Ⅱ－Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ層陽性細(xì)胞細(xì)胞密度無顯著差異(P＞0.05，表1)，但第Ⅱ－Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ層陽性細(xì)胞細(xì)胞密度較I層、Ⅳ層大(P＜0.01，表1);其中第Ⅳ層密度較第Ⅰ層大密度更大，即第I層最小(P＜0.01，表1)。青年貓、老年貓組內(nèi)個(gè)體間無顯著差異(P＞0.05，表1)。

表1 青年組及老年組貓初級視皮層中BDNF免疫陽性細(xì)胞密度比較(mean±SD)Table 1 A comparison on density of BDNF－IR cells in the primary visual cortex of young and old cats(mean±SD)

2.3 組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，老年貓初級視皮層各層較青年貓相對應(yīng)分層中的BDNF陽性細(xì)胞密度呈現(xiàn)一致的顯著下降(P＜0.01，表1)，各層平均下降幅度分別為I層10.7%、Ⅱ－Ⅲ層16.1%、IV層13.6%、V層16.1%、VI層12.7%;老年貓較青年貓的BDNF免疫反應(yīng)的平均吸光度值也出現(xiàn)顯著下降(P＜0.01，圖 2)，下降幅度為 22.2%。

3 討論

視覺系統(tǒng)為高等哺乳動(dòng)物獲取外界信息的主要神經(jīng)功能系統(tǒng)，視網(wǎng)膜－外膝體－視皮層三級結(jié)構(gòu)形成了直接傳遞和處理視覺信息的通道。視皮層作為視覺處理的高級中樞，其在衰老過程中會(huì)出現(xiàn)如視銳度(Visual acuity)、對比敏感度(Contrast sensitivity)以及對視覺刺激選擇性下降等反應(yīng)性功能衰退現(xiàn)象[3]。神經(jīng)系統(tǒng)功能衰退的形態(tài)學(xué)變化主要表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量的顯著減少(如神經(jīng)元丟失，膠質(zhì)細(xì)胞凋亡等)與神經(jīng)突觸聯(lián)系功能的削弱[4－5];神經(jīng)功能衰老機(jī)制的研究更多地集中于探討、解釋神經(jīng)活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位——突觸的聯(lián)系、有效性及可塑性(Synaptic plasticity)機(jī)制，較多的研究揭示[6－8]，伴隨年齡的增長，多因素綜合作用致使突觸可塑性下降。BDNF及其受體介導(dǎo)的信號功能對于突觸可塑性的重要作用己被廣泛關(guān)注與探討[9－10]。BDNF是神經(jīng)生長因子家族中的重要成員，且是腦中分布最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子。其可以選擇性地與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮重要作用參于調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的各項(xiàng)活動(dòng)[2]。免疫組織研究發(fā)現(xiàn)，BDNF及其受體均可由腦內(nèi)神經(jīng)元及非神經(jīng)元(如膠質(zhì)細(xì)胞)分泌，并廣泛分布于成年腦組織[11－12]。

本實(shí)驗(yàn)中免疫標(biāo)記結(jié)果較為系統(tǒng)地反映了貓初級視皮層中神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞BDNF的增齡性表達(dá)差異情況。BDNF在貓初級視皮層各層中均有表達(dá)，且老年組較青年組表達(dá)呈現(xiàn)一致性下降。此結(jié)果與在老齡大鼠及阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)患者海馬等處發(fā)現(xiàn)的BDNF增齡性表達(dá)下調(diào)結(jié)果相一致[13－14]。研究表明，BDNF對于GABA能神經(jīng)元的存活和功能表達(dá)具有重要營養(yǎng)支持作用[15－18]。此前我們有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，老年組相較于青年組貓初級視皮層各層神經(jīng)元總數(shù)未見顯著性變化，同時(shí)，貓初級視皮層GABA陽性神經(jīng)元出現(xiàn)增齡性數(shù)量下降現(xiàn)象[19]。綜合上述結(jié)果，我們推測視皮層水平上視覺功能的衰退可能并非是神經(jīng)元數(shù)量的減少，而更傾向于神經(jīng)營養(yǎng)因子介導(dǎo)的特殊神經(jīng)元突觸可塑性的下降所致。且初級視皮層水平上的GABA能神經(jīng)元的抑制性調(diào)節(jié)不足可能是BDNF及其受體信號介導(dǎo)突觸聯(lián)系功能減弱的結(jié)果。其可能的影響機(jī)制傾向于老年個(gè)體因BDNF及其受體分泌不足，抑制性突觸聯(lián)系的形態(tài)和功能穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致最終的視覺信息傳遞加工過程中的丟失而表現(xiàn)為視覺功能的衰退。

4 結(jié)論

貓初級視皮層中BDNF表達(dá)水平存在增齡性下降，提示腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子活動(dòng)減弱引起的突觸可塑性的改變可能是引起視覺功能衰退的重要原因之一。

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