高慧劉晶晶沈姍姍梁少明危林耿李芳芳王沙燕

1暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院（深圳518020）

2亞能生物技術（深圳）有限公司（深圳518133）

·基礎研究·

TaqMan探針熔解曲線技術檢測GJB2基因突變

高慧1劉晶晶2沈姍姍1梁少明2危林耿2李芳芳1王沙燕1

1暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院（深圳518020）

2亞能生物技術（深圳）有限公司（深圳518133）

目的 建立快速可靠的TaqMan探針熔解曲線技術，分析非綜合征型遺傳性耳聾患者的GJB2基因及探討TaqMan探針熔解曲線技術。方法制備標準品，利用TaqMan探針基于熒光PCR熔解曲線平臺建立熔解曲線分析技術；收集138例正常人群、113例非綜合征型遺傳性耳聾患者及2個非綜合征型遺傳性耳聾家系，應用TaqMan探針熔解曲線技術分析GJB2基因最常見的35delG，176_191del16，235delC，299_ 300delAT的4個突變位點；結果利用直接測序技術加以驗證。結果138例正常人群中檢出2例GJB2基因突變，113例非綜合征型遺傳性耳聾患者中檢出22例GJB2基因突變，2個耳聾家系先證者均為GJB2基因突變患者；所有檢測結果均與測序結果一致。結論利用TaqMan探針建立了一種快速可靠的探針熔解曲線技術，經測序驗證能準確的檢測GJB2基因常見的4種突變。

遺傳性耳聾；TaqMan探針；熔解曲線；GJB2基因

GJB2基因為非綜合征型耳聾最常見的基因[1]，先天性重度或極重度常染色體隱性遺傳性非綜合征型耳聾有50%以上是由GJB2基因突變引起[2]，也是首個發(fā)現(xiàn)的常染色體隱性遺傳性致聾基因，在1997年由Kelsell等[3]報道，定位于13q11-12，命名為DFNB1。目前已報道上百種突變(http://www.deafnessvariationdata?base.org)，其 中 35delG，176_191del16，235delC，299-300delAT四個致病突變在我國最常見[4]。GJB2基因突變常常導致感音神經性耳聾，在雙耳極重度耳聾中檢出率最高，單耳聾少見[5]。目前，高通量測序技術已經逐漸應用于耳聾基因突變篩查[6]，但臨床上仍需要簡單、快速、準確的基因檢測方法?，F(xiàn)收集到我國138例正常人群、113例非綜合征型遺傳性耳聾患者及2個非綜合征型遺傳性耳聾家系，利用TaqMan探針建立熔解曲線技術快速分析其GJB2基因最常見的四個突變。

1　方法的建立

1.1引物及探針設計

根據(jù)突變位點的位置，選擇Primer5.0設計一對PCR擴增產物為404bp的引物，囊括四個突變位點；利用Oligo7.0在具體的突變位點處設計TaqMan探針，盡量使突變位置靠近探針中部，有利于探針結合及基因分型。（圖1A）

1.2PCR反應體系及優(yōu)化條件

根據(jù)實驗要求[7]，選擇不對稱PCR，富集探針結合的DNA單鏈。反應體系：1×buffer，2.5U Taq酶，2.5U Taq Antibody，3.0mmol/μl MgCl2，200μmol/μl dNTPs，上游引物0.4μmol/μl，下游引物0.04μmol/μl，各TaqMan探針0.4μmol/μl，20ng DNA（50000 copies質粒），加蒸餾水補至25μl。優(yōu)化條件：第一步PCR擴增：95℃預變性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，40個循環(huán)；第二步熔解曲線：95℃1min，40℃1min，以0.01℃/S的升溫速率從40℃升至85℃并每升高1℃收集 10次熒光。儀器選擇：Roche LightCy?cler480-Ⅱ。

1.3標準品制備及繪制標準曲線

35delG，176_191del16，235delC，299_300delAT均位于GJB2基因的exon2上，按照文獻所述選擇優(yōu)化好的引物及PCR反應程序對GJB2基因exon2部分擴增[8]，送至上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司進行克隆及構建突變位點，并測序驗證質粒構建的準確性。應用探針熔解曲線技術分析野生型及突變型質粒，并繪制標準曲線。

2　方法的驗證與家系分析

2.1臨床資料

收集來自深圳市人民醫(yī)院就診的138例聽力正常人群、113例已確診為非綜合征型遺傳性耳聾患者及2個非綜合征型遺傳性耳聾家系（圖2）。其中家系1共4人；先證者，女，3歲，在1歲時發(fā)現(xiàn)聽力下降，現(xiàn)佩戴助聽器補償聽力損失；其妹妹在6個月聽力檢測出現(xiàn)異常；家系2共3人，先證者，男，9個月發(fā)現(xiàn)對聲音反應差。2個家系均無家族病史及氨基糖苷類抗生素使用史，父母均無聽力障礙。

2.2家系耳科檢查

對2個非綜合征型遺傳性耳聾家系7位成員進行純音聽閾測試。不能進行純音聽力檢查的嬰幼兒，選擇多頻穩(wěn)態(tài)反應（ASSR）進行檢測。按照世界衛(wèi)生組織（WHO-1997）聽力殘疾分級標準進行聽力損失的嚴重程度分級：輕度（26-40dB HL），中度（41-60dB HL），重度（61-80dBHL），極重度（≥81dBHL）[9]。

2.3DNA提取

選用EDTA-K2真空抗凝管采集所有受試者的外周血2-3m l，按照QIAamp DNA（德國QIAGEN公司）抽提試劑盒的操作步驟說明書提取DNA。利用Nanodrop 2000對提取的DNA進行純度及濃度檢測，并稀釋備用。

2.4方法驗證

利用已建立的探針熔解曲線技術及繪制的標準曲線，分析所有受試者的GJB2基因常見的四種突變；并運用ABI3130DNA全自動測序儀，按照文獻報道方法[8]對GJB2基因進行直接測序，所得結果與探針熔解曲線技術分析結果進行比對驗證。

3　結果

3.1方法驗證的結果

建立了GJB2基因4個突變位點的標準熔解曲線，利用Tm值的不同，成功的完成基因突變篩查（圖1B）。138例正常人群中檢出2例攜帶235delC雜合突變。113例非綜合征型遺傳性耳聾患者中檢出22例突變，其中1例176_191del16突變，16例235delC突變，3例299_300delAT突變及2例235delC與299_ 300delAT復合雜合突變。家系1與家系2均檢測出GJB2基因突變（表1）。利用直接測序技術對所有受試者進行復檢，結果與探針熔解曲線技術所得結果均一致（圖1C）。

3.2家系分析的結果

家系1先證者（II-1）檢出235delC純合突變（表1），雙耳聽力損失均在80dBHL以上。按照世界衛(wèi)生組織（WHO-1997）聽力殘疾分級標準[9]可知，聽力損失≥81dBHL屬于極重度耳聾，家系1先證者（II-1）佩戴助聽器后顯示左耳平均助聽聽閾約54dB，右耳平均助聽聽閾約48dB（圖3）；其妹妹（II-2）同為235delC純合突變，也表現(xiàn)為雙耳極重度感音神經性耳聾；其父母均為235delC雜合突變，臨床表型正常。家系2先證者（II-1）為235delC/299_300delAT雙重雜合突變，雙耳聽力損失在90dBHL以上，為極重度感音神經性耳聾；其父母臨床表型正常，分別攜帶235delC雜合突變與299_300delAT雜合突變（表1）。

4　討論

耳聾是人類生活中常見的致殘性疾病，約60%由遺傳因素導致[1]，其中GJB2基因突變最常見，我國GJB2基因的突變率可達約20%[5]。本研究中GJB2基因在非綜合征型遺傳性耳聾患者中檢出率為19.4%。目前我國 GJB2基因有 35delG，176_ 191del16，235delC及299_300delAT四種常見的突變，其中235delC最常見[1,4]，常常導致雙耳極重度感音神經性耳聾[5]；兩個家系I-1與I-2均為235delC或者299_300delAT單純雜合突變，其臨床表型正常；而先證者為純合突變或復合雜合突變，聽力檢測均為雙耳極重度耳聾。GJB2基因單純雜合突變一般不致病但能增加致聾風險。Abe等[10]2001年報道在23個mtD?NA 12SrRNA的1555A>G突變的遲發(fā)型漸進性日本耳聾家系中發(fā)現(xiàn)8個家系攜帶GJB2基因突變，提出GJB2基因突變是除氨基糖苷類抗生素外，另一個促進聽力損失的重要因素，可見對耳聾患者的GJB2基因篩查是十分重要的。本研究家系1先證者（II-1）在1歲時發(fā)現(xiàn)聽力受損選擇佩戴助聽器補償聽力，左耳平均聽閾約由93dB補償為54dB，右耳平均聽閾約由90dB補償為48dB；聽力由最初的極重度轉為中度聽力受損（圖3），使患者能夠聽到部分語音，一定程度幫助患者語言學習，減小聽力損失對語言發(fā)育及心智成長的影響。由于助聽器對極重度耳聾治療效果較差，對于該類患者國內外首選人工耳蝸植入治療，尤其是GJB2基因突變[11,12]。Green等研究美國92例接受人工耳蝸植入及與GJB2基因相關的先天性聾兒，認為GJB2基因突變致聾進行人工耳蝸植入康復效果優(yōu)于其他先天性耳聾及非接受人工耳蝸植入治療的患者[11]。我國學者也提出GJB2基因相關性耳聾人工耳蝸植入效果優(yōu)于非GJB2基因相關性耳聾，其平均助聽聽閾可達30.1±4.2 dB[12]，能夠使患者獲得較好的聽力補償。

本研究利用普通的TaqMan探針基于熒光PCR平臺成功建立了探針熔解曲線技術，并快速準確的分析GJB2基因4個突變位點，結果與測序分析一致。熔解曲線分析技術早在上個世紀70年代已被提出[13]，其利用染料或者探針分析不同雙鏈DNA的解鏈溫度（Tm），從而快速準確的獲得基因分型[7]。染料熔解曲線法是選用SYBRGreen I或者LCGreen Plus熒光染料進行已知或者未知基因篩查[14]；其中SYBR Green I為傳統(tǒng)的不飽和染料，在DNA雙鏈解鏈過程中易發(fā)生重排造成結果失真；并且分辨率較低，只能檢測小片段的變異[14,15]；相反，LCGreen Plus等飽和染料為高分辨率染料，能分辨相差1bp的純合子與雜合子[14]。染料能與所有雙鏈DNA結合，無特異性，不能精確定位基因變化位置；然而探針熔解曲線法將染料改為熒光探針，探針能與DNA序列特異性結合，加上不同熒光染料標記，即可充分利用熒光PCR儀的通道實現(xiàn)多基因多突變的定性檢測[7]。近幾年探針熔解曲線法已逐漸應用于臨床疾病的檢測中，現(xiàn)已能利用熒光PCR所有通道快速檢測G6PD基因16個突變位點[16]，β-地中海的24個突變位點[17]等等。Sanger測序技術是基因診斷的金標準，但由于其儀器昂貴，耗時長，需經過2次PCR反應2次純化等繁瑣的步驟，一直難以在臨床普及，特別是基層醫(yī)院。本研究利用普通的熒光PCR儀器，成本較低，且只需一次PCR反應，3h內即可完成結果分析。經實驗驗證，該技術分析結果與Sanger測序技術分析結果基本一致，但比測序技術更省錢，省時，省力，更易于在臨床普及，是一種快速準確的基因篩查及基因分型技術。

表1　非綜合征型遺傳性耳聾家系分析

1Dai P,Yu F,Han B,etal.The prevalence of the 235delCGJB2mu?tation in a Chinese deaf population.[J].Genet Med,2007,9(5): 283-289.

2Maeda Y,Fukushima K,Nishizaki K,etal.In vitro and in vivo sup?pression ofGJB2 expression by RNA interference.[J].Hum MolGen?et,2005,14(12):1641-1650.

3Kelsell D P,Dunlop J,Stevens H P,et al.Connexin 26mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness.[J].Nature,1997, 387(6628):80-83.

4Dai P,Yu F,Han B,et al.GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chi?nese patients with nonsyndromic hearing impairment.[J].J Transl Med,2009,7:26.

5代志瑤,孫寶春,黃莎莎,等.GJB2基因聽力學表型與基因型關系分析[J].中華耳科學雜志,2014,12(1):34-36.

6Shearer A E,Deluca A P,Hildebrand M S,etal.Comprehensive ge?netic testing for hereditary hearing loss usingmassively parallel se?quencing.[J].Proc Natl Acad SciUSA,2010,107(49):21104-21109.

7Huang Q,Liu Z,Liao Y,etal.Multiplex fluorescencemelting curve analysis for mutation detection with dual-labeled,self-quenched probes.[J].PLoSOne,2011,6(4):e19206.

8項延包,沈姍姍,林一,等.常染色體隱性遺傳耳聾家系的診斷和產前診斷[J].中華耳科學雜志,2012,10(3):360-363.

9孫喜斌.第二次全國殘疾人抽樣調查聽力殘疾標準的制定[J].中國聽力語言康復科學雜志,2007(1):10-13.

10 Abe S,Kelley PM,KimberlingW J,et al.Connexin 26 gene(GJB2) mutation modulates the severity of hearing loss associated with the 1555A>G mitochondrialmutation.[J].Am JMed Genet,2001,103 (4):334-338.

11Green G E,Scott D A,Mcdonald JM,etal.Performance of cochlear implant recipientswith GJB2-related deafness.[J].Am JMed Genet, 2002,109(3):167-170.

12蔡超嬋,黃莎莎,高雪,等.GJB2相關非綜合征性感音神經性聾人工耳蝸植入后的療效觀察[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2014,28(13):972-974.

13Guttmann T,Vitek A,Pivec L.High resolution thermal denaturation ofmammalian DNAs.[J].Nucleic Acids Res,1977,4(2):285-297.

14 Montgomery J,Wittwer C T,Palais R,et al.Simultaneousmutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. [J].NatProtoc,2007,2(1):59-66.

15 Herrmann M G,Durtschi JD,Bromley L K,et al.Amplicon DNA melting analysis formutation scanning and genotyping:cross-plat?form comparison of instruments and dyes.[J].Clin Chem,2006,52 (3):494-503.

16嚴提珍,鐘青燕,唐寧,等.多色探針熒光PCR熔解曲線法在G6PD基因突變檢測中的臨床應用評價[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2014,31(2):156-162.

17 Xiong F,Huang Q,Chen X,et al.A melting curve analysis--based PCR assay for one-step genotyping of beta-thalassemiamutations a multicenter validation.[J].JMolDiagn,2011,13(4):427-435.

Diagnosisof hereditary deafessw ith GJB2 genemutationsbased on TaqM an probemelting curve technology

GAOHui1,LIU Jingjing2,SHENShanshan1,LIANGShaoming2,WEILingeng2,LIFangfang1,WANGShayan1
1Second clinicalmedical collegeof Jinan University,Shenzhen People'sHospital,Shenzhen 518020,China
2Yaneng Bioscience(Shenzhen)Co.ltd.Shenzhen 518133,China
Corresponding author:WANGShayan.E-mail:shayanw@yahoo.com

Objective To establish a quick and reliable TaqMan probe melting curve technology to be used for analyzing the GJB2 gene in patientsw ith non-syndrom ic hearing impairment(NSHⅠ).M ethods Standard sampleswere prepared to establish the TaqMan probemelting curve technology based on qPCR.Samples were then collected from 138 normal individuals,113 patients and 2 fam iliesw ith NSHⅠto test 35delG,176_ 191del16,235delC,299_300delATmutationsof the GJB2 gene using the TaqMan probemelting curve technology.Test resultswere verified by direct DNA sequencing.Result Two of the 138 normal individuals,22 of the 113NSHⅠpatientsand both NSHⅠfamilieswere shown to carry GJB2 genemutations.All resultswere consistentw ith those by directDNA sequencing.Conclusion A quick and reliable TaqMan probemelting curve technology hasbeen established and shown to be capableof detecting 4mutationsof theGJB2 gene.

hereditary deafness;TaqMan probe;melting curve;GJB2 gene

R394.34

A

1672-2922（2015）03-541-04

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.03.037

2013年深圳市戰(zhàn)略新興產業(yè)發(fā)展專項資金（CXZZ20130517143111780）

高慧，碩士研究生，研究方向：醫(yī)學遺傳學。

王沙燕，E-mail：shayanw@yahoo.com

2015-5-6 審核人：郭維維)