李鳳蘭，楊佳年，何 珺*

(1.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

槐角為豆科(Leguminosae)植物槐(Sophora japonica Linn.)開(kāi)花生成的熟果實(shí)。槐角含有大量黃酮成分，主要有蕓香苷、槲皮素苷、異鼠李素苷、染料木苷、山奈素苷等黃酮類(lèi)物質(zhì)。具有抗癌、抗氧化、保護(hù)中樞神經(jīng)、保護(hù)心血管、抗菌降血糖等多種藥理作用［1］-［7］。

槐樹(shù)在全國(guó)各處均有分布，中藥槐角產(chǎn)量十分豐富。國(guó)內(nèi)目前上市制劑只有槐角丸和地榆槐角丸兩種，因此其綜合開(kāi)發(fā)利用不高。已有文獻(xiàn)報(bào)道HPLC法測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)間蘆丁和槐角苷的含量［8］，元琦等建立了一種β-環(huán)糊精修飾區(qū)帶毛細(xì)管電泳法內(nèi)標(biāo)定量分析槐角樣品中染料木甙、染料木素、山奈素、槲皮素和蘆丁5種黃酮類(lèi)化合物的方法［9］，但用HPLC法同時(shí)測(cè)定不同生長(zhǎng)期槐角中槲皮素、染料木素、山奈素、異鼠李素的含量國(guó)內(nèi)(外)文獻(xiàn)沒(méi)有報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)采用酸水解法水解槐角中槲皮素醇苷、染料木素醇苷、山奈素醇苷、異鼠李素醇苷為苷元，并測(cè)定其含量生長(zhǎng)變化規(guī)律，由此為根據(jù)可為槐角藥材分離4種不同黃酮苷元物質(zhì)確定最佳的采收期，為科學(xué)利用現(xiàn)有槐角資源提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

槐花及槐角，采自山西省運(yùn)城市，經(jīng)貴州大學(xué)藥學(xué)院郁建平教授鑒定為豆科植物槐的花及果實(shí)，生長(zhǎng)周期時(shí)間為2013年間6月15日至12月1日，采樣自5棵槐樹(shù)上有槐花苞開(kāi)始，每15天采樣1次，樣品均80℃烘干，粉碎后過(guò)80目篩后備用。

1.2 儀器

分析型HPLC:Agilent Technology(1100series)，US，C18高效液相色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋:HH.SY21-Ni6(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);超聲波清洗器:SG2200HE(上海冠特超聲儀器公司);電子天平:BSA124S(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);其他為一般常規(guī)儀器。

1.3 試劑

槲皮素(Sigma公司，批號(hào) Q0125，純度 ＞97%)，染料木素(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)10080307，純度＞97%)，山奈素(上海同田生物技術(shù)有限公司，純度98%批號(hào):10051321)，異鼠李素(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào) 10041206，純度＞98%)，濃鹽酸(分析純，重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠)，甲醇(分析純，上海振興化工一廠)，無(wú)水乙醇(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)，冰醋酸(重慶川江化學(xué)試劑廠)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜條件［10］:Hypersil C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流速:0.8 mL.min-1;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)儀;波長(zhǎng):360 nm;柱溫:35℃;進(jìn)樣體積:10 μL;流動(dòng)相:甲醇-水-磷酸(470∶530∶0.3)。以峰面積為定量依據(jù)。在此色譜條件下，分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，確定四種黃酮苷元保留時(shí)間，對(duì)照品和供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 4種黃酮苷元混合對(duì)照品HPLC圖譜Fig.1 The HPLC chromatograms offlavonoid aglycones

圖2 12月槐角樣品HPLC圖譜Fig.2 The HPLC chromatograms of test sample

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取槲皮素、染料木素、山奈素、異鼠李素各5 mg于100 mL的棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解配制為對(duì)照品母液。

1.4.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取槐角粉末50 mg置于10 mL試管中，加入水解液(甲醇-水-鹽酸:5∶3.5∶1.5)10 mL，置68℃水浴加熱3 h，取出冷卻至室溫，搖勻，用微孔濾膜濾過(guò)，取10 μL濾液上機(jī)測(cè)定。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取對(duì)照品的混合溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在2.1條件下測(cè)定色譜峰面積，以峰面積積分均值對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸(n=6)，結(jié)果見(jiàn)表1?？芍摲椒ㄋ鶞y(cè)樣品線性良好。

1.4.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果槲皮素、染料木素、山奈素和異鼠李素峰面積的 RSD分別為:1.03%、0.89%、0.62%、1.23%，表明進(jìn)樣精密度良好。

表1 4種組分工作曲線Tab.1 The working curve of four different compounds

1.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取同一樣品5份，按2.3項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液，HPLC法測(cè)定4種黃酮苷元的峰面積，計(jì)算平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.62%、1.89%、3.10%、0.73%，RSD 分別為:0.37%、1.42%、0.74%、1.24%。表明該供試品溶液重復(fù)性良好。

1.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于 0、4、8、12、24 h 測(cè)定，4 組分峰面積積分值的RSD分別為:1.31%、0.57%、1.21%、1.40%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.4.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量批槐角10份，分別加入不同添加量的槲皮素、染料木素、山奈素、異鼠李素，按2.3方法制備后，各份均在2.1條件下進(jìn)行測(cè)定，4種組分的平均回收率分別為 99.01%、98.24%、98.35%、97.79%，RSD 分別為 0.68% 、1.02% 、1.18% 、0.68% 。

2 結(jié)果與分析

2.1 不周生長(zhǎng)周期槐角樣品中4種黃酮苷元的變化

精密稱(chēng)取5個(gè)1.1項(xiàng)下不同槐樹(shù)生長(zhǎng)同期樣品平行三份，按1.4.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按1.4.1方法上機(jī)測(cè)定，取平均值，結(jié)果如下:

圖3 不同生長(zhǎng)期槐角中槲皮素含量(n=3)Fig.3 Thecontent of Quercetin in different growth periods

由圖3可知，槐角中槲皮素在7月初含量最高，此時(shí)花蕾飽滿，少數(shù)花蕾吐出花舌，槲皮素平均含量為12.4%，即為槐米采摘時(shí)節(jié)，然后隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)其含量逐漸減低，待槐角成熟后，其含量小于1.2%。

由圖4可知，染料木素在八月中旬，即開(kāi)花期產(chǎn)生，隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其含量逐漸增高，到10月中旬直至槐角采收的12月初含量趨向穩(wěn)定，平均含量約為5.6%，就單顆槐角染料木素含量而言，12月采摘最合適。

圖4 不同生長(zhǎng)期槐角中染料木素含量(n=3)Fig.4 Thecontent of genistein in different growth periods

圖5 不同生長(zhǎng)期槐角中山奈素含量(n=3)Fig.5 The content of kaempferol in different growth periods

由圖5可知，山奈素含量先升高，在八月中旬達(dá)到最大值，平均含量為6.2%，然后隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減低，到10月中旬趨向穩(wěn)定，平均含量約為3.0%。

圖6 不同生長(zhǎng)期槐角中異鼠李素含量(n=3)Fig.6 Thecontent of Isorhamnetin in different growth periods

由圖6可知，異鼠李素含量在7月初含量最高，約為1.3%，然后隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其含量逐漸降低至0.24%左右。

圖7 不同生長(zhǎng)期槐角中總黃酮含量(n=3)Fig.7 Thecontent of flavonol in different growth periods

由圖7可知，槐角中總黃酮含量在7月上旬和九月初含量最高，即開(kāi)花期和槐角生長(zhǎng)初期，含量大約為14%，然后隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮含量逐漸降低，槐角成熟期含量約為10%，因此就總黃酮而言，12月槐角成熟期采摘最好，因?yàn)榇藭r(shí)果實(shí)重量最大，槐角產(chǎn)量最高。

3 討論

3.1 槲皮素最佳采收期為7月初，此時(shí)花蕾飽滿，少數(shù)吐出花舌，因?yàn)榇藭r(shí)槐花中蘆丁含量最高，經(jīng)酸水解處理后，其苷元槲皮素含量最高。染料木素最佳采收期為12月初，此時(shí)槐角完全成熟染料木素單顆含量最高。山奈素最佳采收期為8月中旬，此時(shí)槐花凋謝槐角開(kāi)始生長(zhǎng)。而異鼠李素最佳采收期為7月初，在槐花開(kāi)放時(shí)含量最高。因此可見(jiàn)槐角生長(zhǎng)周期中4種黃酮苷元含量變化規(guī)律不同，可由此根據(jù)不同活性成分需求對(duì)槐角藥材進(jìn)行采收。

3.2 槐角中總黃酮苷元在開(kāi)花期和槐角生長(zhǎng)初期含量最高，大約為5.12% ～5.20%，開(kāi)花期以蘆丁即槲皮素苷為主要成分，槐角生長(zhǎng)初期山奈素醇苷含量最高，但此時(shí)槐角果實(shí)不飽滿，重量輕，黃酮總量小于成熟期槐角，綜合考慮，如以總黃酮為指標(biāo)采收槐角，則最佳采收期是12月初，此時(shí)槐角成熟，果實(shí)飽滿，單棵槐角總黃酮量達(dá)到最大。

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