劉振國，吉 挺*，沈 芳，梁 勤，羅岳雄

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009;2.福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)院，福州 350002;3.廣東昆蟲研究所，廣州 510260)

蜜蜂遺傳多樣性是研究蜜蜂遺傳資源的重要組成部分，遺傳多樣性的研究對(duì)于了解中華蜜蜂的起源和品種分化具有重要的參考價(jià)值，是品種資源評(píng)價(jià)、保護(hù)與利用必不可少的內(nèi)容。我國是世界上蜜蜂遺傳資源最為豐富的國家之一，擁有多樣性豐富的中華蜜蜂資源。和西方蜜蜂相比，中華蜜蜂具有抗病、抗逆性強(qiáng)、授粉植物種類多、養(yǎng)殖成本低和產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)等特點(diǎn)，是適應(yīng)于我國山地丘陵養(yǎng)殖的優(yōu)良蜂種(殷玲，2013)。然而由于長期以來保存不當(dāng)以及對(duì)外來品種的引進(jìn)，造成許多地區(qū)中華蜜蜂滅絕或群體規(guī)模急劇下降，很多中華蜜蜂的有利基因丟失。同時(shí)對(duì)于中華蜜蜂的起源與遺傳分化，學(xué)術(shù)界有著不同的結(jié)論(姜玉鎖，2007)。因此研究認(rèn)識(shí)中華蜜蜂遺傳多樣性及親緣關(guān)系是保護(hù)和利用中華蜜蜂種質(zhì)資源的前提，對(duì)于中華蜜蜂的起源進(jìn)化、種質(zhì)資源保護(hù)以及科學(xué)開發(fā)利用等研究都有重要的指導(dǎo)意義。

線粒體DNA(mtDNA)是細(xì)胞內(nèi)染色體以外唯一存在的遺傳物質(zhì)，分布于細(xì)胞胞質(zhì)中。mtDNA 作為分子標(biāo)記具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、嚴(yán)格的母系遺傳、無重組、與核基因無共同序列、進(jìn)化速率快、多拷貝及堿基替換率低等特點(diǎn)，可以從母系起源上確定品種間的遺傳關(guān)系(Gyllensten et al.，1991)。而蜜蜂作為一種群居的社會(huì)性昆蟲，蜂群內(nèi)所有工蜂均是同一個(gè)蜂王的后代，所以蜜蜂是mtDNA 研究中最好的模式生物之一。中華蜜蜂mtDNA 中tRNAleu-COⅡ區(qū)段包含有一個(gè)tRNAleu基因和一個(gè)非編碼區(qū)，其中后者為蜜蜂屬特有(Cornuet and Garnery，1991)。近年來利用mtDNA 的tRNAleu-COⅡ區(qū)段遺傳多態(tài)性來研究蜜蜂的起源分化受到更為廣泛的關(guān)注，成為研究蜜蜂遺傳變異的最佳手段之一。

本研究應(yīng)用mtDNAtRNAleu-COⅡ區(qū)段變異對(duì)我國境內(nèi)不同地區(qū)中華蜜蜂的遺傳多樣性和彼此之間的親緣關(guān)系進(jìn)行較全面的研究，分析中華蜜蜂資源的遺傳結(jié)構(gòu)，為中華蜜蜂地理種群遺傳多樣性提供分子數(shù)據(jù)資料，以期對(duì)這些群體間的遺傳分化有更好地了解。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所涉及的中華蜜蜂不同地理種群共20個(gè)，分布于我國18個(gè)省、市、自治區(qū)，基本涵蓋了現(xiàn)有中華蜜蜂的主要聚居區(qū)。樣本采集時(shí)間為2006年6月-2008年8月。采集蜂群呈野生或半野生狀態(tài)，每一個(gè)種群均隨機(jī)采集30 群樣本，其中隨機(jī)選擇10 群作為研究對(duì)象;每一個(gè)蜂群采集成年工蜂30 頭，隨機(jī)1 只工蜂作為試驗(yàn)材料。樣本采集后用無水乙醇?xì)⑺啦⒔萦? mL 離心管中，各種群采樣數(shù)及采樣地點(diǎn)見表1。

表1 20個(gè)中華蜜蜂地理種群樣本采集資料Table 1 Collecting data of 20 populations of Apis cerana cerana sampled from China

(續(xù)上表)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取

基因組DNA 提取參照吉挺等(2009)所建立的方法，提取的基因組DNA 用微量紫外可見光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)測(cè)定其含量與純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增采用了50 μL 的反應(yīng)體系，其中含有約200 ng 的基因組DNA，10×buffer 5.0 μL，200 μmol/L dNTPs 每種2 μL，10 pmol 正向引物1 μL，10 pmol 反向引物1 μL，5 U Taq DNA 聚合酶0.5 μL，加ddH2O 補(bǔ)足50 μL，最后用石蠟油1 滴封閉反應(yīng)系統(tǒng)。反應(yīng)程序如下:96℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性60 s，退火60 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸5 min。采用2%的瓊脂糖(美國FMC 公司)經(jīng)小量膠回收試劑盒(BBI，Canada)回收目的片段。

1.2.3 測(cè)序

分別取2.5-5.0 μL 回收產(chǎn)物用PCR 引物做測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序試劑采用Thermo Sequenase Cycle Squencing Kit(美國USB 公司)，按公司推薦的方法進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G250 柱(Sigma 公司)純化，真空干燥和變性后，使用LICOR 4200 DNA 自動(dòng)分析儀(LI-COR Biotechnology Division，Lincoln，NE)進(jìn)行序列分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法及軟件應(yīng)用

1.3.1 核苷酸序列多態(tài)性分析

核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)是衡量一個(gè)給定群體的mtDNA 多態(tài)性的更好的指標(biāo)，其定義為:給定群體內(nèi)隨機(jī)選取的mtDNA 序列間的平均每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸差異數(shù)目。π 值越小，群體的多樣性程度越低。利用DnaSP 4.0 軟件(Rozas et al.，2003)分析序列的多態(tài)性，并估計(jì)序列的變異程度、核苷酸替代率等。

1.3.2 單倍型間的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)原始序列利用LI-COR Align IR 軟件進(jìn)行多重比對(duì)后，利用 DnaSP 4.0 軟件(Badiou，2008)提取變異位點(diǎn)序列，合并單倍型;利用MEGA 3.1(Kumar et al.，2004)構(gòu)建COⅡ序列的NJ(neighbor-joining method，鄰結(jié)法)、ME(minimum evolution method，最小進(jìn)化法)及UPGMA(unweighted pair group method with arithmetric means，類平均法)分子系統(tǒng)樹;利用MEGA 3.1 計(jì)算基于Kimura 雙參數(shù)模型的遺傳距離，分析它們的起源及系統(tǒng)進(jìn)化。用Arlequin 3.0軟件(Excoffier et al.，2005)中的AMOVA 計(jì)算群體間的分化水平(Fst)。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅡ基因片段的測(cè)序和序列分析

用751GD 型紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA 濃度和純度，根據(jù)檢測(cè)的DNA 濃度將提取的DNA 稀釋到100 ng/μL。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片斷大小為480 bp 左右，部分PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The result of detecting production of PCR by 1.5% agarose gel

本次試驗(yàn)測(cè)定了20個(gè)中華蜜蜂地理種群共200個(gè)體的線粒體tRNAleu-COⅡ之間部分序列。對(duì)COⅡ基因序列截取1-259 bp 進(jìn)行分析比較，變異位點(diǎn)為16個(gè)，變異率為6.18%，突變總數(shù)為18。其中單一多肽位點(diǎn)5個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)11個(gè)。16個(gè)變異位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)為15個(gè)，顛換位點(diǎn)為1個(gè)，沒有發(fā)現(xiàn)缺失和插入想象。在堿基組成上，A、C、G、T 這4種核苷酸的平均比例分別為38.2%(37.8%-38.6%)、10.0%(9.7%-10.4%)、4.6%(4.2%-5.0%)和 47.1%(46.7%-47.5%)。A+T 含量85.6%，G+C 含量14.6%。A+T 含量明顯高于G+C 含量，說明中華蜜蜂線粒體DNA COⅡ基因部分序列富含A+T，表現(xiàn)出堿基組成的偏倚性。

2.2 單倍型、核苷酸多樣度及中性檢驗(yàn)分析

20個(gè)群體中共檢測(cè)到 18種單倍型(Haplotypes)，分別命名為H1-H18。18種單倍型中，H1、H2、H6、H7、H13 等5種為共享單倍型，H2 包含的個(gè)體數(shù)最多，共出現(xiàn)120 次，分布于18個(gè)中華蜜蜂地理種群中，為各種群的主體單倍型，占個(gè)體樣本的60%。其余如下:H1 出現(xiàn)8 次(分布于3個(gè)中華蜜蜂地理種群中)、H6 出現(xiàn)21 次、H7 出現(xiàn)13 次、H13 出現(xiàn)11 次。其它13個(gè)單倍型均為各種群所特有。各種群之間單倍型類型和數(shù)目有差異，本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的200 條序列中，武定中蜂和澧縣中蜂單倍型類型最多(4種)，北京中蜂、天水中蜂和長白山中蜂單倍型類型最少(1種)。在20個(gè)中華蜜蜂地理種群中，迪慶中蜂、西雙版納蜜蜂、阿壩中蜂、從化中蜂、南寧中蜂興城中蜂、秦嶺中蜂、西藏中蜂、黃山中蜂、南昌中蜂和宜興中蜂與其他種群有2種共享單倍型，其余種群間有1種共享單倍型。

總種群?jiǎn)伪缎投鄻佣?haplotype diversity，Hd)為 0.621，核苷酸多樣度(nucleotide diversity，Pi)為0.851%，核苷酸平均差異數(shù)(average number ofnucleotide differences，K)為0.939，核苷酸分歧度在0-0.965%變化。不同地理種群的單倍型多樣度在0-0.778，核苷酸多樣度在0-0.684%范圍內(nèi)。

20個(gè)中華蜜蜂地理種群中性檢驗(yàn)，對(duì)測(cè)定的20個(gè)中華蜜蜂地理種群CO Ⅱ基因序列采用Tajima's D 值進(jìn)行中性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)的前提是假設(shè)群體在長期進(jìn)化過程中處于突變-漂移平衡狀態(tài);所有的核苷酸都是等概率突變，而且受制于同一個(gè)群體動(dòng)力學(xué)(Guez and Miller，2008)。20個(gè)群體中性檢驗(yàn)的Tajima's D 值表明(表2)，所有群體中性檢驗(yàn)的Tajima's D 值介于:-1.63600 和1.46364 之間，經(jīng)檢驗(yàn)均不顯著(P＞0.05)，符合中性突變。

表2 20個(gè)中華蜜蜂種群體內(nèi)COⅡ序列單倍型、核苷酸多樣性分析及Tajima's D 中性檢驗(yàn)核苷酸多態(tài)性Table 2 COⅡhaplotype diversity，nucleotide diversity and Tajima's D neutrality test in different populations of 20 Apis cerena populations

2.3 COⅡ序列的分子系統(tǒng)樹

利用MEGA 3.1 軟件選擇Kimura 雙參數(shù)模型，分別構(gòu)建了20個(gè)中華蜜蜂地理種群COⅡ基因的NJ、ME 和UPGMA 聚類圖(見圖2，3，4)。在所有的聚類圖中，UPGMA 分子系統(tǒng)樹與其他兩種分子系統(tǒng)樹的部分系統(tǒng)分枝存在差異，ME 和NJ聚類圖的結(jié)果完全一致。結(jié)果表明20個(gè)中華蜜蜂地理種群存在復(fù)雜的起源系統(tǒng)。

2.4 20個(gè)東方蜜蜂地理種群遺傳距離

東方蜜蜂地理種群間Kimura 雙參數(shù)距離見表3，可以看出各種群間遺傳距離變異范圍為0.000-0.011。阿壩中蜂與北京中蜂;天水中蜂、從化中蜂與長白山中蜂之間;北京中蜂與天水中蜂、長白山中蜂從化中蜂與武夷中蜂之間的遺傳距離最近，雙參數(shù)距離值為0;武定中蜂與海南中蜂和南昌中蜂之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，雙參數(shù)距離值均為0.011。從總體上，阿壩中蜂、北京中蜂等與其他品種的遺傳距離都較近，而武定中蜂與其它地方品種的遺傳距離都較遠(yuǎn)。

圖2 20個(gè)中華蜜蜂地理種群mtDNA COⅡ序列NJ 分子系統(tǒng)樹Fig.2 NJ tree of mtDNA COⅡsequences in 20 Apis cerena populations

圖3 20個(gè)中華蜜蜂地理種群mtDNA COⅡ序列ME分子系統(tǒng)樹Fig.3 ME tree of mtDNA COⅡsequences in 20 Apis cerena populations

2.5 不同地理種群遺傳多樣性及遺傳分化分析

對(duì)mtDNA COⅡ序列的變異進(jìn)行分子方差分析，總方差剖分為群體間的方差(Va)和群體內(nèi)的方差(Vb)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。表4 所示，本試驗(yàn)中，20個(gè)中華蜜蜂地理種群mtDNA COⅡ基因序列群體間的(Va)的方差組分占總變異的49.77%，群體內(nèi)的方差組分(Vb)占總變異的50.22%。Fst=0.49788，差異極顯著(P＜0.001)，表明20個(gè)中華蜜蜂不同地理種群間存在顯著的遺傳分化。

圖4 20個(gè)中華蜜蜂地理種群mtDNA COⅡ序列UPGMA 分子系統(tǒng)樹Fig.4 UPGMA tree of mtDNA COⅡsequences in 20 Apis cerena populations

對(duì)20個(gè)種群的遺傳分化作進(jìn)一步分析，計(jì)算群體間的Fst 和相應(yīng)的Fst P 值，結(jié)果見表3，武定中蜂與其他19個(gè)種群間Fst 值差異極顯著(P＜0.01);宜興中蜂除與西藏中蜂間Fst 值差異不顯著(P=0.13514)外，與其他18個(gè)群體間Fst 值差異均極顯著(P＜0.01);其余群體間Fst值差異均有分布。

表4 20個(gè)中華蜜蜂地理種群mtDNA COⅡ序列變異的分子方差分析Table 4 The hierarchical components of mtDNA variation analysis of Molecular Variance of COⅡamong 20 Apis cerena populations

3 結(jié)論與討論

3.1 20個(gè)地理種群mtDNA COⅡ的遺傳多態(tài)性

在使用mtDNA 對(duì)中華蜜蜂遺傳多樣性研究中，同類研究者均僅使用單倍型分析的方法對(duì)不同地理種群(型)進(jìn)行聚類，普遍認(rèn)為在同一采樣點(diǎn)的不同蜂群其mtDNA 中tRNAleu-COⅡ片段的核苷酸序列完全相同(王桂芝，2007)，甚至認(rèn)為地理位置相距遙遠(yuǎn)的地區(qū)，如山西和河南，該片斷的核苷酸序列也是完全相同的(Excoffier et al.，2005)。本研究結(jié)果表明，即使在同一地區(qū)所采集的不同群體的樣本，有可能出現(xiàn)mtDNA 序列差異的情況，甚至部分地區(qū)樣本多態(tài)性較豐富，如武定中蜂和澧縣中蜂COⅡ基因單倍型類型就較多，達(dá)到4個(gè)。所以僅以判斷同一地理種群對(duì)應(yīng)唯一單倍型進(jìn)行聚類分析，結(jié)果必然是不全面的。

本研究測(cè)定了我國境內(nèi)20個(gè)地理種群的mtDNA COⅡ片段的核在對(duì)COⅡ基因研究中，截取1-259 bp 進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂mtDNA COⅡ部分序列富含A+T，表現(xiàn)出堿基組成的偏倚性，符合前人對(duì)mtRNA 的研究結(jié)果(謝進(jìn)金等，2001)。蜜蜂mtDNA 中A+T 含量偏高的原因尚不清楚，但是有些自然突變進(jìn)程有利于A+T 偏高的形成，例如鳥嘌呤傾向于通過堿化而轉(zhuǎn)變成O6-甲基鳥嘌呤，再與胸腺嘧啶錯(cuò)配，導(dǎo)致GC 堿基對(duì)被AT 堿基對(duì)取代，線粒體內(nèi)能產(chǎn)生內(nèi)源性堿化劑，并且昆蟲的DNA 甲基修復(fù)轉(zhuǎn)移酶進(jìn)入線粒體的效率比較低(譚墾等，2004)。

20個(gè)種群的核苷酸差異數(shù)為的平均值為0.939，核苷酸分歧度(Dxy)在0.1%-0.965%之間變化，說明不同種群之間核苷酸分歧度很大;核苷酸遺傳距離為-0.007%～1.489%，核苷酸遺傳距離差異也很大。20個(gè)中華蜜蜂地理種群COⅡ序列群體間的(Va)的方差組分占總變異為49.77%，F(xiàn)st 分為0.4978，差異均極顯著(P＜0.001)，進(jìn)一步表明20個(gè)中華蜜蜂不同地理種群間存在顯著的遺傳分化。

所測(cè)種群中共檢測(cè)到18種單倍型，其中5種為共享單倍型，其它13個(gè)單倍型均為各群體所特有，單倍型H2 包含的個(gè)體最多，共出現(xiàn)120 次，包含了本研究20個(gè)群體中的18個(gè)(武定中蜂與海南中蜂不在此列)。各群體之間單倍型類型和數(shù)目有差異，這是其它中華蜜蜂mtDNA 研究中沒有涉及的。結(jié)果表明，武定中蜂和醴縣中蜂單倍型類型最多，均各為4個(gè)，長白山中蜂的單倍型類型最少，分別為1個(gè)和2個(gè)。單倍型的類型也反映了群體的來源是否復(fù)雜，表明武定中蜂和醴縣中蜂具有較高的遺傳多樣性，而長白山中蜂的遺傳多樣性最低。

在對(duì)COⅡ基因研究中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)變異位點(diǎn)，約占分析位點(diǎn)總數(shù)的6.18%，其中單一多態(tài)位點(diǎn)5個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)11個(gè)。沒有觀測(cè)到插入/缺失。核苷酸位點(diǎn)有兩種類型的變異，即轉(zhuǎn)換和顛換，16個(gè)變異位點(diǎn)中，其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)15個(gè)，占93.8%，顛換的位點(diǎn)1個(gè)，占6.2%，顛換和轉(zhuǎn)換之比為0.07。20個(gè)地理種群中只有武定中蜂、海南中蜂和南昌中蜂觀察到顛換現(xiàn)象。本研究結(jié)果與一些其他蜜蜂mtDNA 的報(bào)道也相符(Garnery et al.，1993;譚墾等，2004)，這也與mtDNA 進(jìn)化的特點(diǎn)一致。另外，本研究測(cè)定的變異率分別為6.18%，高于先前國內(nèi)一些關(guān)于中華蜜蜂mtDNA 多態(tài)性的研究，這可能是由于本研究中涵蓋了我國境內(nèi)絕大多數(shù)地理種群，相對(duì)他們的研究更為系統(tǒng)與全面。

3.2 地理距離與群體間mtDNA 遺傳距離的關(guān)系

mtDNA 是母系遺傳和非重組的，分子的各部分均共享同一祖先的相同歷史模式，因此可以在一定層次上了解蜜蜂不同地理種群的遺傳多樣性，還可以探討形成特定遺傳結(jié)構(gòu)的歷史原因和地理原因(張亞平和施立明，1992)。很多研究結(jié)果都表明種群地理分布格局同地理隔離存在一定的相關(guān)性。

地理地貌的隔離一般會(huì)使地理種群間基因流動(dòng)受到限制，從而促使地理種群的形成。但本研究選擇Kimura 雙參數(shù)模型構(gòu)建的我國20個(gè)中華蜜蜂地理種群COⅡ區(qū)的NJ、ME 和UPGMA 聚類圖中，聚類結(jié)果并沒有依照地理位置的遠(yuǎn)近而相應(yīng)聚在一起，也充分說明了群體間遺傳距離與地理距離之間并不存在顯著關(guān)聯(lián)，各自的地理分布并不是影響其群體遺傳結(jié)構(gòu)的決定因素。可能的原因是由于自然的選擇使不同地區(qū)蜜蜂間基因交流頻繁，從而使地理因素的影響微乎其微。

3.3 中華蜜蜂種群的起源

雖然對(duì)中華蜜蜂的分類多有爭(zhēng)論，但一般都認(rèn)為中華蜜蜂包括了4-5個(gè)不同的亞種及多個(gè)不同的生態(tài)型，同時(shí)也認(rèn)為中華蜜蜂都屬于亞洲大陸類型，相對(duì)于海島類型(日本蜜蜂、菲律賓蜜蜂等)，與印度蜜蜂同一個(gè)起源(龔一飛和張其康，2000;陳盛祿，2001)。姜玉鎖通過對(duì)部分中華蜜蜂mtDNA tRNAleu-COⅡ片段的核苷酸序列的分析，將長白山中蜂與海南中蜂列入新的亞種之列(姜玉鎖等，2007)。但本研究選擇Kimura 雙參數(shù)模型構(gòu)建的20個(gè)中華蜜蜂COⅡ區(qū)的NJ、ME和UPGMA 聚類圖中，聚類結(jié)果與已有研究大相徑庭，不能支持各蜜蜂分類學(xué)家的現(xiàn)有的結(jié)論。

從本研究結(jié)果分析，各地理種群間顯示出多個(gè)復(fù)雜的起源，可以推斷中華蜜蜂的來源應(yīng)是多樣的，并且在種群形成的過程中，多個(gè)起源相互融合。具體分析有以下幾點(diǎn)原因:

中華蜜蜂多是以野生或半野生為主，大規(guī)模的商業(yè)育王和轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)從未進(jìn)行，這使得各地的中華蜜蜂都保持了相對(duì)原始的狀態(tài);蜜蜂普遍具有較強(qiáng)的遷徙能力，特別是中華蜜蜂，所以在遺傳分化過程中，不同類群間的基因交流甚至基因融合都完全是可能的。

對(duì)于蜜蜂而言，mtDNA 相對(duì)要保守的多，mtDNA 上的變異主要體現(xiàn)在種與亞種上的變化，而對(duì)于亞種下的地理種群，變異并不明顯，這也是王桂芝(2007)、姜玉鎖(2007)得出同一地點(diǎn)采樣，單倍型完全相同的原因之一。所以通過對(duì)mtDNA 序列多態(tài)性的聚類往往不能反映群體間真實(shí)的親緣關(guān)系。

相對(duì)某些研究而言，本研究取樣廣泛，同時(shí)每個(gè)地區(qū)都采集相當(dāng)數(shù)量的樣并對(duì)其中的10個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序分析，但是否樣本量仍嫌不夠，尚需進(jìn)一步分析。同時(shí)，本研究選擇的是蜜蜂mtDNA中一小段核苷酸進(jìn)行分析，并不能完全代表整個(gè)線粒體變異水平，如果要得到全面的結(jié)論，蜜蜂線粒體全基因測(cè)序應(yīng)是更好的選擇。

本研究認(rèn)為，線粒體遺傳差異的結(jié)果往往是由于某些地理種群在獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境下發(fā)生的。遺傳分化僅僅是地理種群間的差異，并沒發(fā)生亞種水平的分化，中華蜜蜂存在著復(fù)雜的起源。任何定義某一地區(qū)中華蜜蜂種群為亞種的結(jié)論很難成立。正因?yàn)檫z傳差異是各地理種群在獨(dú)特生態(tài)環(huán)境下不斷適應(yīng)和進(jìn)化而產(chǎn)生的，這也就提醒我們?cè)谥腥A蜜蜂資源保護(hù)與利用時(shí)，一定要重視挖掘各地理種群存在的有益基因。

References)

Badiou A，Meled M，Belzunces LP.Honeybee Apis mellifera acetylcholinesterase-a biomarker to detect deltamethrin exposure［J］.Ecotoxicol.Environ.Saf.，2008，69(2):246-53.

Chen SL.Chinese Bee［M］.Beijing:China Agriculture Press［M］.2001，687-688.［陳盛祿.中國蜜蜂學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001，687-688］

Cornuet JM，Garnery L.Mitochondrial DNA variability in honeybees and its phylogeographic implications［J］.Apidoloqie，1991，22(6):627-628.

Excoffier L，Laval G，Schneider S.Arlequin(Ver.3.0):An integrated software package for population genetics data analysis［J］.Evolutionary Bioinformatics Online，2005，1:47-50.

Garnery L，Solignac M，Celebrano G，et al.A simple test using restricted PCR-amplied mitochondrial DNA to study the genetic structure of Apis mellifera L.［J］.Experientia，1993，49:1016-1021.

Gong YF，Zhang QK.Classification and Evolution of Bee［M］.Fuzhou:Fujian Science and Technology Press，2000，231-232.［龔一飛，張其康.蜜蜂分類與進(jìn)化［M］.福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社，2000，231-232］

Guez D，Miller RR.Blocking and pseudoblocking:the reply ofrattus norvegicus to Apis mellifera［J］.Quarterly Journal of Experimental Psychology，2008，61(8):1186-98.

Gyllensten U，Wharton D，Josefsson A，et al.Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice［J］.Nature，1991，352:255-257.

Jang YS，Liu WZ，Zhang CX，et al.AFLP analysis of genetic diversity of Apis cerana Fabricius distributed in different geographic areas in China［J］.Acta Entomologica Sinica，2007，50(2):144-152.［姜玉鎖，劉文忠，張春香，等.中國境內(nèi)不同地理型東方蜜蜂遺傳多樣性的AFLP 分析［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2007，50(2):144-152］

Jang YS，Zhao HT，Jang JB，et al.Studies on mtDNA tRNAleu-COⅡGene polymorphisms of apis cerana distributed in different geographic areas in China［J］.Scientia Agricultura Sinica，2007，40(7):1535-1542.［姜玉鎖，趙慧婷，姜俊兵，等.中國境內(nèi)不同地理型東方蜜蜂線粒體DNA tRNAleu-COⅡ基因多態(tài)性研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(7):1535-1542］

Ji T，Yin L，Liu M，et al.Genetic diversity and genetic differentiation of six geographic populations of Apis cerana(Hymenoptera:Apidae)in East China［J］.Acta Entomologica Sinica，2009，52(4):413-419.［吉挺，殷玲，劉敏，等.華東地區(qū)中華蜜蜂六地理種群的遺傳多樣性及遺傳分化［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2009，52(4):413-419］

Kumar S，Tamura K，Nei M.MEGA 3:Integratedsoftware for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment［J］.Briefings in Bioinformatics，2004，5(2):150-163.

Rozas J，Sanchez-DelBarrio JC，Messegue X，et al.DnaSP DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods［J］.Bioinformatics，2003，19:2496-2497.

Tan K，Zhang X，Zhou DY，et al.Diversity of Asia Apis cerana mtDNA［J］.Journal of Yunnan Agricultural University，2004，19(2):227-230.［譚墾，張炫，周丹銀，等.亞洲部分地區(qū)東方蜜蜂mtDNA 多態(tài)性研究［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，19(2):227-230］

Wang GZ.Research on Diversity and Classification of Apis cerana from North-China［D］.Shandong:Shandong Agricultural University，2007.［王桂芝.中國華北地區(qū)東方蜜蜂多樣性及其分類研究［D］.山東:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007］

Xie JL，Sun LX，Huang ZY.Apis of mtDNA research［J］.Journal of Quanzhou Normal College(Natural Science)，2001，19(2):54-58.［謝進(jìn)金，孫亮先，黃周英.蜜蜂線粒體DNA 研究進(jìn)展［J］.泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，19(2):54-58］

Yin L.Identification and Vertification of Genes Involved with Varroa Destructor Resistance in The Eastern Honeybee(Apis cerana)［D］.Jiangsu:Yangzhou University，2013.［殷玲.東方蜜蜂抗螨相關(guān)基因的篩選及初步驗(yàn)證［D］.江蘇:揚(yáng)州大學(xué)，2013］

Zhang YP，Shi LM.The research situation of animal mtDNA［J］.Zoological Research，1992，13(3):289-298.［張亞平，施立明.動(dòng)物線粒體DNA 多態(tài)性的研究概況［J］.動(dòng)物學(xué)研究，1992，13(3):289-298］