曹新廣，呂慧芳，陳貝貝，常吉梅，唐 菲，朱彩華，樊鑫鑫，秦建軍，陳小兵#

1)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科;河南省腫瘤醫(yī)院普外科 鄭州450008 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 新鄉(xiāng)453003

與化療相比，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)如吉非替尼對(duì)EGFR突變型晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的臨床療效顯著［1］，但大多數(shù)患者最終會(huì)出現(xiàn)耐藥。Axl(Anexelekto)為受體酪氨酸激酶亞家族成員之一，與生長(zhǎng)停滯特異性基因6(growth arrest specific protein 6，Gas6)結(jié)合可激活其酪氨酸激酶活性，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞黏附、增殖、凋亡等過(guò)程［2］。Axl 基因異常表達(dá)在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。最新研究［3］結(jié)果顯示，Axl 參與調(diào)控NSCLC 吉非替尼獲得性耐藥，但機(jī)制仍不清楚。

miRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)18～25 nt 的非編碼單鏈RNA，通過(guò)與靶mRNA 的3’-UTR 端結(jié)合，抑制靶mRNA 翻譯或促進(jìn)其降解［4-5］。NSCLC 細(xì)胞內(nèi)miRNA 表達(dá)失調(diào)與TKI 耐藥和腫瘤形成關(guān)系密切［6-7］。該研究通過(guò)比較EGFR 突變型NSCLC 細(xì)胞株HCC827 及其吉非替尼耐藥株HCC827-Gef 中Axl mRNA 和蛋白的表達(dá)，探討Axl 與HCC827 細(xì)胞吉非替尼耐藥的關(guān)系，再利用微陣列分析鑒定表達(dá)失調(diào)的一系列miRNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRTPCR)檢測(cè)Axl 沉默對(duì)HCC827-Gef 細(xì)胞相關(guān)miRNA表達(dá)的影響;同時(shí)作者還對(duì)不同Axl mRNA 表達(dá)水平的NSCLC 患者相關(guān)miRNA 表達(dá)及生存狀況進(jìn)行比較;探討Axl 對(duì)miRNA 的表達(dá)調(diào)控在NSCLC 吉非替尼獲得性耐藥中的意義。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)液、Trizol、NCodeTMVILOTMmiRNA cDNA 合成試劑盒和EXPRESS SYBRRGreenERTMmiRNA qRT-PCR 試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，新生胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司，吉非替尼購(gòu)自Astra Zeneca 公司，GAPDH 及Axl 單抗購(gòu)自Santa Cruz 公司，GeneChipRHuman Gene 2．0 ST Array 及GeneChip WT Terminal Labeling 試劑盒購(gòu)自Affymetrix 公司，mirVanaTMRNA Isolation 試劑盒及WT Expression 試劑盒購(gòu)自Ambion 公司。

1．2 NSCLC 細(xì)胞及新鮮組織來(lái)源

1．2．1 細(xì)胞來(lái)源 細(xì)胞EGFR 突變型NSCLC 細(xì)胞株HCC827 購(gòu)自ATCC，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)［8］構(gòu)建對(duì)吉非替尼耐藥的細(xì)胞HCC827-Gef。用Superfect 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將靶向Axl的endogenous siRNA(esiAxl)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCC827-Gef 細(xì)胞，得HCC827-Gef-esiAxl 和HCC827-Gef-空質(zhì)粒細(xì)胞。

1．2．2 組織來(lái)源 收集2009年10月至2010年10月在鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行肺葉切除術(shù)的肺癌患者的新鮮肺癌組織40例，置于液氮保存?；颊咧心?2例，女18例;≤55歲15例，＞55歲25例;腺癌18例，鱗癌22例;Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期24例;吸煙32例。該研究獲得鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。隨訪60個(gè)月，以復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或死亡為終點(diǎn)事件。

1．3 微陣列分析 轉(zhuǎn)染48 h 后，收集HCC827-Gef-空質(zhì)粒和HCC827-Gef-esiAxl 細(xì)胞，采用mirVanaTMRNA Isolation 試劑盒離子交換柱吸附法抽提總RNA(嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作)，應(yīng)用GeneChipRHuman Gene 2．0ST Array，參照Affymetrix 基因芯片操作指南進(jìn)行芯片雜交，檢測(cè)對(duì)象包括廣泛的編碼和長(zhǎng)鏈非編碼RNA 轉(zhuǎn)錄組，聯(lián)合應(yīng)用GeneChip WT Terminal Labeling 試劑盒和WT Expression 試劑盒分析雜交結(jié)果中的有義鏈，陣列隨后被染色和掃描，應(yīng)用Partek Genomics Suite Software 分析數(shù)據(jù)，找出差異表達(dá)miRNA。共篩選出20個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中miR-374a、miR-548b 敏感度最高。

1．4 NSCLC 細(xì)胞及新鮮組織中Axl mRNA 和miR-374a、miR-548b 的檢測(cè) 收集待檢細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR 法測(cè)定Axl mRNA 和miR-374a、miR-548b的表達(dá)。以HPRT1 為內(nèi)參測(cè)定Axl mRNA，以U6 snRNA 作為內(nèi)參測(cè)定相關(guān)miRNA。具體步驟及定量方法詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。引物參見(jiàn)表1。同法檢測(cè)40例NSCLC 患者樣本中Axl mRNA、miR-374a、miR-548b 的表達(dá)情況。

1．5 NSCLC 細(xì)胞中Axl 蛋白的Western blot 法檢測(cè) 收集HCC827、HCC827-Gef 細(xì)胞，提取總蛋白，通過(guò)聚丙烯酸胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，蛋白封閉液37℃封閉1 h，PBST 洗滌，一抗(Axl 按1∶5 000 稀釋)4℃振蕩孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3次，加二抗孵育1 h，TBST 洗滌3次，每次5 min。ECL 法室溫顯影，記錄結(jié)果。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR 引物

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13．0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間Axl mRNA 和miR-374a、miR-548b 表達(dá)的比較用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并進(jìn)行Log rank 檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 HCC827 和HCC827-Gef 細(xì)胞中Axl mRNA及蛋白表達(dá)的比較 HCC827-Gef 細(xì)胞中Axl mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯高于HCC827 細(xì)胞，見(jiàn)表2。

表2 HCC827 和HCC827-Gef 細(xì)胞中Axl mRNA 及蛋白的表達(dá)

2．2 HCC827-Gef-空質(zhì)粒和HCC827-Gef-esiAxl細(xì)胞中Axl mRNA 和miR-374a、miR-548b 表達(dá)的比較 見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，與HCC827-Gef-空質(zhì)粒細(xì)胞比較，HCC827-Gef-esiAxl 細(xì)胞中Axl mRNA、miR-374a 表達(dá)顯著下降，miR-548b 表達(dá)則上調(diào)。

表3 細(xì)胞中與Axl 通路相關(guān)的miR-374a、miR-548b 的表達(dá)

2．3 NSCLC 患者Axl mRNA、miR-374a、miR-548b 表達(dá)的分析 以腫瘤組織中AXL/HPRT1 比值1 為臨界值，將NSCLC 患者分為Axl mRNA 高表達(dá)(20例)和低表達(dá)(20例)組。比較2組肺組織中miR-374a、miR-548b 的表達(dá)(表4)，結(jié)果顯示，Axl mRNA 高表達(dá)組miR-374a 表達(dá)高于Axl mRNA 低表達(dá)組，而miR-548b 的表達(dá)則低于Axl mRNA 低表達(dá)組。兩組患者的生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)，Axl 低表達(dá)組患者的無(wú)病生存期延長(zhǎng)更長(zhǎng)(χ2=6．550，P=0．011)。

表4 Axl mRNA 高表達(dá)和低表達(dá)組NSCLC 患者腫瘤組織中miR-374a、miR-548b 表達(dá)的比較

圖1 Axl mRNA 高表達(dá)和低表達(dá)組的生存曲線

3 討論

EGFR-TKI 靶向藥物如吉非替尼的發(fā)現(xiàn)，使EGFR 突變的NSCLC 患者生活質(zhì)量明顯改善，生存時(shí)間更長(zhǎng)，但大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)耐藥，目前耐藥問(wèn)題仍然NSCLC 治療中的一個(gè)主要的難題［9］，而Axl 在EGFR-TKI 獲得性耐藥中作用已成為目前研究的焦點(diǎn)。如抗腫瘤藥物NPS-1034 通過(guò)激活Met 或Axl或ROS1 的重組，使對(duì)EGFR-TKI 敏感的NSCLC 患者出現(xiàn)獲得性耐藥［10］。一項(xiàng)研究［3］表明，EGFR 突變的肺癌細(xì)胞中Axl 表達(dá)升高，下調(diào)Axl 表達(dá)可延緩EGFR-TKI 獲得性耐藥的發(fā)生。此次實(shí)驗(yàn)中，作者觀察到，耐吉非替尼肺癌細(xì)胞株HCC827-Gef 中Axl mRNA 和蛋白表達(dá)表達(dá)均高于不耐藥的HCC827 細(xì)胞，提示Axl 可能參與了HCC827 細(xì)胞的吉非替尼耐藥過(guò)程。

一個(gè)miRNA 可靶向上百個(gè)mRNA，調(diào)控一系列生物功能如細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡，在臨床診斷和預(yù)后判斷中扮演重要角色［11］。該研究闡述了對(duì)EGFR-TKI 耐藥的NSCLC 細(xì)胞中Axl 介導(dǎo)的miRNA 表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，HCC827-Gef-esiAXL 細(xì)胞Axl基因沉默后，miR-374a 表達(dá)顯著下降，miR-548b 表達(dá)則上調(diào)。在對(duì)NSCLC 患者的分析結(jié)果顯示，Axl mRNA 高表達(dá)組miR-374a 表達(dá)高于Axl mRNA 低表達(dá)組，而miR-548b 的表達(dá)則低于Axl mRNA 低表達(dá)組;并且Axl mRNA 高表達(dá)組患者的無(wú)病生存期較Axl 低表達(dá)組明顯縮短。無(wú)病生存期縮短提示NSCLC 患者更容易對(duì)吉非替尼耐藥，并容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，與肺癌患者預(yù)后密切相關(guān)。

由此可見(jiàn)，Axl 及其調(diào)控的miR-374a 和miR-548b 在NSCLC EGFR-TKI 獲得性耐藥機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們可作為預(yù)后因子來(lái)判斷NSCLC 患者預(yù)后或成為潛在的治療靶點(diǎn)。

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