肖 莉，郭玉華，孫來(lái)玉

（湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州313000）

0 引言

葛根為豆科植物野葛Puerariae lobata（Willd）Ohwi的干燥根塊，主要成分為淀粉，還含有大豆（黃豆）甙、大豆甙元、葛根素等10余種黃酮類(lèi)化合物共約12%.現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，黃酮類(lèi)成分具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、降低血液黏度、改善心肌收縮功能及增加腦血流量等作用，臨床上用于治療心腦血管疾病具有較好的應(yīng)用前景［1］.

目前，國(guó)內(nèi)多采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化中藥有效成分的提取工藝，雖實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，但精度不高.響應(yīng)面分析是一種優(yōu)化方法，它是將體系的響應(yīng)值（如提取率）作為一個(gè)或多個(gè)因素（如溫度、時(shí)間等）的函數(shù)，再運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來(lái)，建立一個(gè)合適的數(shù)學(xué)模型，再用此數(shù)學(xué)模型作圖，憑借直覺(jué)的觀察選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件［2］.由于響應(yīng)面分析法采用非線(xiàn)性數(shù)學(xué)模型擬合，大大提高了實(shí)驗(yàn)精度，使預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值［3～4］.

本實(shí)驗(yàn)以葛根總黃酮提取率為指標(biāo)，引入星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為提高葛根資源的合理應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材料

葛根素（中國(guó)藥品生物制品檢定所）、葛根（湖州慕韓齋藥店）.

1.2 儀器

AL－204型電子分析天平（Mettler－Toledo公司）、電熱真空干燥箱（天津天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、SCQ－5201C型超聲波清洗器（上海聲彥超聲波儀器有限公司）、RE－52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）、SHB－ⅢA 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋（普瑞斯機(jī)械有限公司）、UV－2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津公司）.

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取葛根素13.5mg置于25mL容量瓶中，加95%乙醇溶解定容，制備葛根素標(biāo)準(zhǔn)液.分別量取葛根素標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置于10mL容量瓶中，加1mL 95%乙醇，再補(bǔ)加蒸餾水定容至刻度，搖勻.另取95%乙醇1mL，加蒸餾水定容至10mL，作為空白對(duì)照，于250nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以葛根素濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程A＝64.56C＋0.015，r＝0.999 8，葛根素在0.010 8～0.054mg/mL的濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線(xiàn)性關(guān)系.

2.2 總黃酮含量的測(cè)定

精密稱(chēng)取干燥至恒重的葛根黃酮浸膏5.03mg置于25mL容量瓶中，加95%乙醇溶解定容，搖勻，過(guò)濾.吸取濾液1mL置于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，于250nm 處測(cè)吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)樣品中總黃酮的含量.

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取條件

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)主要對(duì)提取時(shí)間、溶劑倍數(shù)（溶劑體積mL/藥材質(zhì)量g）、提取次數(shù)及乙醇濃度4個(gè)因素進(jìn)行考察，在此基礎(chǔ)上，綜合考慮到提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較難，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，定為2次，其余因素水平根據(jù)單因素考查結(jié)果確定.因素水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果見(jiàn)表2.

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

表2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of central composite design/response surface methodology

2.3.2 工藝優(yōu)化與預(yù)測(cè)

采用designer－expert8.0軟件，以總黃酮提取率為指標(biāo)，相對(duì)于其中兩個(gè)因素繪制三維效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖1～圖3.通過(guò)效應(yīng)面圖的重合疊加，確定最優(yōu)提取條件.

由三維效應(yīng)面圖可見(jiàn)，在一定區(qū)域內(nèi)，指標(biāo)值R 隨著乙醇濃度的增大而減小，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，隨著提取溶劑量的增大而增大.對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度69.3%、溶劑倍數(shù)8.55倍、回流時(shí)間135.6min、提取2次，黃酮提取率達(dá)50.39%.

3 結(jié)論

通過(guò)單因素法寬范圍考察影響葛根總黃酮提取率的因素，選取影響最大的3個(gè)因素，即溶劑濃度、提取時(shí)間和溶劑倍數(shù)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以葛根總黃酮提取率作為優(yōu)化指標(biāo)，應(yīng)用Designer－Expert 8.0軟件繪制各因素對(duì)指標(biāo)的三維效應(yīng)面圖，直觀地描繪出各個(gè)因素的影響.盡管效應(yīng)面優(yōu)化法實(shí)驗(yàn)次數(shù)相對(duì)較多，但其最優(yōu)工藝的選擇不僅局限于所設(shè)置的水平，考察因素的水平范圍更大，因此擬合預(yù)測(cè)能力相對(duì)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)更為優(yōu)異可靠，其在中藥材提取優(yōu)化研究中的應(yīng)用更為廣泛.

［1］張永軍，劉曉宇，黃惠華.響應(yīng)面法優(yōu)化葛根多糖提取工藝的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（7）：678－682.

［2］Singh S K，Dodge J，Durrani M J，et al.Optimization and characterization of controlled release pellets coated with experimental latex：I.Anionic drug［J］.Int J Pharm，1995，125：243－255.

［3］Singh B，Chakkal S K，Ahuja N.Formulation and optimization of controlled release mucoadhesive tablets of atenolol using response surface methodology［J］.AAPS Pharm Sci Tech，2006，7（1）：E1－E9.

［4］Dayal P，Pillay V，Babu R J，et al.Box－Behnken experimental design in the development of a nasal drug delivery system of model drug hydroxyurea：characterization of viscosity，in vitro drug release，droplet size and dynamic surface tension［J］.AAPS Pharm Sci Tech，2005，6（4）：E573－E585.