宋方，田茂波，肖燕，龍向淑，吳強(qiáng)

干擾素誘導(dǎo)蛋白p204過表達(dá)抑制大鼠主動脈血管外膜成纖維細(xì)胞凋亡、增殖與遷移

宋方，田茂波*，肖燕，龍向淑，吳強(qiáng)

目的：觀察干擾素誘導(dǎo)蛋白p204過表達(dá)對大鼠主動脈血管外膜成纖維細(xì)胞（VAFs）凋亡、增殖與遷移的影響。

方法：分別應(yīng)用攜帶p204基因（Ifi204）的慢病毒顆粒（Ifi204-Lv組）、空載慢病毒顆粒（Con-Lv組）感染VAFs，未經(jīng)處理的VAFs作為陰性對照組。用噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測VAFs增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，細(xì)胞劃痕法和Transwell法測定細(xì)胞遷移情況，應(yīng)用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（realtime q RT-PCR） 和蛋白免疫印跡（Western blotting）分別檢測p204、抑癌因子p53及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21WAF（p21）的mRNA和蛋白表達(dá)。

結(jié)果： Ifi204-Lv組與Con-Lv組、陰性對照組相比較，細(xì)胞增殖降低［（吸光度值），48 h：0.53 ±0.05 vs 0.66±0.03、0.63 ±0.06；72 h: 0.89±0.06 vs 1.02±0.06、1.01±0.07］及遷移距離縮短［（像素），61.00±1.83 vs 74.50±6.25、75.50±7.85］、數(shù)量降低（61.75±10.69 vs 155.25±10.21、153.75±9.40），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），但組間比較細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 與Con-Lv組、陰性對照組相比，Ifi204-Lv組的p204（3.45±0.15 vs 2.09±0.10、2.06±0.09）、p53（3.41±0.09 vs 2.06±0.07、2.10±0.06）及p21（3.01±0.08 vs 2.05±0.06、2.11 ±0.08）的mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

結(jié)論： p204過表達(dá)可抑制大鼠VAFs增殖與遷移，其機(jī)制可能部分與激活p53及p21表達(dá)有關(guān)。

干擾素誘導(dǎo)蛋白； p204；血管外膜成纖維細(xì)胞；凋亡；增殖；遷移

Methods: Our research included in 3 groups: If204-Lv group, in whichVAFs were infected by If204-recombined lentivirus, Con-Lv group, in which VAFs carried the empty vector without virus, Blank control group, in which VAFs were untreated. VAFs proliferation was examined by MTT method, cell apoptosis was measured by fow cytometry and the migration was detected by scratching assay and transwell chamber method. The mRNA and protein expressions of p204, p53 and p21were evaluated by real-time q RT-PCR and Western blot analysis respectively.

Results: Compared with Con-Lv and Blank control groups, If204-Lv group had decreased VAFs proliferation (by OD value) at 48 hours: (0.53 ± 0.05) vs (0.66±0.03) and (0.63 ± 0.06), at 72 hours: (0.89 ± 0.06) vs (1.02 ± 0.06) and (1.01 ± 0.07); distance of cell migration (by pixel): (61.00 ± 1.83) vs (74.50 ± 6.25) and (75.50 ± 7.85); number of cell migration: (61.75 ± 10.69) vs (155.25 ± 10.21) and (153.75 ± 9.40), all P＜0.05. VAFs apoptosis rates were similar among different groups. Compared with Con-Lv and Blank control groups, Ifi204-Lv group presented up-regulated mRNA

expressions of p204 (3.45 ± 0.15) vs (2.09 ± 0.10) and (2.06 ± 0.09); p53 (3.41 ± 0.09) vs (2.06 ± 0.07) and (2.10 ± 0.06); p21 (3.01 ± 0.08) vs (2.05 ± 0.06) and (2.11 ± 0.08), all P＜0.05.

Conclusion: p204 over-expression inhibits VAFs proliferation and migration which might be partly related to the activation of p53 and p21 expression in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1110.)

血管外膜成纖維細(xì)胞（VAFs）與動脈粥樣硬化、高血壓、血管介入治療及冠狀動脈旁路移植術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-3]。鼠p204屬干擾素誘導(dǎo)蛋白200家族（ p200）成員，其能通過多種機(jī)制發(fā)揮抗增殖作用[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)p204在大鼠主動脈血管外膜存在豐富的表達(dá)[5]，干擾素-α （IFN-α）可誘導(dǎo)VAFs中p204表達(dá)增加，同時抑制VAFs的增殖[6]，提示IFN-α抑制VAFs增殖的作用可能部分與p204表達(dá)有關(guān)。因單純p204過表達(dá)對VAFs增殖、遷移等生物學(xué)功能的影響尚少見報道，本研究進(jìn)一步通過慢病毒介導(dǎo)p204過表達(dá)，觀察其對VAFs凋亡、增殖與遷移的影響，探討其可能的機(jī)制，為治療血管狹窄性疾病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

材料：本實驗起止時間為2014-05至2015-01。清潔級SD大鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司；含p204基因（Ifi204，GenBank ID: BC010546）全長ORF的慢病毒顆粒（載體為pReceiver-Lv201）由廣州復(fù)能基因有限公司合成；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增引物由上海生工合成（表1）；FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒（KR106）購自北京天根公司；iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix（#172-5120）購自美國Bio-Rad公司；p204抗體（sc-13367）購自美國Santa Cruz公司；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21WAF（p21）抗體（ab92675）購自英國Abcam上海分公司；抑癌因子p53抗體購自美國GeneTex公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）內(nèi)參抗體購自上海碧云天；噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性檢測試劑盒（C0009）及Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1062）購自上海碧云天公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

表1 聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

大鼠VAFs的培養(yǎng)和分組：大鼠主動脈VAFs的培養(yǎng)、純化及鑒定按文獻(xiàn)[6]報道的方法，取4～6代細(xì)胞用于實驗。實驗細(xì)胞分為3組，即攜帶Ifi204基因的重組慢病毒顆粒感染組（Ifi204-Lv組）、空載慢病毒顆粒感染對照組（Con-Lv組），未經(jīng)處理的VAFs作為陰性對照組。

慢病毒感染：取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔板中，用10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%左右，按慢病毒轉(zhuǎn)染說明書操作，以含Ifi204基因的慢病毒顆粒（Ifi204-Lv）和對照的空載慢病毒顆粒（Con-Lv）分別感染VAFs，孵育過夜后更換為正常培養(yǎng)液，分別于48 h后收集細(xì)胞用于提取總RNA，于72 h后收集細(xì)胞用于提取總蛋白。每組每時間點3～6復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（real-time qRT-PCR）檢測mRNA表達(dá)：按TRNzol總RNA提取試劑盒說明操作提取VAFs總RNA，取1 μg按FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2 μl產(chǎn)物進(jìn)行PCR循環(huán)，按Bio-Rad公司iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix試劑盒說明配制20 μl PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為：起始模板預(yù)變性（95℃, 10min），PCR循環(huán)模板變性（95℃ 15 s）+延長（60℃, 1min）循環(huán)40次，溶解曲線65℃到95℃、每5 s增加0.5℃。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算各組p204、p53及p21 mRNA的相對表達(dá)量。

蛋白免疫印跡（Western blotting）檢測蛋白表達(dá)：提取VAFs總蛋白，每孔上樣80 μg蛋白樣品進(jìn)行

SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。將膜置Western封閉液中室溫下封閉1 h；加入p204一抗工作液，室溫下孵育15 min后置4℃冰箱過夜；TBST緩沖液（pH=7.4）洗膜，室溫下孵育稀釋的二抗1 h；TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光（ECL），顯影定影。蛋白膜應(yīng)用Western一抗二抗去除液處理后，同法封閉、孵育p21、p53及GAPDH內(nèi)參一抗及二抗。膠片掃描，Image J軟件分析p204與內(nèi)參條帶的吸光度值之比。

噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測細(xì)胞活力：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，按約4000個細(xì)胞/孔接種于96孔板，細(xì)胞孵育過夜后，每組分別設(shè)6個復(fù)孔，設(shè)置調(diào)零孔2個，各組干預(yù)方法同前，繼續(xù)培養(yǎng)48 h及72 h后收集細(xì)胞。按文獻(xiàn)[6]的方法在Bio-tek Elx800UV型酶標(biāo)儀測A490nm處吸光度值。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和壞死：按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1062）說明書操作收集、重懸及染色細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

細(xì)胞劃痕法觀察細(xì)胞遷移距離：按文獻(xiàn)[7]的方法通過細(xì)胞劃痕法觀察細(xì)胞遷移距離。在6孔板背后均勻畫出6條橫穿過孔的線條（每孔2條），待孔內(nèi)各組細(xì)胞匯合度達(dá)90 %后，用劃線工具垂直于孔背面橫線劃痕。吸棄孔內(nèi)液體，并用PBS緩沖液（pH=7.4）清洗2遍，加入低血清培養(yǎng)液。顯微鏡下拍照后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取樣、拍照、計算遷移距離。遷移距離=劃痕0 h后劃痕寬度－劃痕24 h后劃痕寬度，以像素（pixel）作為長度單位，每組4復(fù)孔細(xì)胞。

Transwell小室定量遷移細(xì)胞：按文獻(xiàn)[7]的方法通過Transwell小室計算遷移細(xì)胞數(shù)量。取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至1×106個/L。每個小室（上室）中加入100 μl上述細(xì)胞懸液，在24孔板內(nèi)（下室）加入含5 % FBS的DMEM培養(yǎng)液600 μl，培養(yǎng)8 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，上室用PBS液洗滌3遍后，將小室置于4 %多聚甲醛中固定20 min，自然晾干后再將小室置于0.1 %結(jié)晶紫中染色20 min，之后用PBS液洗滌5遍。晾干后，每組4復(fù)孔細(xì)胞，每孔細(xì)胞在顯微鏡下隨機(jī)選取4個視野，觀察細(xì)胞并計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204過表達(dá)對VAFs增殖、凋亡及遷移的影響

干預(yù)后各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h，表2可見，與Con-Lv組、陰性對照組比較，Ifi204-Lv組的MTT吸光度值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀結(jié)果提示，與Con-Lv組、陰性對照組比較，Ifi204-Lv組的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2、圖1）。

表2 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204過表達(dá)對血管外膜成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響

表2 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204過表達(dá)對血管外膜成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響

注：Ifi204-Lv組：攜帶Ifi204基因的重組慢病毒顆粒感染組；Con-Lv組：空載慢病毒顆粒感染對照組；MTT A490OD值：噻唑藍(lán)比色法測定490 nm波長的吸光度值。與陰性對照組比較*P＜0.05；與Con-Lv組比較ΔP＜0.05

?

圖1 p204過表達(dá)對血管外膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞劃痕24 h后計算遷移距離，與Con-Lv組、陰性對照組比較，Ifi204-Lv組的遷移距離縮短（P＜0.05）；通過Transwell小室計算遷移細(xì)胞，與Con-Lv組及陰性對照組比較，Ifi204-Lv組的遷移細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05，見圖2及表2），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。以上各指標(biāo)在Con-Lv組和陰性對照組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204過表達(dá)對血管外膜成纖維細(xì)胞遷移距離和數(shù)量的影響

2.2 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204基因過表達(dá)后對VAFs中p53及p21mRNA與蛋白表達(dá)的變化

real-time qRT-PCR結(jié)果（表3）：與Con-Lv組、陰性對照組比較，Ifi204-Lv組Ifi204、p53及p21的mRNA表達(dá)量均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

表3 實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)分析Ifi204過表達(dá)對3組血管外膜成纖維細(xì)胞中p53及p21mRNA表達(dá)的影響

表3 實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)分析Ifi204過表達(dá)對3組血管外膜成纖維細(xì)胞中p53及p21mRNA表達(dá)的影響

注：與陰性對照組比較*P＜0.05 ；與 Con-Lv組比較ΔP＜0.05。余注見表2

?

Western blotting 結(jié)果（圖3）：與Con-Lv組、陰性對照組比較，Ifi204-Lv組p204蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），伴隨著p53及p21蛋白表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，）。p204、p53及p21的mRNA與蛋白表達(dá)在陰性對照組和Con-Lv組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 蛋白免疫印跡分析p204過表達(dá)對血管外膜成纖維細(xì)胞中p53及p21蛋白表達(dá)的影響

3 討論

血管重構(gòu)是血管增殖性疾病的主要病理生理機(jī)制。既往認(rèn)為在血管重構(gòu)過程中，血管平滑肌細(xì)胞作為動脈血管的主要成分細(xì)胞起著主要作用，而VAFs作為“旁觀者”，僅起著支持與營養(yǎng)的作用。但近年來，越來越多的研究證明VAFs的增殖、遷移與分泌細(xì)胞外基質(zhì)等在血管重構(gòu)過程中起著重要的作用[1，2]。將VAFs作為治療靶點，有效地抑制其增殖、遷移對防治血管增殖性疾病有重要意義。

研究已證實p204通過與多種細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并反應(yīng)，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、衰老和凋亡，在自身免疫反應(yīng)、抗病毒及抗癌等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[4,8]。p204過表達(dá)具有抑制細(xì)胞生長的功能，可以延緩細(xì)胞周期G1/S及G2/ M轉(zhuǎn)換[9,10]。p204蛋白的200 X結(jié)構(gòu)中含有MF/ LHATVAT/S模序，該模序介導(dǎo)和53BP1（p53結(jié)合蛋白1）的結(jié)合從而激活p53來抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移[9,11]。本研究通過慢病毒介導(dǎo)p204過表達(dá)，結(jié)果抑制了VAFs增殖與遷移，同時p53及p21表達(dá)上調(diào)，提示p204能促進(jìn)p53及p21表達(dá)并發(fā)揮其抗增殖及遷移作用，其機(jī)制可能部分是通過p204蛋白中的MF/LHATVAT/S氨基酸模序，介導(dǎo)和53BP1的結(jié)合從而激活p53來實現(xiàn)的。激活p53及高水平的p21表達(dá)，可引起細(xì)胞凋亡[12]，p204亦參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[4,13]，我們在VAFs過表達(dá)p204并未增加細(xì)胞凋亡，可能與p204表達(dá)未達(dá)該實驗細(xì)胞的凋亡效應(yīng)劑量有關(guān)，若能進(jìn)一步上調(diào)p204的表達(dá)或其下游信號通路蛋白如p53或p21的表達(dá)，可能觀察到更明顯的細(xì)胞生長抑制效應(yīng)甚至增加凋亡。

p21通過抑制細(xì)胞周期蛋白/細(xì)胞周期依賴性激酶（cyclin/CDK）復(fù)合物活性，使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制細(xì)胞生長[14]。其啟動子上有p53的結(jié)合位點，p53是重要的抑瘤因子，p53在轉(zhuǎn)錄水平使p21表達(dá)增加[12]。本研究通過慢病毒介導(dǎo)p204過表達(dá)，結(jié)果p53及p21轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)增加，提示p204通過促進(jìn)p53的表達(dá)來提高p21的表達(dá)，發(fā)揮后者抑制細(xì)胞生長的作用。p21的表達(dá)除受p53轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)外，也存在非p53依賴信號通路，p204是否直接參與調(diào)控p21尚少見報道。

本研究通過慢病毒介導(dǎo)p204過表達(dá)來觀察其對VAFs增殖、凋亡與遷移的影響及機(jī)制。結(jié)果顯示，p204過表達(dá)可抑制大鼠VAFs增殖與遷移，其機(jī)制可能部分與激活p53及p21表達(dá)有關(guān)。

[1] Newby AC, Zaltsman AB. Molecular mechanisms in intimal hyperplasia. J Pathol, 2000, 190: 300-309.

[2] 邱菊輝, 王貴學(xué), 羅向東. 肌成纖維細(xì)胞與血管內(nèi)再狹窄. 中華心血管病雜志, 2009, 37: 663-665.

[3] 李建軍. 再狹窄發(fā)生的相關(guān)研究是冠心病介入治療的長期課題.中國循環(huán)雜志, 2008, 23: 401-403.

[4] Luan Y, Lengyel P, Liu CJ. p204, a p200 family protein, as a multifunctional regulator of cell proliferation and differentiation. Cytokine Growth Factor Rev, 2008, 19: 357-369.

[5] 宋方, 吳強(qiáng), 龍向淑, 等. 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204在大鼠血管壁成分細(xì)胞的表達(dá)研究. 中國動脈硬化雜志, 2012, 20: 1097-1102.

[6] 宋方, 吳強(qiáng), 譚洪文, 等. IFNα通過p204抑制大鼠主動脈外膜成纖維細(xì)胞增殖. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2012, 32: 1431-1436.

[7] 黃晶, 宋方, 龍向淑, 等. 干擾素誘導(dǎo)蛋白16對人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖與遷移的影響及其機(jī)制. 中國病理生理雜志, 2013, 29: 584-589.

[8] 宋方, 吳強(qiáng). 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204調(diào)節(jié)心肌分化的機(jī)制及應(yīng)用前景. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報, 2011, 33: 59-64.

[9] Hertel L, Rolle S, De Andrea M, et al. The retinoblastoma protein is an essential mediator that links the interferon-inducible 204 gene to cellcycle regulation. Oncogene, 2000, 19: 3598-3608.

[10] Asefa B, Dermott JM, Kaldis P, et al. p205, a potential tumor suppressor, inhibits cell proliferation via multiplepathways of cell cycle regulation. FEBS Lett, 2006, 580: 1205-1214.

[11] Ding Y, Wen Y, Spohn B, et al. Proapoptotic and antitumor activities of adenovirus-mediated p202 gene transfer. Clin Cancer Res, 2002, 8: 3290-3297.

[12] Johnstone RW, Wei W, Greenway A, et al. Functional interaction between p53 and the interferon-inducible nucleoprotein IFI 16. Oncogene, 2000, 19: 6033-6042.

[13] Zhao H, Gonzalezgugel E, Cheng L, et al. The roles of interferoninducible p200 family members IFI16 and p204 in innate immune responses, cell differentiation and proliferation. Genes Dis, 2015, 2: 46-56.

[14] Abbas T, Dutta A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer, 2009, 9: 400-414.

Interferon-induced Protein 204 Over-expression Inhibits Aortic Vascular Adventitial Fibroblast Proliferation and Migration in Experimental Rats

SONG Fang, TIAN Mao-bo, XIAO Yan, LONG Xiang-shu, WU Qiang.
Department of Cardiology, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang (550002), Guizhou, China

Objective: To observe the effects of interferon-induced protein 204 (p204) over-expression on apoptosis, proliferation and migration of aortic vascular adventitial fbroblast (VAFs) in experimental rats.

Interferon-induced protein, p 204; Vascular adventitial fbroblast; Apoptosis; Proliferation; Migration

2015-03-16）

（編輯：梅 平）

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81260030)；貴州省科技攻關(guān)項目(黔科合LH字[2014]7023號)

550002 貴州省貴陽市，貴州省人民醫(yī)院 心內(nèi)科

宋方 主治醫(yī)師 博士研究生 主要研究方向為心肌及心血管重構(gòu)的基礎(chǔ)與臨床 Email：songfangheart@126.com 通訊作者：吳強(qiáng)

Email：gzgywq@126.com*并列第一作者

R541

A

1000-3614（2015）11-1110-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.11.018