孫鐵鋒， 王 平

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014）

［藥 理］

鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架修復(fù)大鼠股骨頭缺血性壞死

孫鐵鋒1，2， 王 平2*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014）

目的 研究鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架對(duì)大鼠股骨頭缺血性壞死的修復(fù)。方法 無(wú)菌條件下酶消化法分離、培養(yǎng)新生Wistar乳大鼠成骨細(xì)胞；物理法無(wú)菌制備鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架；將成骨細(xì)胞接種到鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架上，置入造模成功的大鼠股骨頭壞死部位。結(jié)果 鹿角膠-殼聚糖支架有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和增強(qiáng)活力作用，支架治療后模型大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)受限情況得到改善，X光線觀察股骨頭壞死區(qū)與囊性變逐漸修復(fù)，光鏡照片表明治療骨細(xì)胞部分變性、壞死減輕。結(jié)論 鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架對(duì)股骨頭缺血性壞死具有較好的修復(fù)作用。

成骨細(xì)胞；鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架；股骨頭缺血性壞死；大鼠

股骨頭缺血性壞死（Avascular necrosis of the femoral head，ANFH），是臨床上一種較常見(jiàn)的骨科疾病，因其致殘率、致死率極高，被稱為 “不死的癌癥”。目前采用的關(guān)節(jié)置換術(shù)和藥物治療都有一定的局限性［1］，給患者帶來(lái)身心痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。組織工程支架技術(shù)的出現(xiàn)，使股骨頭壞死的治療出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)機(jī)，該方法的原理是將外源的成骨細(xì)胞植入到壞死部位，并提供有利于成骨細(xì)胞分化的微環(huán)境，促進(jìn)其生長(zhǎng)，從而替代已經(jīng)壞死的股骨頭。我們制成鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架，搭載成骨細(xì)胞移植到體內(nèi)，考察支架在體內(nèi)建立的微環(huán)境下能否促進(jìn)成骨細(xì)胞順利地增殖，逐漸生成新生骨組

織，替代壞死組織，最終完成股骨頭壞死的修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠（不分雌雄），體質(zhì)量180～220 g，新生Wistar乳大鼠，體質(zhì)量30～35 g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)scxk（魯）20100004號(hào)；鹿角膠 （湖北華光制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)120401）；殼聚糖 （山東奧康生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)140316v，脫乙酰度＞90%）；維甲酸 （山東良福制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)H10970054）。

1.1.2 試驗(yàn)條件 實(shí)驗(yàn)室溫度23～25℃；濕度50%～70%；通風(fēng)良好；動(dòng)物飼養(yǎng)條件，喂以專用顆粒鼠飼料。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物飲水、進(jìn)食正常，狀態(tài)良好。

1.1.3 試驗(yàn)主要儀器和試劑 DMEM-LG液體培養(yǎng)基（Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Solarbio公司）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 （天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；青鏈霉素混合液（Solarbio公司）；D-Hank’s液（Solarbio公司）；PBS磷酸鹽緩沖液 （Solarbio公司）；茜素紅指示劑（Solarbio公司）；堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒（上海工碩生物技術(shù)有限公司）；塑料培養(yǎng)板（Corning公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；CO2培養(yǎng)箱 （長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司生產(chǎn)）；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）；培養(yǎng)箱Galaxy（德國(guó)）；超凈工作臺(tái)ZHJH-1209（臺(tái)灣斯特儀器設(shè)備有限公司）；GB303基本型電子天平（Mettler-Totado公司）；恒溫水浴 （上海醫(yī)用電子設(shè)備廠生產(chǎn)）；DDL-5型離心機(jī) （上海安亭科技儀器廠生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取Wistar乳大鼠脫頸處死，無(wú)菌條件下取其頭蓋骨，消化后過(guò)100目細(xì)胞篩，1 000 r/min，離心5 min，取下層。用DMEM-LG清洗后置于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后12 h第一次換液，去除不貼壁細(xì)胞。其后每3天換一次液。8～10 d后，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，傳至第3代時(shí)進(jìn)行鑒定。

1.2.2 成骨細(xì)胞成骨性鑒定 將傳代3次的成骨細(xì)胞取出，用PBS緩沖液清洗3次，茜素紅染色，進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色，水浴2 h，雙蒸水沖洗3遍，固定、標(biāo)記、拍照，觀察是否有鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)，若結(jié)果為陽(yáng)性，則鑒定為成骨細(xì)胞。

1.2.3 鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架的制備［2-3］將殼聚糖粉末溶解于0.1 mol/L的醋酸，配制成3%（w/v）的殼聚糖溶液，按照1：3（殼聚糖與鹿角膠）的比例加入鹿角膠，攪拌混勻，混合溶液加入1% （w/v）相對(duì)分子質(zhì)量1 000聚乙二醇，37℃溶解蠟狀聚乙二醇。將殼聚糖/鹿角膠溶液緩慢倒入模具，-80℃預(yù)冷，再放入冷凍抽干機(jī)中凍干48 h，制備成殼聚糖-鹿角膠支架。支架成型后浸入無(wú)水乙醇中60 min，用Na2HPO4飽和溶液洗滌至pH中性，三蒸水沖洗5～10次。然后將支架材料浸泡在碳酰二亞胺交聯(lián)劑中10 h，再用40%的乙醇溶液浸泡30 min，最后用三蒸水沖洗干凈，進(jìn)行二次凍干。輻照滅菌，備用。

1.2.4 鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架負(fù)載成骨細(xì)胞 將誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞用胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度。以2：1的比例將復(fù)合支架與成骨細(xì)胞混合，置于12孔板中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)5.0～6.0 min，待復(fù)合支架與成骨細(xì)胞復(fù)合物形成凝膠后取出，再在每孔加入適宜量的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 支架對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 消化接種“1.2.4”項(xiàng)下細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)24、48、72 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。3個(gè)細(xì)胞板分別接入3 000、4 000、5 000個(gè)細(xì)胞，調(diào)零孔只加入100μL細(xì)胞培養(yǎng)液，邊緣孔加入100μL PBS，置于37℃、飽和溫度、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵4 h，貼壁后，每孔加入10μLMTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入100μL Formazan溶解液（DMSO），置于搖床低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度OD值。將經(jīng)過(guò)5 d的誘導(dǎo)后將培養(yǎng)液吸出，PBS培養(yǎng)液洗2遍，細(xì)胞粉碎機(jī)，超聲裂解，按堿性磷酸酶試劑盒操作步驟加入500μL基質(zhì)液，37℃水浴15 min后加入750μL顯色液，用酶標(biāo)儀測(cè)定504 nm處的吸光度 （A）值，結(jié)果進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。

1.2.6 將鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架定向固定在ANFH模型動(dòng)物壞死部位［4-9］取Wistar大鼠72只，體質(zhì)量為180～220 g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和模型組，模型組給大鼠灌胃維甲酸70 mg/kg，每日1次。6周后，停用維甲酸，隨機(jī)選取2只大鼠處死，取股骨頭部位的骨組織，用10%的福爾馬林固定，光鏡下快速檢測(cè)驗(yàn)證模型成功。將造模成功的大鼠，麻醉后取俯臥位，左下肢外展20°固定于操作臺(tái)上，消毒。在醫(yī)用便攜式X光機(jī)的照射下，

確定左側(cè)股骨頭壞死部位，將鹿角膠-脫蛋白骨細(xì)胞支架置于埋線針內(nèi)，自壞死部位對(duì)應(yīng)的體表皮膚刺入，直達(dá)股骨頭壞死部位。取右側(cè)部位不給予任何治療，作為模型對(duì)照組。繼續(xù)飼養(yǎng)。檢測(cè)以下指標(biāo)［10-12］：一般情況觀察、股骨頭大體觀察、X光片觀察、股骨頭部位的病理檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件完成統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較選用LSD法，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡觀察成骨細(xì)胞，48 h更換培養(yǎng)液時(shí)，在倒置顯微鏡下，可觀察到原代培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞聚集狀態(tài)，見(jiàn)圖1a。第5天換液時(shí)，細(xì)胞呈典型的 “鋪路石”狀，見(jiàn)圖1b。

圖1 成骨細(xì)胞的形態(tài) （×200）Fig.1 Bone ceIImorphoIogies（×200）

2.2 成骨細(xì)胞的鑒定 茜素紅染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)皿中的成骨細(xì)胞布滿了紅色陽(yáng)性克隆的鈣化結(jié)節(jié)（圖2），從而證實(shí)該細(xì)胞為成骨細(xì)胞。

圖2 茜素紅染液染色的鈣結(jié)節(jié) （×10）Fig.2 AIizarin red dye staining caIcium nodu Ies（×10）

2.3 鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架的觀察 如圖3所示，冷凍干燥法制備的鹿角膠-殼聚糖支架材料為多孔似海綿狀，孔與孔之間相互連通。支架整體形狀為圓柱紐扣型，外觀呈米白色泡沫樣，支架表面呈現(xiàn)疊瓦狀，仔細(xì)觀察可見(jiàn)表面布滿孔隙。

圖3 鹿角膠-殼聚糖支架材料的外觀Fig.3 AntIer geIatin-chitosan scaffoId appearance

2.4 支架對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 支架培養(yǎng)組（實(shí)驗(yàn)組）細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞的OD值在24、48和72 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明鹿角膠-殼聚糖支架對(duì)細(xì)胞有增值作用，見(jiàn)表1。

表1 支架對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的增殖作用Tab.1 Support vaIue-added effects on the grow th of osteob Iast

表1 支架對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的增殖作用Tab.1 Support vaIue-added effects on the grow th of osteob Iast

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

培養(yǎng)時(shí)間/h OD值空白對(duì)照組 支架組24 0.247±0.016 0.492±0.091**48 0.535±0.093 0.767±0.118**72 0.564±0.047 0.612±0.131*

培養(yǎng)5 d測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A值，見(jiàn)表2。經(jīng)方差分析，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶活性明顯強(qiáng)于對(duì)照組 （P＜0.01）。

表2 堿性磷酸酶的吸光度 （A）值Tab.2 Absorbance（A）vaIues of aIkaIine phosphatase

表2 堿性磷酸酶的吸光度 （A）值Tab.2 Absorbance（A）vaIues of aIkaIine phosphatase

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別 孔數(shù)（n） 吸光度（A）值10 125.42±0.18支架組 10 216.48±0.52空白對(duì)照組**

2.5 鹿角膠-殼聚糖細(xì)胞支架對(duì)ANFH模型動(dòng)物的修復(fù)作用結(jié)果

2.5.1 整體情況觀察結(jié)果 成模后大鼠尾部出現(xiàn)潰爛情況，行走跛行，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限。植入支架后肉眼觀察大鼠股骨頭部位無(wú)明顯的形狀變化，未發(fā)生切口感染，無(wú)明顯的炎癥反應(yīng)、排異反應(yīng)，動(dòng)物進(jìn)食良好、腿部活動(dòng)逐漸恢復(fù)正常，大鼠無(wú)死亡。按照表3設(shè)計(jì)的觀察表給大鼠進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 一般情況觀察表Tab.3 GeneraIobservation tab Ie

表4 一般情況綜合評(píng)分結(jié)果Tab.4 Resu It of com prehensive scores in genera In=10）

表4 一般情況綜合評(píng)分結(jié)果Tab.4 Resu It of com prehensive scores in genera In=10）

注：與模型對(duì)照組比較，##P＜0.01

組別 樣本數(shù) 評(píng)分結(jié)果空白對(duì)照組10 22.20±1.32模型對(duì)照組 10 4.60±1.35支架組 10 13.60±1.90##

2.5.2 X光片觀察結(jié)果 X線光片可觀察到大鼠左側(cè)股骨頭部位存在囊性變以及骨硬化征象，部分動(dòng)物有一定程度的股骨頭節(jié)段性扁平化或者軟骨下塌陷，呈新月?tīng)睿恢踩爰?xì)胞支架側(cè)可見(jiàn)，股骨頭壞死情況減輕，股骨頭清晰，部分動(dòng)物僅出現(xiàn)股骨頭輕度變化，例如骨小梁清晰度較差、模糊情況。

2.5.3 股骨頭大體觀察結(jié)果 空白對(duì)照組股骨頭：術(shù)后4、12、24周均可見(jiàn)關(guān)節(jié)面平整，呈半透明，瓷白色，無(wú)壞死及囊性變，股骨頭無(wú)塌陷，髖臼與關(guān)節(jié)間隙正常。模型對(duì)照組股骨頭：術(shù)后4、12、24周均可見(jiàn)大鼠可見(jiàn)股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)間隙輕度變窄，股骨變脆。隨著時(shí)間的推移，股骨頭塌陷程度變重，脆性增加。支架組股骨頭：術(shù)后4周移植物周圍有紅色結(jié)締組織出現(xiàn)，股骨頭壞死區(qū)及囊性變存在，個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)股骨頭塌陷。12周可移植物與周圍組織界限模糊，股骨頭關(guān)節(jié)面平整，壞死區(qū)與囊性變喪逐漸修復(fù)，股骨頭未見(jiàn)塌陷。24周可見(jiàn)移植物與周圍正常組織界限基本消失，股骨頭壞死區(qū)與囊性變逐漸修復(fù)，股骨頭無(wú)塌陷。見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 大鼠俯臥整體X光片圖Fig.4 Rat prone overaIIX ray fiIm

圖5 大鼠股骨頭X光片圖Fig.5 Rat femoraIhead X ray fiIm

2.5.4 光鏡觀察結(jié)果 空白對(duì)照組：軟骨片光滑，軟骨細(xì)胞排列整齊，粘合線均勻規(guī)則，骨髓腔見(jiàn)少量充血。模型對(duì)照組：軟骨面骨細(xì)胞部分變性、壞死，表面呈鋸齒狀，部分出現(xiàn)塌陷，骨髓腔出血，部分滑膜變性、壞死。支架組：纖維軟骨及軟骨關(guān)節(jié)面表面光滑，纖維軟骨下部分呈疏松狀，部分軟骨不規(guī)則，可見(jiàn)少量粘合線，極少部分軟骨細(xì)胞破壞。光鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖6。

3 討論

圖6 大鼠股骨頭光鏡下觀察結(jié)果Fig.6 Observation of rat femoraI head under Iight m icroscope

股骨頭缺血性壞死是一種致死率和致殘率極高的骨科疾病，目前采用的關(guān)節(jié)置換術(shù)和藥物治療都存在一定的局限性，而采用低侵襲性方法保存自體股骨頭是治療該病的發(fā)展趨勢(shì)。基于種子細(xì)胞、細(xì)胞因子及支架材料的 “干細(xì)胞療法”的出現(xiàn)，為股骨頭缺血性壞死的治療提供了新途徑。組織工程學(xué)技術(shù)主要將體外培養(yǎng)的活細(xì)胞種植于人工合成的或天然細(xì)胞外基質(zhì)上，再將它們移植到體內(nèi)，達(dá)到形成與原有組織所具備的功能的新生組織的目的。本實(shí)驗(yàn)將鹿角膠-殼聚糖支架用作植入成骨細(xì)胞的載體，搭載成骨細(xì)胞移植到體內(nèi)，提供生長(zhǎng)所需的微環(huán)境，使其迅速生長(zhǎng)后替代已經(jīng)壞死的骨組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植入體內(nèi)后支架與周圍組織結(jié)合緊密，材料周圍未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯的炎癥反應(yīng)、排異反應(yīng)，行走跛行，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限逐步得到改善，表明材料能有效地發(fā)揮支架作用。肉眼觀察股骨頭部位移植物與周圍正常組織界限逐漸消失，股骨頭壞死逐漸修復(fù)。X光觀察，塌陷消失，壞死區(qū)與囊性變逐漸修復(fù)，股骨頭恢復(fù)形狀完整、結(jié)構(gòu)恢復(fù)清晰，移植物逐漸在視野上消失。組織切片觀察到支架組可以見(jiàn)到少量粘合線，骨細(xì)胞部分變性、壞死狀態(tài)得到改善。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，支架能激發(fā)成骨細(xì)胞活力，調(diào)節(jié)骨的代謝，促進(jìn)新骨生長(zhǎng)，保護(hù)骨重建功能的順利進(jìn)行，對(duì)于治療股骨頭壞死具有重要的意義。

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AntIer gIue-chitosan scaffoIds repairing the experim entaI avascu Iar necrosis of femoraIhead in rats

SUN Tie-feng1，2， WANG Ping2*

（1.Shandong University of Traditional GhineseMedicine，Jinan 250355，Ghina；2.Shandong Academy of GhineseMedicine，Jinan 250014，Ghina）

AIM To study the effect of antler glue-chitosan scaffolds on repairs to avascular necrosis of the femoral head in rats.METHODS NeonatalWistar rat osteoblasts were cultured and separated by enzyme digestion under sterile condition.The osteoblast cellswere seeded onto aseptic antler glue-chitosan scaffold prepared by physicalmethod and placed in the femoralhead position with avascular necrosis.RESULTS Antler glue-chitosan scaffold not only facilitated osteoblast proliferation and vitality，but also improved the functional limitation of joints in model rats.X ray observation revealed the gradual changes of femoral head necrosis area and cystic degeneration.Lightmicrograph showed that this treatment lightened the partial denaturation and necrosis of bone cells. CONCLUSION Antlergelatin-chitosan cell scaffold has a good effecton repairs to avascular necrosis of the femoral head.

osteoblasts；antler glue-chitosan scaffolds；avascular necrosis of the femoral head；rats

R965.2

A

1001-1528（2015）11-2337-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.001

2014-12-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81273776）；山東省自主創(chuàng)新重大計(jì)劃項(xiàng)目 （2014GSF118026）；山東省科技發(fā)展專項(xiàng)（2012G0021846）；濟(jì)南青年科技明星計(jì)劃 （濟(jì)科合字 ［2012］第01-42號(hào)）

孫鐵鋒（1989—），男，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幩幚怼el：（0531）82949847，E-mail：suntiefenglove@163.com

*通信作者：王 平 （1974—），女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚怼el：（0531）82949847，E-mail：wangpingjinan @163.com