吳珍妮， 胡滿燕， 龍子江*， 周宜軒

（1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽合肥230038）

欣怡膠囊對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎癥因子及心臟組織形態(tài)的影響

吳珍妮1， 胡滿燕1， 龍子江1*， 周宜軒2

（1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽合肥230038）

目的 觀察欣怡膠囊 （丹參、紅參、水蛭、麝香）對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠血清炎癥因子水平的影響及心肌組織形態(tài)的改變，探討其心臟保護作用及機制。方法 SD大鼠隨機分為模型組和假手術組 （均為蒸餾水），欣怡膠囊高、中和低劑量組，復方丹參滴丸組。各給藥組按劑量灌胃給藥7 d，末次給藥后，結扎冠狀動脈左前降支建立心肌缺血再灌注模型，假手術組只穿線不結扎。記錄心電圖ST段的變化；采用酶聯免疫吸附法 （ELISA）測定各組大鼠血清磷酸肌酸激酶同工酶 （CK-MB）、乳酸脫氫酶 （LDH）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細胞移動抑制因子 （MIF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平；HE染色觀察心肌組織形態(tài)改變。結果 欣怡膠囊能夠使心肌缺血再灌注損傷抬高的ST段降低（P＜0.01、0.05），降低CK-MB、LDH的活性及MCP-1、MIF、TNF-α水平（P＜0.01、0.05），改善了大鼠心肌組織形態(tài)學的損傷性變化。結論 欣怡膠囊能通過降低炎癥因子的水平和抑制大鼠缺血再灌注損傷來發(fā)揮心肌保護作用。

欣怡膠囊；心肌缺血再灌注損傷；單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）；巨噬細胞移動抑制因子 （MIF）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指對缺血時間較長的心肌恢復血流后，再灌注心肌的損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷［1］。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）與急性冠脈綜合征 （ACS）的發(fā)生具有顯著相關性，可作為ACS一個預測指標［2］。其與促炎因子巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhbitory factor，MIF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）關系密切，共同參與并促進了炎癥的發(fā)展，在心肌梗死中發(fā)揮了重要作用。欣怡膠囊是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院周宜軒教授總結臨床經驗，研制出的中藥制劑，由丹參、紅參、水蛭、麝香4味中藥組成，具有活血化瘀、益氣通絡、宣痹止痛的功效。其治療冠心病在動物實驗及臨床試驗中皆得到較滿意的療效［3］。本實驗通過檢測大鼠血清MIF、MCP-1、TNF-α的水平，旨在進一步研究欣怡膠囊是否對缺血再灌注損傷大鼠有保護作用并探討其可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物 雄性SD大鼠 （230±20）g（安徽醫(yī)科大學動物中心提供），動物生產許可證號SCXX（皖）2005-001。

1.2 實驗藥物與試劑 欣怡膠囊 （安徽濟人藥業(yè)股份有限公司，批號130501），此方由丹參、紅參、水蛭、麝香4味中藥組成；復方丹參滴丸（天津天士力股份有限公司，批號131215）；臨用前均用蒸餾水配制成所需質量濃度。大鼠乳酸脫氫酶（LDH）（南京建成科技有限公司，批號E-30385）；磷酸肌酸激酶同工酶 （CK-MB）（南京建成科技有限公司，E-30718）；大鼠巨噬細胞移動抑制因子 （MIF）（南京建成科技有限公司，批號E-30576）；大鼠單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）（南京建成科技有限公司，批號E-30494）；大鼠腫瘤壞死因子 （TNF-α）（南京建成科技有限公司，批號E-30633）；水合氯醛 （上海強順化學試劑有限公司，批號20100104）。

1.3 主要儀器 XD-7100型心電圖儀 （上海醫(yī)用電子儀器廠）；HX-300動物呼吸機 （成都泰盟科技有限公司）；佳能數碼相機；奧林巴斯AU640全自動生化儀；YBL-2生物組織包埋機（孝感亞光醫(yī)用生物科技研究所）；YT-6生物組織烘烤機 （孝感亞光醫(yī)用生物科技研究所）；LEICA RM234石蠟切片機 （萊卡上海分公司）；JW 3021HR型離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組和給藥 健康雄性SD大鼠60只隨機分為假手術組、模型組、陽性對照組 （復方丹參滴丸：臨床人日用劑量為0.81 g，按體表面積折算，大鼠每日給藥量30 mg/kg）、欣怡膠囊高、中、低劑量組 （臨床人日用生藥量18.02 g，同法折算得大鼠每日給藥量8.4、4.2、2.1 g/kg）。藥物組連續(xù)灌胃給藥7 d，其余兩組給予等容積生理鹽水同法操作，各組每日給藥一次。

2.2 模型建立 模型的建立參照經典MIRI造模方法并與實際結合如下所述：術前禁食12 h，末次給藥30 min后，采用3.5%的水合氯醛（1 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥固定于手術臺上。針形電極插入四肢皮下，連接心電圖機，記錄正常Ⅱ導聯心電圖。在胸骨左側約0.5 cm處，第3、4肋間切口；鈍性分離至肋間隙，用彎頭鉗打開胸腔，擠壓心臟，使其充分暴露；在左心耳和肺動脈圓錐間找到與左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈，在左心耳下方2 mm處以5～0無損傷縫合針穿線，進針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm；結扎前于冠狀靜脈處放置棉線，連同棉線 （1.5～2.0 mm）一起結扎冠狀動脈前降支，造成心肌缺血。30 min再次開胸，剪斷結扎線，使其再灌注120 min，假手術組按同法操作，但只穿線不結扎。經口腔插入橡皮管連接小動物呼吸機給予人工機械呼吸，頻率45～50次/min，潮氣量1～2 mL/ 100 g，呼吸比5：3。

模型復制成功的標準：Ⅱ導聯心電圖ST段在結扎后明顯抬高表示心肌缺血成功復制，再灌注模型成功復制為剪斷結扎線后，抬高的ST段下降1/2以上［4］。造模過程中每組1～2只大鼠由于心室顫動、氣胸或大出血等原因死亡。各組取8只進行有關指標檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 大鼠心電圖J點變化 分別于冠狀動脈結扎前、結扎后30 min和再灌注后30、60、120 min記錄心電圖。觀察II導聯ST段的變化，用游標卡尺測量心肌缺血前后和再灌注前后ST段高度并統(tǒng)計數據。

2.3.2 大鼠血清心肌損傷酶LDH、CK-MB水平的測定 再灌注120 min結束后，3.5%水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血5 m L，3 000 r/min離心15 min，取血清，采用酶聯免疫吸附法 （ELISA）測定各組大鼠血清心肌損傷酶LDH、CK-MB水平。檢測步驟按照各試劑盒說明書依法操作。

2.3.3 大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α水平的測定 方法同“2.3.2”項測定MCP-1、MIF、TNF-α水平。

2.3.4 心肌組織形態(tài)學觀察 再灌注結束后，處死大鼠，取心臟左心室組織置于10%中性甲醛溶液中固定1周，常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋，切片，厚度為5μm，HE染色，觀察各組大鼠心臟組織形態(tài)。

2.4 數據分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。數據結果以表示，定量資料多組間兩兩比較采用方差分析 （方差齊采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett t檢驗）。

3 結果

3.1 欣怡膠囊對MIRI大鼠心電圖的影響 結果如表1所示，模型組大鼠心肌缺血30 min，再灌注30、60、120 min心電圖ST段明顯抬高，假手術組變化不明顯，二者相比有顯著性差異 （P＜0.01）。與模型組相比，藥物組ST段都有下降趨勢，部分差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01或P＜0.05）。

表1 欣怡膠囊對心肌缺血再灌注后大鼠心電圖ST段的影響Tab.1 Effects of Xinyi Capsu Ies on ECG-ST in m yocardia Iischem ia-reperfusion rat

表1 欣怡膠囊對心肌缺血再灌注后大鼠心電圖ST段的影響Tab.1 Effects of Xinyi Capsu Ies on ECG-ST in m yocardia Iischem ia-reperfusion rat

注：與假手術組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05

30 min 60 min 120 min假手術組 —組別 劑量/（g.kg-1） 正常心電圖 缺血30 min心電圖 再灌注后心電圖0.094 5±0.013 0.118±0.011 0.116±0.035 0.118±0.022 0.116±0.012模型組 — 0.105±0.013 0.33±0.032** 0.297±0.025** 0.281±0.051** 0.232±0.028**欣怡膠囊高劑量組 8.4 0.113±0.03 0.23±0.038△ 0.183±0.026△△0.167±0.066△△ 0.117±0.043△△欣怡膠囊中劑量組 4.2 0.108±0.019 0.292±0.035 0.199±0.031△△0.153±0.044△△ 0.125±0.029欣怡膠囊低劑量組 2.1 0.092±0.011 0.258±0.023△△ 0.224±0.044△△0.174±0.017△△ 0.149±0.038△△復方丹參滴丸組 3×10-2 0.011 4±0.023 0.268±0.105 0.188±0.022△△0.144±0.096△△ 0.117±0.048△△

3.2 欣怡膠囊對MIRI模型大鼠血清心肌損傷酶CK-MB、LDH的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清CK-MB、LDH水平顯著上升，差異均具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）；與模型組比較，欣怡膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性組血清CK-MB水平明顯下降，具有顯著性差異 （P＜0.01），欣怡膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性組LDH水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01或P＜0.05），見圖1。

圖1 欣怡膠囊對心肌缺血再灌注后大鼠血清CK-MB（A）、LDH（B）的影響Fig.1 Effects of Xinyi Capsu Ies on CK-MB（A），LDH（B）IeveIs in serum ofm yocardiaIischem ia-reperfusion injured rats

3.3 欣怡膠囊對MIRI模型大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α水平顯著升高，具有顯著性差異 （P＜0.01）；與模型組比較，欣怡膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性組血清MCP-1、MIF、TNF-α水平下降，有明顯差異（P＜0.05），見表2。

表2 欣怡膠囊對M IRI模型大鼠血清MCP-1、M IF、TNF-α水平的影響Tab.2 E ffects of Xinyi Capsu Ies on M CP-1，M IF，TNF-αin IeveIs in serum of m yocardiaI ischem ia-reperfusion inju red（M IRI）rats

表2 欣怡膠囊對M IRI模型大鼠血清MCP-1、M IF、TNF-α水平的影響Tab.2 E ffects of Xinyi Capsu Ies on M CP-1，M IF，TNF-αin IeveIs in serum of m yocardiaI ischem ia-reperfusion inju red（M IRI）rats

注：與假手術組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05

組別 劑量/（g.kg-1） MCP-1/（ng.L-1） MIF/（μg.L-1） TNF-α/（ng.L-1）假手術組 —251.34±7.93 22.96±2.02 121.73±6.10模型組 — 283.72±14.77** 28.40±3.03** 165.84±25.64**欣怡膠囊高劑量組 8.4 267.62±5.62△△ 24.26±1.70△△ 131.08±16.21△△欣怡膠囊中劑量組 4.2 262.24±6.43△△ 25.79±1.30△ 140.56±9.467△欣怡膠囊低劑量組 2.1 266.18±16.74△ 25.89±1.08△ 143.51±7.99△復方丹參滴丸組 3×10-2 262.56±10.94△△ 24.22±2.00△△ 133.40±17.71△

3.4 欣怡組織形態(tài)學觀察結果 光鏡下觀察，假手術組可見心肌纖維完整、細胞間排列緊密、核仁清晰、橫紋清晰，未見壞死灶及炎性細胞浸潤（圖2-a）。模型組可見大鼠心肌纖維斷裂、心肌細胞排列紊亂、出現核固縮、細胞形態(tài)模糊、橫紋不清、炎癥細胞浸潤、細胞間隙增大等 （圖2-b）。陽性組 （圖2-c）、欣怡膠囊高劑量組 （圖2-d）、中劑量組 （圖2-e）、低劑量組 （圖2-f）與模型組比較炎癥細胞浸潤較輕、心肌細胞排列整齊，心肌走向較清晰。

圖2 欣怡膠囊對M IRI大鼠心肌組織形態(tài)學的影響（HE，×400）Fig.2 E ffects of Xinyi Capsu Ies on m yocardium tissue patho Iogies in M IRI rats（HE，×400）

4 討論

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是目前全球發(fā)病率和病死率較高的疾病之一。臨床上常采用血栓溶栓術、血管成形術、冠狀動脈搭橋術及心臟移植術等對阻塞后的冠狀動脈血管進行恢復血流治療。MIRI則是其治療后嚴重的并發(fā)癥之一［5］。心肌細胞膜在MIRI時常導致細胞內LDH、CK-MB外漏，故二者常被作為臨床上判斷心肌損傷的特異性指標［6］。本實驗發(fā)現，欣怡膠囊對MIRI模型大鼠進行預處理后CK-MB、LDH的水平均顯著降低。HE染色顯示，模型組大鼠心肌纖維斷裂、心肌細胞排列紊亂、出現核固縮、細胞形態(tài)模糊、橫紋不清、炎癥細胞浸潤、細胞間隙增大等。應用欣怡膠囊干預后，炎癥細胞浸潤較輕、心肌細胞排列整齊，心肌走向較清晰，細胞形態(tài)較模型組明顯改善。表明應用欣怡膠囊治療MIRI模型大鼠能減少CK-MB、LDH的外漏，并在一定程度上保護了細胞膜的完整性，增強心肌細胞對抗MIRI的能力。

心肌梗死后，在損傷局部會有炎癥產生并生成

多種趨化因子，加重了炎癥細胞的浸潤。MCP-1是獨立預測冠心病的特異的單核細胞因子之一，與冠心病關系密切［7-8］。Arakelyan A［9］等研究發(fā)現AMI患者的血清MCP-1水平明顯升高。MCP-1主要由內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞以及單核細胞產生，其能趨化并激活單核/巨噬細胞遷移并聚集在血管內膜下并抑制其隨機移動和化學趨化性，后活化為巨噬細胞，吞噬類脂質，形成富含膽固醇酯的泡沫細胞［10-11］?，F已有研究證明可將其作為預測ACS一個指標［2］。MIF是近年來研究發(fā)現的一種新的炎性反應標志物，與炎癥、血管等方面的疾病有關。余文輝等［12］研究發(fā)現，AMI患者血漿MIF水平明顯升高。MIF主要由巨噬細胞、T淋巴細胞及單核細胞、泡沫細胞分泌與釋放。其作用機制通過誘導促進MCP-l的表達，并經依賴MCP-1的作用機制聚集巨噬細胞發(fā)揮作用。MIF作為前炎癥因子還可以通過促進巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-8等多種細胞因子，產生炎癥放大效應間接的發(fā)揮炎癥調節(jié)功能［13-14］。TNF-α由巨噬細胞產生，是體內重要的炎癥因子，可通過自分泌效應作用于其它巨噬細胞，引起更多巨噬細胞進一步活化，使炎癥反應擴大［15］。其中MIF與TNF-α都可以通過刺激巨噬細胞相互促進彼此的釋放從而構成了一個復雜的炎癥反應系統(tǒng)。此外，在心肌細胞中TNF-α也可以誘導MCP-1的表達。而通過本實驗發(fā)現，模型組大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α濃度顯著升高；欣怡膠囊對MIRI模型大鼠進行干預后血清MCP-1、MIF與TNF-α的水平都明顯下降，減輕了心肌細胞損傷，提示MCP-1、MIF、TNF-α可能成為預測MIRI的指標。

綜上所述，欣怡膠囊預處理MIRI模型大鼠后可以減輕心肌損傷，保護心肌。這可能與減少細胞因子MCP-1、MIF、TNF-α的水平有關。

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InfIuence of Xinyi Capsu Ies on infIammatory factors and m yocardium tissue morphoIogy in ratsw ith m yocardiaI ischem ia-reperfusion injury

WU Zhen-ni1， HU Man-yan1， LONG Zi-jiang1*， ZHOU Yi-xuan2

（1.Anhui University of Traditional GhineseMedicine，Hefei230038，Ghina；2.First Hospital Affiliated to Anhui University of Traditional GhineseMedicine，Hefei 230038，Ghina）

AIM To observe the effects of XinyiCapsules（Salvia mitiorrhiza，Radix ginseng rubra，whitmania pigra，Moschus）on serum cell factor cytokine MCP-1，MIF，TNF-αand myocardium tissue morphology in myocardial ischemia-reperfusion injured（MIRI）rats and itsmechanism.M ETHODS SD rats were randomized into six groups，including themodel group and sham group（both fed with distilled water），Xinyi Capsules high，medium and low dose groups，and Compound Danshen Dripping Pills group，successive administering for seven days.The ratsweremolded MIRI by closing the left anterior descending coronary artery after the last administration.ST segment changes were recorded，blood samples were collected from the abdominal vein，the serum was measured for the levels of MCP-1，MIF and TNF-αby ELISA and myocardium tissuemorphology was observed by HE staining.RESULTS Compared with themodel group，the experiment data revealed that Xinyi Capsules attenuated ST segment elevation and serum levels of CK-MB，LDH，MCP-1，MIF and TNF-αin the drug therapy groups decreased significantly while ameliorated myocardium pathological changes.CONCLUSION Xinyi Cap-

Xinyi Capsules；ischemia-reperfusion injured；MCP-1（monocytechemoattractant protein-1）；MIF（macrophagemigration inhbitory factor）；TNF-α（tumor necrosis factor-α）

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2342-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.002

2014-11-21

安徽省研究生 “千人計劃”項目資助 （2015）

吳珍妮 （1991—），女，碩士生，從事中藥對心腦血管疾病防治作用的研究。Tel：15209880225，E-mail：zhennijw@ 163.com

*通信作者：龍子江 （1957—），男，教授，從事中藥對心腦血管疾病防治作用的研究。Tel：（0551）5169216，E-mail：lzjyls@ 163.com

sules play a role in cerebral protection inhibiting the MIRI and promoting myocardium possibly by reducing the MCP-1，MIF and TNF-αlevels in the rats.