李輝敏， 殷嫦嫦， 姜登釗

（1.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西九江332000；2.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江332000）

刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮體內(nèi)抗腫瘤作用初探

李輝敏1， 殷嫦嫦1， 姜登釗2

（1.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西九江332000；2.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江332000）

目的 研究刺頭復(fù)葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）總黃酮的體內(nèi)抗腫瘤活性。方法 應(yīng)用HepG2細(xì)胞裸小鼠異位移植瘤模型，通過(guò)測(cè)定抑瘤率及檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)、HE染色、免疫組化等方法了解其抗腫瘤作用及作用機(jī)制。結(jié)果 刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮能夠抑制肝癌異位移植瘤模型動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量、血液系統(tǒng)無(wú)明顯影響，腫瘤組織中促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯下調(diào)。結(jié)論 體內(nèi)抗腫瘤活性的研究顯示刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮抗腫瘤作用可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

刺頭復(fù)葉耳蕨；總黃酮；裸小鼠；HepG2細(xì)胞；增殖

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，而我國(guó)是肝癌的高發(fā)地區(qū)，每年全球新發(fā)肝癌病例中我國(guó)占45%［1］。目前臨床肝癌診療中還存在著早期診斷難、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高和治療手段少等問題［2］。因此，尋找和發(fā)掘新的肝癌治療藥物顯得尤為重要和迫切。近年來(lái)，多傾向于采用綜合措施治療肝癌，其中中醫(yī)藥是非常重要的一部分。中醫(yī)藥在抗癌方面展現(xiàn)出獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，因其抗腫瘤作用溫和，能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，緩解癥狀，減少治療的不良反應(yīng)等作用而受到了眾多學(xué)者的研究和關(guān)注［3］。

刺頭復(fù)葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）為鱗毛蕨科復(fù)葉耳蕨屬植物，廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶濕潤(rùn)區(qū)域，以亞洲東部和東南部種類最為豐富，我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江流域以南地區(qū)及山東、河南等省，具有清熱利濕，抗菌消炎，鎮(zhèn)靜作用，民間用于治療急性黃疸型肝炎、關(guān)節(jié)炎、痢疾、燙火傷等［4］。有研究表明鱗毛蕨類植物有包括抗病毒、

抗腫瘤等藥理作用，產(chǎn)生這些藥理作用的成分是黃酮類化合物或總間苯三酚類化合物［5］。本研究應(yīng)用HepG2細(xì)胞裸小鼠異位移植瘤模型，通過(guò)測(cè)定抑瘤率及檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)、HE染色、免疫組化等方法了解刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 樣品與試劑 刺頭復(fù)葉耳蕨根莖采自江西省星子縣，由九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院高春華教授鑒定為鱗毛蕨科（Dryopteridaceae）復(fù)葉耳蕨屬（Arachniodes）刺頭復(fù)葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）；刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮：取刺頭復(fù)葉耳蕨75%乙醇提取液濃縮后經(jīng)聚酰胺純化得到刺頭復(fù)葉耳蕨洗脫液，濃縮、冷凍干燥而得；測(cè)定總黃酮的量為82.86%。5-氟尿嘧啶 （5-FU）針劑 （上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)121208）；DMEM/F-12培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清［TransGen Biotech（TRANS）］；胰蛋白酶、二甲基亞砜 （DMSO）、瓊脂糖（Solarbio公司）；DMSO（AR，天津科密歐化學(xué)試劑公司）；總蛋白提取試劑盒 （北京艾德萊公司）；4%多聚甲醛固定液、蘇木精-伊紅染色液（湖北百奧斯生物科技有限公司）；Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒（美國(guó)eBioscience公司）；其余所有試劑，均為分析純。

1.2 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人肝癌HepG2細(xì)胞株由同濟(jì)醫(yī)院肝膽外科提供。BALB/c-nu免疫缺陷裸小鼠 （SPF級(jí)）25只，4～5周齡，雄性，購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2009-0004。

1.3 主要儀器 BT224S型電子天平 （德國(guó)賽多利斯）；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 （SIM公司）；離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Olympus-Ckx41熒光倒置顯微鏡 （日本Olympus公司）；游標(biāo)卡尺 （哈爾濱量具刃具集團(tuán)公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海愛寶醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

將HepG2細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清），在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3 d換液一次至細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底90%左右時(shí)傳代。

在免疫缺陷的裸小鼠體內(nèi)異位移植人肝癌HepG2細(xì)胞，建立動(dòng)物肝癌異位移植性腫瘤模型，通過(guò)分組給藥，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)相關(guān)生物樣品進(jìn)行生化、病理檢測(cè)，對(duì)腫瘤組織中部分凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮體內(nèi)抗腫瘤作用及其機(jī)制。

2.1 樣品配制 陰性對(duì)照：精密稱取羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）1.0 g置于200 mL蒸餾水中，充分溶脹，加熱溶解，配制成為0.5%CMC-Na溶液。陽(yáng)性對(duì)照：取5-FU適量加入蒸餾水配制成為相應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照溶液。樣品溶液：分別精密稱取一定量的刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮樣品，加適量0.5%CMC-Na溶劑，混合均勻配制不同質(zhì)量濃度樣品溶液。

2.2 動(dòng)物腫瘤模型的制備 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以不含血清的培養(yǎng)液沖洗2次，重懸，調(diào)整計(jì)數(shù)至約為1×107/mL。分別吸取以上細(xì)胞懸液0.2 mL接種于每只裸鼠的背部皮下。

2.3 給藥分組 免疫缺陷的裸小鼠接種人肝癌HepG2細(xì)胞后密切觀察其接種部位的腫瘤生長(zhǎng)情況。將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，刺頭復(fù)葉耳蕨低劑量組、高劑量組，每組6只，分別以0.5%CMC-Na溶液、10 mg/kg 5-FU、500 mg/kg總黃酮、125 mg/kg總黃酮進(jìn)行給藥。各組動(dòng)物均采用腹腔注射 （ip）給藥，隔天給藥一次，連續(xù)4周。觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。

2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 在裸小鼠體外測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）及短徑 （b），計(jì)算體積 （V，mm2）；計(jì)算相對(duì)腫瘤體積（RTV）。V=（a×b2）/2，RTV=Vt/ V0（V0為首次分組給藥時(shí)測(cè)得的腫瘤體積，Vt為以后每次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積）。

2.5 病理檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥結(jié)束后，處死并進(jìn)行解剖，分別收集其血樣及腫瘤組織；取血液標(biāo)本進(jìn)行部分相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)；取部分腫瘤組織標(biāo)本，以4%多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行相關(guān)病理檢測(cè)，凍存其余腫瘤組織。

2.5.1 血液分析 取各組全血樣本進(jìn)行相關(guān)血液分析，對(duì)血樣中紅細(xì)胞 （RBC）、白細(xì)胞 （WBC）、血小板 （PLT）分別計(jì)數(shù)，測(cè)定血紅蛋白（Hb）量。

2.5.2 組織形態(tài)觀察 取各組腫瘤組織按照蘇木精-伊紅 （HE）染色法進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)。

2.5.3 免疫組織化學(xué)分析［6］取各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤組織，常規(guī)制片，分別按Bcl-2、Bax的免疫組化試劑盒說(shuō)明書方法，對(duì)其進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，分析Bcl-2、Bax蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀況的觀察 在接種HepG2細(xì)

胞一段時(shí)間后，各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可見接種部位的皮下出現(xiàn)明顯腫塊，表明異位移植人肝癌HepG2細(xì)胞裸小鼠腫瘤模型建立成功；各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飲食、飲水及排泄均正常，基本狀況表現(xiàn)良好；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組實(shí)驗(yàn)裸小鼠進(jìn)行解剖觀察，無(wú)明顯臟器損傷。

3.2 刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)肝癌模型裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 結(jié)果見圖1，與陰性對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用不同質(zhì)量濃度的刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮樣品溶液進(jìn)行治療后，其移植瘤生長(zhǎng)速度明顯下降，顯示刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮具有良好的抑制人肝癌異位移植瘤模型裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的作用。

圖1 刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of Arachniodes exilis totaI fIavonoids on the grow th of tumor in nudem ice

對(duì)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組的相對(duì)腫瘤體積變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖2。

圖2 各組肝癌異位移植瘤模型裸鼠的相對(duì)腫瘤體積的變化Fig.2 Changes of the reIative tumor voIumes of tumorbearingm ice in each group

3.3 刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)肝癌模型裸鼠血液的影響 結(jié)果見表1。分組給藥4周后，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液部分生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組 （5-FU給藥組）與陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較，其相應(yīng)血小板指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果有顯著性差異，證明5-FU對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液具有一定毒性。而不同質(zhì)量濃度刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮處理組與陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析無(wú)顯著性差異，這就提示了刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)模型裸鼠無(wú)明顯的血液損傷。

3.4 腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤組織的HE染色結(jié)果如圖3所示，陰性對(duì)照組裸鼠的腫瘤組織中癌細(xì)胞排列較緊密、核大且具異型性、核胞質(zhì)比大；而經(jīng)不同劑量刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮和陽(yáng)性對(duì)照5-FU處理后的模型動(dòng)物腫瘤組織中細(xì)胞排列較稀疏，可見細(xì)胞皺縮、破碎、染色質(zhì)消失等現(xiàn)象，表現(xiàn)出了不同程度的壞死。

表1 裸鼠血液學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)Tab.1 Assays of the haematoIogicaI indexes of nudem ice

表1 裸鼠血液學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)Tab.1 Assays of the haematoIogicaI indexes of nudem ice

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 紅細(xì)胞/（×1012.L-1） 白細(xì)胞/（×109.L-1） 血小板/（×109.L-1） 血紅蛋白/（g.L-1）9.60±1.62 12.26±2.43 686.20±105.99 163.18±24.01刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮低劑量組 9.54±1.75 12.14±2.39 678.02±128.52 165.60±15.92刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮高劑量組 9.18±1.34 11.66±1.34 669.42±95.46 158.49±27.73陽(yáng)性對(duì)照組 9.12±1.31 7.56±1.44*陰性對(duì)照組618.78±93.81 154.74±26.53

圖3 各組裸鼠腫瘤組織HE染色Fig.3 HE stainings of tumor tissues beIonging to nude m ice in different groups

3.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤組織中Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見圖4、圖5。

如圖4所示，經(jīng)過(guò)不同劑量的刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮處理后，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝癌異位移植瘤模型裸鼠腫瘤組織中抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低。

如圖5所示，經(jīng)過(guò)不同劑量的刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮處理后，與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤組織中的促凋亡蛋白Bax的表達(dá)陽(yáng)性率明顯增加；結(jié)合抗凋亡蛋白Bcl-2的測(cè)定結(jié)果，說(shuō)明經(jīng)過(guò)不同劑量的刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮處理后，可能引起模型動(dòng)物腫瘤組織中肝癌細(xì)胞的凋亡。

4 討論

本研究通過(guò)建立肝癌異位移植瘤模型，考察了刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮的體內(nèi)抗腫瘤作用。通過(guò)觀察藥物對(duì)模型動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)的影響，測(cè)定部分血液學(xué)指標(biāo)以及對(duì)腫瘤組織進(jìn)行HE染色觀察組織壞死情況等試驗(yàn)，證實(shí)刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮能夠抑制肝癌異位移植瘤模型動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液系統(tǒng)沒有明顯的影響，提示其在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)可能不良反應(yīng)較少發(fā)生。

圖4 腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白BcI-2的表達(dá)Fig.4 Expressions of apoptosis-reIated protein BcI-2 in tumor tissues

圖5 腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)Fig.5 Expressions of apop tosis-reIated p rotein Bax in tumor tissues

為進(jìn)一步研究刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮體內(nèi)抗腫瘤作用機(jī)制，我們采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制相關(guān)蛋白進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示：經(jīng)刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮處理后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤組織中的促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯下調(diào)；相應(yīng)Bax/Bcl-2比例增大。Bcl-2家族作為復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)共同參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，成為惡性腫瘤治療的靶標(biāo)之一［7］。Bcl-2家族包括抑凋亡基因群（如Bcl-2、Bcl-xl

等）和促凋亡基因群 （如Bax、Bad等），各基因群發(fā)揮不同的作用，促進(jìn)凋亡與抑制凋亡作用相互制約，其中Bax和Bcl-2基因具有40%的同源性［8-9］，當(dāng)Bax/Bcl-2比例較高時(shí)，細(xì)胞趨于凋亡，反之則細(xì)胞凋亡下降［10-12］。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝癌移植瘤模型裸鼠腫瘤組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯升高，從整體動(dòng)物水平證實(shí)了刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮抗腫瘤作用與其促腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)采用了肝癌異位移植瘤模型裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，初步評(píng)價(jià)了刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮體內(nèi)抗肝癌的效果，并探討了其在體內(nèi)抗癌作用的可能機(jī)制。肝癌異位移植瘤動(dòng)物模型操作簡(jiǎn)單、腫瘤潛伏期短、模型成瘤率高，并且具有便于從體外觀察等特點(diǎn)［13-14］，能大大縮短實(shí)驗(yàn)周期，適用于對(duì)抗腫瘤藥物的篩選。

在今后的實(shí)驗(yàn)中，還需要通過(guò)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的例數(shù)以使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠、更具有說(shuō)服力，此外還可使用其他肝癌動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮的體內(nèi)抗肝癌作用。

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Anti-tumor effect of totaI fIavonoids from Arachniodes Exilis Ching in vivo

LIHui-min1， YIN Chang-chang1， JIANG Deng-zhao2

（1.Basic Medical Gollege of Jiujiang University，Jiujiang 332000，Ghina；2.School of Pharmacy and Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，Ghina）

AIM To investigate the effects of total flavonoids from Arachniodes Exilis Ching on anti-tumor activity in vivo.METHODS HepG2 cell heterotopic graftmodelwas setup in nudemice，inhibitory rate and biochemical indices were determined，then HE staining and immunohistochemistry were performed to determine its mechanism of action.RESULTS Tumor growth in nudemicewith hepatoma heterotopic graftwas inhibited by total flavonoids from A.Exilis.Ithad no significant influence with theweightand blood system of experimentalmice. Meanwhile，the expression levels of pro-apoptotic protein Bax in tumor tissue weremarkedly increased.However，anti-apoptotic protein Bcl-2 expression levelsweremarkedly reduced.CONCLUSION Studies on anti-tumor activity in vivo show that the anti-tumor effects of total flavonoids from A.Exilis may be related to induced-apoptosis of tumor cells.

Arachniodes Exilis Ching；total flavonoids；nudemice；HepG2 cell；proliferation

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2347-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.003

2014-12-01

國(guó)家自然科學(xué)基金 （81160536）；江西省教育廳資助項(xiàng)目 （GJJ12737）

李輝敏 （1974—），女，博士，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究。Tel：（0792）8568166，E-mail：13970280063@163.com