于文會(huì)，姜 龍，蘇 景，鄒佳妤，李子佳，姜曉文

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

野菊花水煎劑對(duì)免疫應(yīng)激雞血清ACTH和CORT含量及下丘腦CRH m RNA表達(dá)影響

于文會(huì)1，姜 龍1，蘇 景2，鄒佳妤1，李子佳1，姜曉文1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

為了研究野菊花水煎劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性免疫應(yīng)激雞血清中，促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)酮（CORT）含量及下丘腦中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）mRNA表達(dá)水平的影響。試驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組和野菊花組，平均每組80只雛雞。野菊花組于30日齡口服野菊花水煎劑，早晚兩次，連續(xù)7 d。對(duì)照組和野菊花組32日齡胸肌肉注射接種10羽份的新城疫Ⅰ系疫苗，造成實(shí)驗(yàn)性免疫應(yīng)激，空白組注射等量生理鹽水。每組分別于免疫接種后1、3、5、7、14、21 d隨機(jī)抓取10只雞心臟采血并取下丘腦。雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)免疫應(yīng)激后血清中ACTH和CORT的含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定下丘腦CRHmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，野菊花能顯著抑制血清中ACTH和CORT的含量及下丘腦中CRHmRNA的表達(dá)，對(duì)免疫應(yīng)激有較好的緩解作用。

野菊花；免疫應(yīng)激；雞；激素；mRNA

現(xiàn)代化畜禽養(yǎng)殖過程中，疫苗對(duì)保護(hù)動(dòng)物的健康生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用。但疫苗作為一種特殊的免疫刺激因子，同時(shí)也會(huì)引起免疫應(yīng)激。免疫應(yīng)激會(huì)對(duì)動(dòng)物的免疫功能、物質(zhì)代謝、生長(zhǎng)生產(chǎn)性能等有廣泛的不良影響，甚至?xí)饎?dòng)物死亡[1-2]。現(xiàn)在常用抗免疫應(yīng)激飼料添加劑來緩解免疫應(yīng)激，主要包括維生素、糖類、有機(jī)酸、電解質(zhì)和抗生素等[3]。有關(guān)中藥抗畜禽的免疫應(yīng)激研究與應(yīng)用還較少，中藥是一種相對(duì)“綠色”的藥物，擅長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)體平衡。野菊花具有清熱解毒、疏風(fēng)平肝的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其有抗微生物、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[4]。本文通過探討野菊花在抗免疫應(yīng)激中的作用與效果，為今后中藥緩解畜禽免疫應(yīng)激的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 野菊花，購(gòu)自哈爾濱中藥材市場(chǎng)；雞新城疫Ⅰ系苗為乾元浩生物股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：獸藥生字（2010）010082073；雞促腎上腺皮質(zhì)激素ELISA檢測(cè)試劑盒和雞皮質(zhì)酮ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自卡爾文生物科技有限公司；TRIZol Reagent為美國(guó)Invitrogen life technologies公司生產(chǎn)；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）和SYBR?Premix EX TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；ABI 7500 Real-Time PCR擴(kuò)增儀。

1.2 野菊花水煎劑的制備 野菊花1 500 g，蒸餾水浸泡1 h，頭煎45min、二煎30min、三煎15min，將3次所得煎液混合后，1 500 r/min離心5min，取上清液濃縮至3 000mL，濃度為0.5 g生藥/mL。自動(dòng)包裝機(jī)裝袋密封，4℃保存。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)選取1日齡的海藍(lán)公雞雛200只，常規(guī)飼養(yǎng)至30日齡淘汰體重偏大偏小的雞，選取平均體重265 g±5 g的雞180只隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組和野菊花組，各組間實(shí)驗(yàn)前體重差異不顯著，每組平均80只雛雞。野菊花組從30日齡早晚兩次各口服1mL野菊花水煎劑，連續(xù)7 d。對(duì)照組和野菊花組32日齡胸肌肉注射接種10羽份NDⅠ系疫苗,空白組注射等量的生理鹽水

雛雞環(huán)境溫度控制為第1周35℃～37℃，以后每周降2℃，最后控制在30℃左右，直至試驗(yàn)結(jié)束。1～3日齡全天給予光照；4～14日齡每天減少1 h直到13 h；15～21日齡每天減少0.5 h直到9.5 h；4周齡每天9 h；5周齡至試驗(yàn)結(jié)束每天8 h，光照強(qiáng)度10 lux。自由采食全價(jià)飼料和自由飲水。

1.4 樣本的采集與處理 分別于雛雞免疫后1、3、5、7、14、21 d每組取10只雞，5mL注射器心臟采血，室溫靜置促其凝固，2 000 r/min離心5～10 min得上清，-80℃保存。取下丘腦于-80℃保存。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 雞促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)酮（CORT）的測(cè)定 采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，每樣重復(fù)3次。

1.5.2 RT-PCR法測(cè)定雞下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）mRNA的表達(dá)：（1）mRNA引物的設(shè)計(jì)與合成：CRH上游引物:5′-GAC CTG ACT TTCCAC CTG CT-3′，下游引物:5′-CCTCAC TTC CCG ATG ATT TC-3′產(chǎn)物長(zhǎng)度110 bp；β-actin上游引物：5′-GCC CAT CTA TGA AGG CTA CG-3′，下游引物:5′-GCTGTGGTGGTG AAGCTG TA-3′產(chǎn)物長(zhǎng)度123 bp；（2）總RNA的提取及模板cDNA的合成：按照TRIZol試劑盒說明書從下丘腦中提取總RNA。測(cè)定各樣品的總RNA濃度及A260/ A280的比值，比值在1.8～2.0之間時(shí)可用。模板cDNA的合成添加試劑按照說明書要求，反應(yīng)條件為：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃；（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的確定及樣品的檢測(cè)：反應(yīng)條件采取兩步法PCR擴(kuò)增程序：第一步預(yù)變性：95℃，30 s；第二步PCR反應(yīng)：40循環(huán)，95℃，5 s；60℃，34 s。每個(gè)樣品做3孔重復(fù)試驗(yàn)。用2-△△Ct法計(jì)算CRH分子mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組之間進(jìn)行單因素LSD法方差分析，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。采用Microsoft Excel 200-7軟件作圖。各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（X±S）。

2 結(jié)果

2.1 免疫應(yīng)激對(duì)ACTH和CORT濃度的影響 由表1可知，免疫應(yīng)激后的第1天對(duì)照組與空白組比較差異極顯著（P＜0.01），野菊花組差異顯著（P＜0.05）；第3天對(duì)照組、野菊花組與空白組比較差異顯著（P＜0.05）；第5天時(shí)，對(duì)照組與空白組比較仍有顯著差異（P＜0.05），野菊花組與對(duì)照組比較顯著降低（P＜0.05）；到第7天往后，各組無顯著差異。

由表2可知，免疫應(yīng)激后的第1～3天，對(duì)照組和野菊花組血清中CORT的濃度均極顯著性升高（P＜0.01）；第5天對(duì)照組仍極顯著升高（P＜0.05），野菊花組與空白組比較無顯著差異（P＞0.05），與對(duì)照組比較顯著降低（P＜0.05）；第7天后，各組差異均不顯著。

表1 雛雞血清中ACTH的含量 （pg/mL）

表2 雛雞血清中CORT的含量 （pg/mL）

2.2 免疫應(yīng)激對(duì)下丘腦CRH mRNA表達(dá)水平的影響 由下丘腦CRH mRNA表達(dá)水平（見表3）可知，免疫應(yīng)激后第5天，對(duì)照組和野菊花組下丘腦中CRH mRNA的表達(dá)量與空白組比較有極顯著的提高（P＜0.01）；野菊花組與對(duì)照組比較有極顯著的降低（P＜0.01）。說明，野菊花對(duì)降低免疫應(yīng)激雞下丘腦中CRH mRNA的表達(dá)有顯著的作用。

表3 雛雞接種NDⅠ系疫苗后5 d下丘腦CRHm RNA的表達(dá)水平

3 討論

應(yīng)激的作用機(jī)制主要是由糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的，當(dāng)動(dòng)物處于免疫應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic Pituitary Adrenal axis，HPA），下丘腦合成和分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（Corticotropin Releasing Hormone，CRH）增強(qiáng)，激活垂體前葉合成釋放促腎上腺皮質(zhì)激素（Adre?nocorticotropic Hormone，ACTH），ACTH刺激促腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)分泌糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid，GC）[5]，家禽的為皮質(zhì)酮（Corticosterone，CORT）[6]。CRH是調(diào)節(jié)應(yīng)激最主要的成分之一[7]。免疫應(yīng)激是相對(duì)于正常狀態(tài)而言的[8]，可以用下丘腦CRH mRNA表達(dá)水平的變化和血清中ACTH、CORT含量的變化可以作為家禽衡量應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10頭份/只NDⅠ系疫苗免疫30日齡雛雞，第5天時(shí)對(duì)照組CRH mRNA的表達(dá)水平極顯著升高；1～5 d時(shí)對(duì)照組CORT和ACTH都顯著高于空白組，證明高劑量注射NDⅠ系疫苗激活HPA軸，建立了雛雞免疫應(yīng)激模型。

關(guān)于緩解免疫應(yīng)激研究國(guó)內(nèi)外都有報(bào)道。在肉仔雞飼料中添加0.2%甘露寡糖或0.2%腐殖酸鹽均能顯著調(diào)節(jié)免疫功能[12]。藍(lán)光可一定程度抑制LPS刺激肉雞引起的日增重減緩和IL-1及應(yīng)激激素水平升高，并可提高肉雞的免疫功能，對(duì)免疫應(yīng)激具有緩解作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫應(yīng)激后1～3 d，野菊花組的CRH mRNA和血清中CORT和ACTH的表達(dá)有比對(duì)照組低的趨勢(shì)。第5天時(shí)，野菊花組顯著低于對(duì)照組，與空白組比較無差異。第7天后各組都無顯著差異。說明免疫1～5 d時(shí)，野菊花對(duì)免疫應(yīng)激有緩解作用。因?yàn)榻】惦u群有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力，7 d后恢復(fù)正常。

野菊花在禽的治療應(yīng)用報(bào)道為1～5 g/只[14]，給藥范圍較大，本研究主要探討野菊花對(duì)緩解免疫應(yīng)激是否有作用，選擇了一種給藥濃度可以確定是否有效，要想確定最佳給藥量，還要開展后續(xù)研究。

[1]Virden W S，Lilburn M S，Thaxton JP，et al.The effect of corti?costerone-induced stress on amino acid digestibility in Ross broil?ers[J].Poultry science，2007，86（2）：338-342.

[2]Piquer F J，Sell J L，Sotosalanova M F，et al.Effects of early im?mune stress and changes in dietary metabolizable energy on the development of newly hatched turkeys.1.Growth and nutrient uti?lization[J].PoultSci，1995，74（6）：983-997.

[3]袁志航，文利新，袁慧，等.抗應(yīng)激劑研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（增）：22-23.

[4]王志東，梁容瑞，李宗芳.中藥野菊花的藥理作用研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2009，15（6）：906-909.

[5]Dohms J E，Metz A.Stress-mechanisms of immunosuppression [J].Veterinary immunol-ogy and immunopathology，1991，30（1）：89-109.

[6]Klasing K C，Laurin D E，Peng R K，etal.Immunologicallymedi?ated growth depression in chicks：influence of feed intake，corti?costerone and interleukin-1[J].Journal of nutrition，1987，117（9）：1629-1637.

[7]Tsigos C，Chrousos G P.Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, neuroendocrine factors and stress[J].Journal of psychosomatic re?search，2002，53（4）：865-871.

[8]李建濤，蔡輝益，劉國(guó)華.脂多糖刺激對(duì)肉仔雞內(nèi)分泌激素和免疫機(jī)能的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（2）：134-140.

[9]Yang Y，Kocher A，Thomson E，et al.Effects ofmannanoligosac?charide in broiler chicken diets on growth perform-ance，energy utilisation，nutrient digestibility and intestinal microflora[J].Br Poult Sci，2008，49（2）：186-194.

[10]Spurlock M E.Regulation of metabolism and growth during im?mune challenge：an overview of cytokine function[J].Journal of Animal Science，1997，75（7）：1773-1783.

[11]Takahashi K T，Mashiko，Akiba Y.Effect of dietary concentration of xylitol on growth in male broiler chicks during immunological stress[J].Poultry Science，2000，79（5）：743-747.

[12]Tohid T G，Hasan，A lireza T.Efficacy ofmannanoligosaccharides and humate on imm-une response to Avian Influenza（H9）dis?ease vaccination in broiler chickens[J].Veterinary research com?munications，2010，34（8）：709-717.

[13]謝電.藍(lán)光對(duì)肉雞免疫應(yīng)激的緩解作用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28（3）：325-327.

[14]劉鐘杰，許劍琴.中獸醫(yī)學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：164.

The effect of chrysanthemum indicum extract on expression of hypothalam ic CRH m RNA and serum levels of ACTH and CORT in immune stress broilers

YUWen-hui1，JIANG Long1，SU Jing2，ZOU Jia-yu1，LIZi-jia1，JIANG Xiao-wen1
（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Animal disease control center in heilongjiang province，Harbin 150030，China）

The study was performed to investigate the effect of chrysanthemum indicum extract on levels of ACTH and CORT in serum and expression of hypothalam ic CRH mRNA in immune stress broiler chicks.Testwas divided into blank group，control group and wild chrysanthemum group.Each group contained 80 chickens.Chrysanthemum indicum group drank Chinesemedicine decoction two times each day for 7 days.Control and Chrysanthemum indicum groupswere vaccinated with 10 Newcastle disease vaccine by inteamuscular injection at age of 32-day-old，and blank group injected with saline.Eight chickens from each group were random ly selected to collect blood samples and took hypothalamus at day 1，3，5，7，14，and 21 post immunization.The con?tentof ACTH and CORT weremeasured by the double antibody sand-wich enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）.The ex?pression of CRH mRNA wasmeasured by real-time quantitative PCR.The results showed that the content of ACTH and CORT in serum and the expression of CRHmRNA after immunological stresswere significantly increased.And Chrysanthemum indicum sig?nificantly inhibited ACTH and CORT in serum and the expression of CRHmRNA k in hypothalamus.

chrysanthemum indicum；immunological stress；broilers；hormones；mRNA

JIANG Xiao-wen

S831

A

0529-6005（2015）11-0042-03

2014-10-22

于文會(huì)（1970-），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹蝎F藥，E-mail：yuwh6@aliyun.com

姜曉文，E-mail：jiangxiaowen@neau.edu.cn