余志陽，潘士勇，劉清珍，劉 健，陳春龍，李偉彥，朱四海

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、缺失，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)而引發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。PD的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，“氧化應(yīng)激傷學(xué)說”得到公認(rèn)，即自由基通過氧化神經(jīng)膜類脂、破壞多巴胺能神經(jīng)元膜功能或直接破壞細(xì)胞DNA，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的凋亡［2-3］。目前丙泊酚腦保護(hù)研究多限于缺血再灌注后或缺血再灌注預(yù)處理方面［4-5］，而關(guān)于丙泊酚對(duì)PD患者多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響較少研究。本研究通過小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)構(gòu)建 PD 模型、丙泊酚干預(yù)、檢測(cè)黑質(zhì)中相關(guān)蛋白表達(dá)水平，測(cè)定凋亡細(xì)胞，探討丙泊酚對(duì)PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)，健康雄性C57BL6小鼠48只，體重25～30 g，出生36～40周，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件:維持室溫(25±2)℃，人工晝夜循環(huán)光照節(jié)律(12～12 h)，自由進(jìn)食及飲水。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 C57BL6雄性小鼠48只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組。Ⅰ組(n=8):腹腔注射等滲鹽水3 mL/kg，1次/d，連續(xù)5 d。Ⅱ組(n=8):腹腔注射 MPTP(Sigma，USA)30 mg/kg，1 次/d，連續(xù)5 d。Ⅲ組(n=8):最后一次注射MPTP后2 h，腹腔注射脂肪乳(Sino-Swed Pharmaceutical Corp，China)10 mL/kg。Ⅳ組(n=8):最后一次注射MPTP后24 h，腹腔注射脂肪乳10 mL/kg。Ⅴ組(n=8):最后一次注射MPTP后2 h腹腔注射丙泊酚(Astrazeneca，Italy)100 mg/kg。Ⅵ組(n=8):最后一次注射MPTP后24 h腹腔注射丙泊酚100 mg/kg。

1.2.2 標(biāo)本采集 最后一次腹腔注射藥物后12 h將每組4只小鼠麻醉，經(jīng)左心室等滲鹽水灌洗后，再用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS)灌注固定，迅速開顱取腦。石蠟包埋，切取中腦黑質(zhì)區(qū)，切片厚度為 5 μm。

1.2.3 免疫組化染色 每組小鼠中隨機(jī)取4只進(jìn)行免疫組化染色。切片脫蠟后，用TBS(pH 7.4)洗3次，每次10 min。切片進(jìn)行水浴法抗原修復(fù)后降至室溫;TBS洗3次，每次10 min;加H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，TBS洗3次，每次10 min。分別采用兔抗小鼠 Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體(1∶200，Cell Signaling Technology，USA)加入稀釋的羊抗兔IgGHRP，室溫溫育 1 h，PBS(pH 7.4)漂洗 5 min，共 3次。滴加DAB顯色液顯色10 min，蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、封片。

1.2.4 免疫蛋白印跡(Western blot) 每組剩余4只小鼠進(jìn)行免疫蛋白印跡分析。小鼠麻醉后取中腦黑質(zhì)部分，置入組織蛋白提取液中，低溫勻漿，取出上清液。蛋白定量后取30 μg樣品，經(jīng)8%SDS凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h后，取相應(yīng)條帶分別加入Bcl-2兔抗小鼠一抗(1∶1000，Cell Signaling Technology，USA)，Caspase-3兔抗小鼠一抗(1∶1000，Cell Signaling Technology，USA)，4℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加 HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000，Sigma，USA)，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。暗室內(nèi)加ECL顯影液顯色曝光，掃描。內(nèi)參為 β-actin(1∶1000，Cell Signaling Technology，USA)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 Ⅰ組小鼠黑質(zhì)可見大量神經(jīng)元(圖1A)，排列整齊呈條帶狀。Ⅱ組和對(duì)照組比較，黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元明顯減少(圖1B)。Ⅴ、Ⅵ組與Ⅱ組比較，神經(jīng)元明顯增多(圖1B、E、F)，但Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組比較，黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元減少無差異(圖1B、C、D)。

圖1 6組小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元免疫組化染色結(jié)果(×200)

2.2 Western blot檢測(cè) PD模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)Caspase-3蛋白含量最高(圖2)。丙泊酚24 h干預(yù)組小鼠黑質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白的含量最高(圖3)。

圖2 6組小鼠黑質(zhì)區(qū)Caspase-3蛋白的含量

圖3 6組小鼠黑質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白的含量

3 討論

PD是發(fā)生于中年以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退行性疾病，其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性和壞死，流行病學(xué)研究顯示該病為老年性癡呆(Alzheimer’s disease)以外第二多見的神經(jīng)退行性病變［6］。隨著人口老年化，接受外科手術(shù)的老年患者逐年增加，這意味著越來越多的PD患者亦接受手術(shù)麻醉。為了選擇有利于PD患者的麻醉藥物，本研究探討了常用的靜脈麻醉藥丙泊酚對(duì)PD模型小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)①丙泊酚減輕MPTP誘導(dǎo)帕金森小鼠黑質(zhì)區(qū)組織學(xué)的改變，減少凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生;②丙泊酚可抑制帕金森小鼠黑質(zhì)凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

PD發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，普遍認(rèn)為線粒體DNA的突變和氧化應(yīng)激是主要致病因素［7］。MPTP可成功誘導(dǎo)小鼠PD模型［8］，其機(jī)理可能為氧化應(yīng)激造成的線粒體復(fù)合酶的功能抑制［2］，引起細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase-3引起凋亡的產(chǎn)生［9-10］。Caspase-3和Bcl-2在細(xì)胞凋亡過程中起主要作用，Bcl-2和前凋亡蛋白Bax聚合為復(fù)合體，降低Bax活性，抑制凋亡的發(fā)生［11-12］。研究表明PD患者黑質(zhì)區(qū)蛋白存在自由基調(diào)節(jié)損傷機(jī)制，自由基調(diào)節(jié)損傷可激活前凋亡蛋白Bax，同時(shí)還可破壞線粒體DNA(mtDNA)，進(jìn)一步加重 PD 癥狀［13-14］。而抑制Caspse-3蛋白的表達(dá)可以減輕黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡［15］。

丙泊酚作為靜脈麻醉藥物廣泛使用于臨床麻醉及重癥監(jiān)護(hù)患者的鎮(zhèn)靜治療，研究表明丙泊酚可通過清除自由基、降低脂質(zhì)過氧化作用、抑制凋亡蛋白的產(chǎn)生，而產(chǎn)生腦保護(hù)作用［4，16］。丙泊酚的腦保護(hù)作用還表現(xiàn)為減少缺血再灌注后腦梗死面積［17］。此外研究顯示丙泊酚對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，其機(jī)理是通過抑制環(huán)氧化酶(COX)蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)［17］。因此，在本研究中我們假設(shè)氧化應(yīng)激在PD病程發(fā)展中具有重要作用［7］，丙泊酚具有抗氧化、抑制凋亡蛋白表達(dá)等腦保護(hù)作用，對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元亦具保護(hù)作用。

本研究中，在MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森模型中，免疫組化顯示黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡細(xì)胞增加，經(jīng)丙泊酚干預(yù)后多巴胺能神經(jīng)元凋亡細(xì)胞減少，說明丙泊酚具有抗凋亡作用。丙泊酚處理后的MPTP小鼠，免疫組化及Western blot顯示Bcl-2表達(dá)增加，而Bcl-2具有抗凋亡作用，可抑制脂質(zhì)過氧化［16］，表明丙泊酚抑制PD小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡可能通過抑制氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。Wang等［17］認(rèn)為丙泊酚腦保護(hù)并不存在劑量依賴性，而Gelb等［18］認(rèn)為鎮(zhèn)靜劑量的丙泊酚不產(chǎn)生腦保護(hù)作用。本研究中丙泊酚劑量100 mg/kg，PD小鼠接受腹腔注射后2 min后肢體反射消失，但呼吸存在，30 min后可恢復(fù)處理前狀態(tài)，這與Kozue等［19］認(rèn)為100 mg/kg丙泊酚腹腔注射可提供MPTP誘導(dǎo)PD小鼠中等麻醉深度結(jié)果一致。

本研究還觀察了模型建立后2 h和24 h給予丙泊酚對(duì)黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)24 h后給予丙泊酚顯示出更好的抗凋亡作用，這可能與MPTP誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的時(shí)程相關(guān)，即模型建立后24 h時(shí)神經(jīng)元的凋亡較2 h時(shí)更顯著，此時(shí)給予丙泊酚顯示更明顯的抗凋亡效果，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。此外，相關(guān)研究認(rèn)為通過連續(xù)5次腹腔注射MPTP可以構(gòu)建穩(wěn)定的小鼠亞急性PD模型［20］，故本研究中小鼠PD模型制備后未施行為學(xué)檢測(cè)。

綜上所述，丙泊酚可減輕MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的凋亡，該效應(yīng)可能與其抑制Caspase-3活性、促進(jìn)Bcl-2作用有關(guān)。

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