夏臣杰，尹利明，黃杰烽，陳俊杰，趙 凱，杜文喜

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310053；3.新安國(guó)際醫(yī)院，浙江嘉興 314031）

骨量丟失是暴露于電離輻射（ionizing radiation，IR）后常見的病理改變［1-3］，嚴(yán)重者可致骨質(zhì)疏松性骨折，臨床多見于轉(zhuǎn)移性骨腫瘤放療后的患者，給病人帶來(lái)了巨大的痛苦及沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cell，BMSC）是一類具有自我更新和多向分化增殖潛能的原始骨髓細(xì)胞，已有研究表明，其在右歸飲作用下顯著促其向成骨細(xì)胞分化［2］。但目前尚缺乏右歸飲對(duì)骨髓細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)分化情況的研究。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用γ輻射破壞殺死骨髓細(xì)胞，造成骨量丟失，觀察右歸飲對(duì)回輸?shù)耐N異體骨髓細(xì)胞在小鼠體內(nèi)向成骨細(xì)胞分化的影響，研究其防治輻照后骨量丟失的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物及分組 80只8 w齡SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠［由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物有限公司提供；生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016］，體重為（20±2）g，隨機(jī)選32只用于骨髓細(xì)胞提取回輸，實(shí)驗(yàn)組48只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物成像儀（浙江省中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所提供），輻照裝置（浙江省農(nóng)科院提供）。

1.1.3 右歸飲制作 稱取1倍量處方右歸飲51 g（熟地9 g，炒山藥6 g，山茱萸3 g；枸杞6 g，炙甘草6 g，姜制杜仲 6 g，肉桂 6 g，制附子 9 g），加適量水浸泡1 h，提取1.5 h/次，提取2次，加10倍水，所得提取液趁熱過(guò)4層紗布后合并，放冰箱內(nèi)冷藏12 h后，以4 000 r/min，3℃離心15 min，共2次。合并上清液，加熱至沸騰，趁熱放置冰箱內(nèi)冷藏12 h后，再以4 000 r/min，3℃離心15 min，共2次，合并上清液，濃縮到密度為1.35，于60℃減壓干燥。干燥物碾細(xì)，過(guò)120目篩后得到右歸飲細(xì)粉，加熱水化開，4℃冰箱冷藏備用。

1.1.4 骨髓干細(xì)胞提取 斷頸處死小鼠，投入盛有250 mL左右的75%酒精中浸泡3～5 min，拎出后將小鼠仰面翻鋪于超凈臺(tái)上一個(gè)消毒托盤上。每只小鼠用2.5 mL PBS溶液沖洗骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞，1 200 r/min，離心10 min，去上清，留1 mL。懸浮細(xì)胞后加氯化銨溶 液 （NH4Cl：8.99 g/L，KHCO3：1 g/L，EDTA-4Na：0.037 g/L，過(guò)濾滅菌，40℃儲(chǔ)存）裂解紅細(xì)胞，按 1∶9比例，即1 mL細(xì)胞懸液加進(jìn)9 mL NH4Cl溶液，混勻，置冰上10 min。1 200 r/min，10 min，去上清。置于4℃冰塊盒中，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電離輻射造模 在進(jìn)行骨髓提取同時(shí)，將實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)選8只作為空白對(duì)照組。將剩余40只小鼠，分裝在8個(gè)紙筒內(nèi)，兩端用紗布扎緊，置于無(wú)菌的小鼠專用運(yùn)輸盒內(nèi)，運(yùn)至浙江省農(nóng)科院，予以電離輻射，輻射劑量為1 Gy/min，輻射6 min。然后運(yùn)回浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分成5組，即輻照組、BM回輸組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組8只。

1.2.2 干預(yù)措施 空白對(duì)照組不予任何處理；輻照組只接受電離輻射；BM回輸組在電離輻射基礎(chǔ)上，按照1∶1比例，尾靜脈回輸骨髓細(xì)胞；高劑量組、中劑量組、低劑量組在電離輻射和骨髓細(xì)胞回輸?shù)幕A(chǔ)上，分別予以 0.03 mL/g、0.02 mL/g、0.01 mL/g 濃度為0.51 g/mL的右歸飲灌胃，每天1次，持續(xù)2 w。

1.2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 2 w后摘除眼球取血，置于離心管中，低溫條件4℃下放置4 h后，按照3 000 r/min離心15 min后取上層血清，進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)。

1.2.4 股骨單位體積內(nèi)骨量（即骨密度）檢測(cè) 眼球取血后，斷頸處死小鼠，整體動(dòng)物采用小動(dòng)物成像儀拍攝后測(cè)定骨密度。掃描小鼠雙側(cè)股骨，保存數(shù)據(jù)，使用骨密度測(cè)定軟件分別測(cè)定雙側(cè)股骨骨密度。

1.2.5 組織學(xué)觀察 檢測(cè)完骨量，取雙側(cè)股骨上段，剔凈軟組織，行石蠟包埋、5 μm切片、HE染色，進(jìn)行組織病理觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，計(jì)量資料比較用單因素方差分析（one－way ANOVA），以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雙側(cè)股骨骨密度及血清中ALP濃度比較

與輻射組比較，空白對(duì)照組、高劑量組、中劑量組骨密度及ALP濃度明顯增高（P<0.01，P<0.05）。與BM回輸組比較，高劑量組、低劑量組骨密度明顯增高（P<0.05），高劑量組ALP濃度明顯增高（P<0.05）。與低劑量組比較，高劑量組ALP濃度明顯增高（P<0.05）。結(jié)果見表1。

表1 小鼠雙側(cè)股骨單位體積骨量和血清中ALP濃度比較 （s）

表1 小鼠雙側(cè)股骨單位體積骨量和血清中ALP濃度比較 （s）

注：與輻照組比較，1）P<0.01，2）P<0.05；與 BM 回輸組比較，3）P<0.05；與低劑量組比較，4）P<0.05

3組別 n 單位體積骨量（g/cm）ALP（pg/mL）輻照組 8 6.01±2.33 1 380.9±180 BM 回輸組 8 6.92±1.72 1 594.5±265低劑量組 8 7.00±1.78 1 619.4±207中劑量組 8 8.46±2.012）3）1 827.4±3431）高劑量組 8 9.05±1.711）3）1 886.2±3781）3）4）空白對(duì)照組 8 9.16±2.281）1 997.9±2251）

2.2 股骨組織病理學(xué)觀察結(jié)果

輻照組：輻照后骨髓組織結(jié)構(gòu)凌亂，骨髓單核細(xì)胞大量消失，部分組織變性，含有大量脂肪空泡，骨小梁稀疏甚至消失；BM回輸組：骨小梁較輻照組數(shù)量明顯增多，骨髓單核細(xì)胞數(shù)量明顯增多，但仍含有大量的變性組織；低劑量組：骨小梁增多增粗，小梁排列紊亂，骨髓單核細(xì)胞數(shù)量較輻照組明顯增多；中劑量組：骨小梁和骨髓細(xì)胞情況介于低劑量組和高劑量組之間；高劑量組：骨小梁排列有序堅(jiān)實(shí)，骨髓單核細(xì)胞多，變性組織明顯減少，接近正常?？瞻讓?duì)照組：骨小梁粗壯，排列有序，骨髓細(xì)胞數(shù)量多。

3 討論

IR可造成骨量丟失，骨密度下降，嚴(yán)重者可引起骨質(zhì)疏松性骨折，在宇航員和腫瘤放療患者身上尤為突出。有臨床研究報(bào)道，骨盆腫瘤患者放療后，5年內(nèi)髖骨和股骨頸骨折發(fā)生率增加超過(guò)65%［1］，乳腺癌患者接受放療后肋骨骨折發(fā)生率為1.8%［3］，最高可達(dá)19%［4］，給患者的身體和心理帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)。另外，動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，小鼠接受2 Gy的電離輻射，117 d予Micro-CT檢測(cè)股骨和脛骨，骨小梁體積較對(duì)照組下降20%，骨小梁間隙增加11%，骨密度下降19%，表明電離輻射可導(dǎo)致小鼠骨量丟失，骨密度下降，脆性骨折發(fā)生率增高［5］。目前，IR導(dǎo)致骨量丟失，骨密度下降的機(jī)制尚不十分清楚。IR殺死骨髓細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等，抑制成骨細(xì)胞的增殖和成骨功能，破壞骨髓內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致成骨形成低下是目前認(rèn)可的觀點(diǎn)［6］。本實(shí)驗(yàn)小鼠接受大劑量全身輻照后，破壞殺死骨髓細(xì)胞，抑制成骨細(xì)胞增殖和成骨功能，引起骨量丟失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。通過(guò)檢測(cè)小鼠雙側(cè)股骨骨密度情況，發(fā)現(xiàn)γ射線組顯著低于空白對(duì)照組，表明輻照導(dǎo)致小鼠骨量丟失模型已成功。

BMSC是一類具有自我更新和多向分化增殖潛能的原始骨髓細(xì)胞，其組成比較復(fù)雜，主要包括間質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞等［7］。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）易于分離擴(kuò)增，在不同理化環(huán)境和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，可定向地向成骨細(xì)胞方向分化，最終形成骨。早在 1995 年，Perira R F 等［8］利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSC在體內(nèi)的走向，證實(shí)MSC可以向多種造血以外組織遷移定位并分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞，成功地向成骨細(xì)胞分化。國(guó)內(nèi)學(xué)者韓冬等［9］在體外礦化誘導(dǎo)兔MSC，將誘導(dǎo)后MSC-去抗原牛松質(zhì)骨復(fù)合體植入裸鼠背部皮下。結(jié)果表明MSC向成骨細(xì)胞方向分化和增殖。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，骨髓間充干細(xì)胞的成骨分化功能，使其在治療骨量丟失、骨質(zhì)疏松癥、骨折延遲愈合、骨折不愈合等疾病中具有巨大的潛力。隨著細(xì)胞工程學(xué)的發(fā)展，體外誘導(dǎo)MSC向成骨細(xì)胞分化也越來(lái)越成熟。在含有胎牛血清的低糖DMEM中加入地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C或堿性成纖維生長(zhǎng)因子（b-FGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白可以誘導(dǎo)MSC向成骨細(xì)胞分化。

對(duì)于成骨細(xì)胞的鑒別可以依靠成骨細(xì)胞的特異性分泌蛋白，如ALP、骨鈣素（OPG）和I型膠原蛋白等，以及體外礦化的功能特征。堿性磷酸酶活性被認(rèn)為是成骨細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)標(biāo)志。文獻(xiàn)報(bào)道，血清ALP與骨形成參數(shù)間為正相關(guān)關(guān)系，可作為監(jiān)測(cè)和初步判斷成骨細(xì)胞活性的簡(jiǎn)易指標(biāo)之一［10］。在成骨細(xì)胞增殖晚期，分泌ALP與鈣鹽結(jié)晶體至細(xì)胞外基質(zhì)中，ALP可使局部磷酸含量增高，促使基質(zhì)礦化，能夠反映成骨細(xì)胞合成I型膠原、形成骨基質(zhì)的能力［11］。因ALP是一種細(xì)胞外酶，可釋放到血液循環(huán)中，故可用來(lái)監(jiān)測(cè)體內(nèi)成骨細(xì)胞的增殖和活動(dòng)情況。

右歸飲出自明代張介賓的《景岳全書》，作為溫補(bǔ)腎陽(yáng)的代表方劑，《醫(yī)經(jīng)精義》云“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨強(qiáng)”。說(shuō)明骨為髓所主，骨的生長(zhǎng)發(fā)育有賴于髓的濡養(yǎng)。若腎氣不足，腎精虧虛，骨髓失充，骨骼失養(yǎng)，則脆弱乏力。右歸飲具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、益骨生髓的功效。在細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)右歸飲具有促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化、增殖，提高成骨細(xì)胞活性的作用。吳云剛等［2］將右歸飲含藥血清加入骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，右歸飲能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。

輻照可以破壞殺死骨髓細(xì)胞，造成小鼠股骨骨密度下降，骨量丟失。經(jīng)過(guò)BM回輸，右歸飲灌胃治療后，小鼠雙側(cè)股骨骨密度較輻照組和BM回輸組顯著增加，血清ALP濃度升高，股骨組織病理發(fā)現(xiàn)骨小梁排列有序且堅(jiān)實(shí)，骨髓單核細(xì)胞數(shù)量多，變性組織少，顯著優(yōu)于輻照組。綜上所述，右歸飲可促進(jìn)異體骨髓細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，改善輻照后骨量丟失情況。

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