薛正楷，魏泓

(1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，瀘州 646005；2.第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，重慶 400038)

重組肝CYP3A4與CYP3A29細(xì)胞微粒體藥物代謝動力學(xué)比較

薛正楷1，2，魏泓2

(1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，瀘州 646005；2.第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，重慶 400038)

目的 比較巴馬小型豬CYP3A29和人CYP3A4穩(wěn)定表達(dá)重組肝癌細(xì)胞株微粒體的藥物代謝特征，在分子水平為巴馬小型豬作為臨床前藥物代謝實驗動物提供科學(xué)依據(jù)。方法 以CYP3A特異性代謝底物硝苯地平、睪酮及其抑制藥酮康唑為探針?biāo)幬铮瑢⑻结標(biāo)幬锱c重組CYP3A4、CYP3A29細(xì)胞微粒體在優(yōu)化的微粒體濃度、藥物濃度、孵育時間等條件下進(jìn)行體外孵育，高效液相色譜法檢測其藥物代謝(抑制)動力學(xué)參數(shù)，并將二者進(jìn)行比較分析。結(jié)果 巴馬小型豬CYP3A29與CYP3A4在硝苯地平和睪酮代謝差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。酮康唑的抑制活性為：當(dāng)代謝底物為硝苯地平時，酮康唑?qū)YP3A29和CYP3A4的半數(shù)抑制濃度分別為0.090，0.132 μmol·L-1(P<0.05)；當(dāng)代謝底物為睪酮時，酮康唑?qū)YP3A29和CYP3A4的半數(shù)抑制濃度分別為0.056，0.032 μmol·L-1(P<0.05)。結(jié)論 重組CYP3A29與CYP3A4細(xì)胞微粒體對硝苯地平和睪酮活性差異不顯著；酮康唑?qū)χ亟MCYP3A29與CYP3A4細(xì)胞微粒體硝苯地平和睪酮代謝活性有差異。

重組細(xì)胞；微粒體；CYP3A4；CYP3A29；藥物代謝動力學(xué)

在臨床前藥物代謝ADMET(吸收，Absorption，A；分布，Distribution，D；代謝，Metabolism，M；排泄，Excretion，E；毒性，Toxicity，T)研究中，嚙齒類動物犬、猴是傳統(tǒng)的實驗動物，與小型豬相比，其飼養(yǎng)成本較高，且價格昂貴；同時，小型豬被用于比較醫(yī)學(xué)研究已有相當(dāng)長的歷史，其解剖學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)特征與人極為相似，因而受到生物醫(yī)學(xué)界的重視。此外，犬和猴由于動物保護和倫理學(xué)方面的原因，其在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用越來越受到嚴(yán)格限制[1-2]。因此，近年在藥物代謝實驗中，用小型豬越來越廣泛地替代犬和猴作為非嚙齒類動物的ADMET實驗?zāi)Ｐ蚚3-4]。小型豬CYP3A亞家族酶共有4種亞型：CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A46(CYP3A88)(http：//drnelson.utmem.edu/pig.CYPs.htm)。利用CYP3A特異性底物進(jìn)行的活體動物實驗表明，小型豬的CYP3A具有典型的硝苯地平氧化活性(人體CYP3A4 和CYP3A5的特異活性)，且能被苯巴比妥、利福平和地塞米松誘導(dǎo)[5-7]。已有的小型豬肝組織實時定量聚合酶鏈反應(yīng)及其肝組織微粒體實驗顯示，CYP3A29是小型豬(豬)體內(nèi)與人CYP3A4/5同源性最高的CYP3As，且代謝活性與CYP3A4極為相似[8-10]。但與此不同的是，SHANG等[11]以實時-聚合酶鏈反應(yīng)檢測CYP3AmRNA在巴馬小型豬各組織的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)CYP3A22在肝組織中表達(dá)量最高，而CYP3A46肝外組織表達(dá)量最高，CYP3A29在十二指腸的表達(dá)量最高，其他組織相對表達(dá)量均較低，據(jù)此，SHANG等推測CYP3A22和CYP3A46可能是巴馬小型豬體內(nèi)重要的功能酶，但缺乏對CYP3A29的分子代謝動力學(xué)研究。

筆者曾對CYP3A29基因異源表達(dá)及其表達(dá)活性進(jìn)行了初步分析，但未對其藥物代謝動力學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的研究[12]。因此，本研究旨在利用本實驗室篩選成功的穩(wěn)定表達(dá)的人HepG2-CYP3A4和巴馬小型豬HepG2-CYP3A29，以硝苯地平、睪酮和酮康唑為探針?biāo)幬铮谖⒘ｓw水平比較CYP3A4和巴馬小型豬YP3A29的代謝動力學(xué)特征，為巴馬小型豬作為人CYP3A藥物代謝臨床前實驗動物提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 HepG2、HepG2-pcDNA3.1由中國人民解放軍復(fù)合傷研究所王艾平博士惠贈；HepG2-CYP3A4、HepG2-CYP3A22由薛正楷博士構(gòu)建并保存[12]。

1.2 試劑 達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)、G418購自Gibco公司；硝苯地平、氧化硝苯地平、睪酮、6β-羥基睪酮(6β-hydroxyl-testosterone，6β-OHT)、葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，G-6-P) 、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-P-DH)、輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)、牛血清清蛋白、酮康唑和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購自Sigma公司；Trypan blue溶液(0.4%)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)為Amresco公司產(chǎn)品；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)G-250購自碧云天生物技術(shù)研究所；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀：bio-rad 680型全自動酶標(biāo)儀，Bio-rad公司。細(xì)胞分析計數(shù)儀：型號 Z2，BECKMAN公司。血細(xì)胞計數(shù)板：型號XB-K-25，上海安信光學(xué)儀器制造有限公司。色譜柱：Hypersil ODS C18(4.6mm×150 mm，5 μm)；色譜柱：Phenomenex C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)。

1.4 實驗方法

1.4.1 色譜條件

1.4.1.1 檢測硝苯地平代謝的色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇：水(64：36，V/V)；柱溫40 ℃；流速0.5 mL·min-1；檢測波長：237 nm；進(jìn)樣量50 μL。

1.4.1.2 檢測睪酮代謝的色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫40 ℃；流動相：甲醇：水(52：48，V/V)；洗脫梯度：0～15 min線性梯度為48%→30%水，～20 min，30%→20%水；流速1.0 mL·min-1；紫外檢測波長245 nm；進(jìn)樣量50 μL。

1.4.2 微粒體的制備 按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法[13]培養(yǎng)重組細(xì)胞；胰酶消化貼壁的HepG2-CYP3A4和HepG2-CYP3A29細(xì)胞，1 500 r·min-1(r=15 cm)離心4 min，立即放入0～4 ℃冰浴中，用0.15 mol·L-1氯化鉀溶液沖洗干凈并稱質(zhì)量，每克重組細(xì)胞與氯化鉀(200.15 mol·L-1)-磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 7.4)3 mL混合，用勻漿器制成細(xì)胞勻漿。4 ℃、9 000×g離心20 min，吸取上清液，然后4 ℃、100 000×g離心60 min，棄去上清液，所得粉紅色沉淀即為肝微粒體。將粉紅色的肝微粒體取出，懸浮于體積分?jǐn)?shù)為30%甘油-氯化鉀-磷酸鹽緩沖液中，分裝后將制備好的肝微粒體置于-85 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 Bradford法測微粒體蛋白質(zhì)含量 采用考馬斯亮藍(lán)染色法，將待測大鼠肝微粒體樣本稀釋50倍后，于波長595 nm處，以空白管調(diào)零，測吸光度，計算蛋白濃度，其他操作按試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.4.4 微粒體孵育和樣品處理 在96孔板中建立微粒體體外反應(yīng)體系，該體系包括：100 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，10 mmol·L-1G-6-P，1 mol·L-1NADP，4 mmol·L-1氯化鎂溶液，1 U·mL-1G-6-P脫氫酶，終體積為200 μL。按照優(yōu)化的微粒體濃度(0.5 mg·mL-1)，底物濃度(硝苯地平為50 μmol·L-1，睪酮為100 μmol·L-1)，37 ℃預(yù)孵3 min，反應(yīng)體系通過加入NADP起始反應(yīng)，反應(yīng)按優(yōu)化的時間(硝苯地平10 min、睪酮12 min)，用36%高氯酸溶液20 μL終止反應(yīng)并沉淀蛋白，4 ℃條件下，轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1(r=10 cm)，離心10 min，取上清液50 μL用于高效液相色譜(HPLC)檢測。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和比較采用Excel 和SPSS17.0版軟件，曲線的擬合采用Excel和Sigmaplot；量效關(guān)系曲線及酶動力學(xué)參數(shù)采用Sigmaplot軟件中的Hill方程(V=Vmax[S]n/(S50+[S]n))擬合。相對活性的計算：以對照組CYP3A的活性為100%，實驗組CYP3A的活性比對照組，即為相對活性；半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)的計算方法：參考楊樹勤[14]提供的半數(shù)效量概率單位法進(jìn)行，即：根據(jù)實驗組抑制劑對底物抑制劑濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度抑制率的概率單位(probit)為縱坐標(biāo)，求出直線回歸方程，并根據(jù)方程計算值IC50。

2 結(jié)果

2.1 重組CYP3A4/29微粒體蛋白測定結(jié)果 重組細(xì)胞微粒體HepG2-pcDNA3.1、HepG2-CYP3A4和HepG2-CYP3A29總蛋白濃度分別為(1 987.00±214.38)，(1 856.00±105.43)，(1 982.00±222.13) mg·mL-1。對3種重組細(xì)胞株微粒體蛋白濃度采用SPSS軟件包中One-Way ANOVA模塊進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果表明，3種重組細(xì)胞株微粒體蛋白濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 重組CYP3A4/29微粒體硝苯地平代謝HPLC方法考察 見圖1。結(jié)果表明，微粒體孵育液中內(nèi)源性

物質(zhì)不干擾硝苯地平的測定，硝苯地平的保留時間為10.58 min，氧化硝苯地平的保留時間為8.16 min。

A.空白微粒體；B.失活微粒體+硝苯地平；C.失活微粒體+硝苯地平+氧化硝苯地平；1.硝苯地平；2.氧化硝苯地平

圖1 3種微粒體的HPLC色譜圖

A.blank microsomes；B.inactive microsomes spiked with nifedipine；C.inactive microsomes spiked with nifedipine and oxidation of nifedipine；1.nifedipine；2.oxidation of nifedipine

Fig.1 HPLC chromatograms of three kinds of microsomes

2.3 硝苯地平代謝的酶動力學(xué)參數(shù) 采用米氏方程擬合得到的酶動力學(xué)參數(shù)[最大酶促反應(yīng)速率(Vmax)、內(nèi)在清除率(Clint)、米氏常數(shù)(Km)]。見表1。

采用SPSS軟件包中成對數(shù)據(jù)T檢驗?zāi)K對表1中重組細(xì)胞HepG2-CYP3A29和HepG2-CYP3A4微粒體硝苯地平代謝的動力學(xué)參數(shù)Vmax、Km、Clint進(jìn)行比較，結(jié)果表明，兩種微粒體對硝苯地平的代謝動力學(xué)參數(shù)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，表明CYP3A29與CYP3A4的硝苯地平代謝活性相似。

表1 重組細(xì)胞微粒體對硝苯地平代謝的動力學(xué)參數(shù)

Tab.1 Metabolic kinetic parameters of nifedipine in recombinant microsomes

2.4 酮康唑?qū)χ亟MCYP3A4/29微粒體的抑制作用 見表2。從表2可見，在0.00～10.00 μmol·L-1范圍內(nèi)，酮康唑?qū)χ亟MCYP3A4和CYP3A29的抑制作用具有濃度依賴關(guān)系，隨著酮康唑濃度的增大，酮康唑?qū)ο醣降仄降囊种谱饔弥饾u增強，酮康唑?qū)epG2-CYP3A29微粒體的抑制作用顯著強于對HepG2-CYP3A4微粒體(P<0.05)。

2.5 酮康唑?qū)χ亟MCYP3A4/29微粒體抑制作用的概率回歸方程 見圖2。根據(jù)回歸方程，求得CYP3A4和CYP3A29的IC50分別為：0.132和0.090 μmol·L-1，酮康唑?qū)Χ叩腎C50均<1 μmol·L-1，因此，酮康唑是二者的強抑制劑，并且酮康唑?qū)YP3A29的抑制活性強于CYP3A4。

2.6 睪酮代謝的色譜方法學(xué)考察 見圖3。在本實驗設(shè)定的色譜條件下，比較各組色譜結(jié)果，孵育液中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾睪酮和6β-OHT標(biāo)準(zhǔn)品色譜結(jié)果，說明本色譜方法對睪酮和6β-OHT的測定具有專屬性，睪酮的保留時間為17.05 min，6β-OHT的保留時間為10.61 min。

2.7 睪酮代謝的酶動力學(xué)參數(shù) 見表3。采用SPSS軟件包中成對數(shù)據(jù)t檢驗對3種動力學(xué)參數(shù)Vmax、S50、Clint進(jìn)行比較，動力學(xué)參數(shù)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明兩種重組細(xì)胞微粒體對睪酮代謝無明顯差異。

2.8 酮康唑?qū)χ亟M細(xì)胞睪酮代謝的抑制作用 見表4。從表4可知，酮康唑?qū)χ亟M細(xì)胞微粒體的睪酮代謝具有濃度依賴性，隨著酮康唑濃度的增加，抑制作用增強，酮康唑?qū)epG2-CYP3A4微粒體睪酮代謝的抑制作用比HepG2-CYP3A29顯著增強(P<0.05)。

2.9 酮康唑?qū)χ亟M細(xì)胞的抑制作用的回歸方程 見圖4。根據(jù)回歸方程，求得CYP3A4和CYP3A29的IC50分別為0.032和0.056 μmol·L-1。酮康唑?qū)Χ叩腎C50均<1 μmol·L-1，因此，酮康唑是二者睪酮代謝的強抑制劑，其對CYP3A4抑制作用強于CYP3A29。

3 討論

動力學(xué)參數(shù)是決定酶促反應(yīng)特征曲線的決定因素，包括有米氏常數(shù)Km、Vmax和Clint，其中Km表示理論上酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大速率一半時所需的底物濃度，反映了酶與底物的親和能力，其值越小親和能力越強，是藥物酶促反應(yīng)的特征參數(shù)；Vmax是在底物濃度等外界條件完全滿足時某種反應(yīng)可能達(dá)到的速率最大效能，可反映藥物酶促反應(yīng)的內(nèi)在效應(yīng)特征；Clint的體外相關(guān)性可由每一代謝途徑的Vmax/Km比值表示，用以說明或比較特定代謝途徑對藥物清除的相對貢獻(xiàn)，在藥物代謝特征從體外實驗向體內(nèi)實驗轉(zhuǎn)變中起重要作用，是酶對底物代謝效率的直接量度。

表2 在不同濃度酮康唑作用下的重組CYP3A微粒體相對活性

A.blank microsomes；B.inactive microsomes spiked with 6β-OHT；C.inactive microsomes spiked with testosterone and 6β-OHT；1.6β-OHT；2.testosterone

Fig.3 HPLC chromatograms of three kinds of microsomes

表3 重組細(xì)胞微粒體對睪酮代謝的動力學(xué)參數(shù)

Tab.3 Metabolic kinetic parameters of testosterone in recombinant micrsomes

表4 在不同濃度酮康唑作用下重組細(xì)胞微粒體對睪酮代謝的相對活性

Tab.4 Relative activity of recombinant microsomes on testosterone metabolism treated by different concentrations of ketoconazole

Fig.4 Probability regression equation of the inhibition on testosterone metabolism in recombinant CYP3A4/29 microsomes by different concentrations of ketoconazole

在HepG2-CYP3As微粒體催化硝苯地平的代謝中，由于CYP3A29的Km與CYP3A4幾乎無差異，而前者的Vmax與后者相當(dāng)，說明HepG2-CYP3A29微粒體對硝苯地平氧化反應(yīng)的總體反應(yīng)活性與HepG2-CYP3A4差異不顯著；比較人CYP3A4與小型豬CYP3A29體外微粒體孵育的硝苯地平代謝的Clint、Km和Vmax的結(jié)果相似，即HepG2-CYP3A4微粒體的硝苯地平代謝活性與HepG2-CYP3A29差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

將本實驗體外微粒體孵育實驗獲得硝苯地平代謝的Vmax結(jié)果與文獻(xiàn)[15-16]數(shù)據(jù)比較，結(jié)果為猴肝微粒體>Guinea豬肝微粒體>本實驗>巴馬小型豬≌貴州小型豬>人>鼠>犬，表明在臨床前藥物的大型動物實驗中，巴馬小型豬比目前通用的實驗?zāi)Ｐ蛣游锶鼉?yōu)。

CYP3A4催化睪酮代謝的作用機制表明，CYP3A4具有大的底物結(jié)合“口袋”，可同時結(jié)合3個睪酮分子，第1個睪酮分子的結(jié)合增加了CYP3A4對還原型輔酶Ⅱ的氧化率，雖然無羥基化產(chǎn)物的形成，所有的還原當(dāng)量分流到解耦聯(lián)途徑；第2個睪酮分子的結(jié)合，對睪酮分子的氧化最為重要，此時，睪酮羥基化產(chǎn)物形成率達(dá)到最大值；第3個睪酮分子的結(jié)合雖然并不提高睪酮的代謝產(chǎn)物形成率，但提高了CYP3A4對還原當(dāng)量的利用效率，因此CYP3A4對睪酮的羥基化代謝具有非典型的米氏酶動力學(xué)特征，適合于Hill方程描述的代謝動力學(xué)[17-19]。

本研究結(jié)果表明，重組細(xì)胞微粒體CYP3A4和CYP3A29的Hill系數(shù)均>1，說明二者對睪酮的代謝均屬于正協(xié)同作用[20-21]。由于Vmax反映酶對底物代謝的活性，CYP3A29Vmax比CYP3A4略低，說明CYP3A29對睪酮羥基化活性比CYP3A4低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；S50近似反映酶對底物的親和力，本實驗重組的CYP3A4和CYP29的S50相近，二者對睪酮的親和力關(guān)系為：CYP3A4與CYP3A29差異不顯著；Clint是酶對底物代謝效率的直接量度，分析本實驗重組的兩種CYP3A微粒清除率Clint，發(fā)現(xiàn)其關(guān)系與Vmax和S50反映的酶特征基本一致；酮康唑?qū)θ薈YP3A4和巴馬小型豬CYP3A29重組細(xì)胞微粒體的睪酮代謝的IC50結(jié)果表明，酮康唑?qū)YP3A29的抑制作用低于CYP3A4。

將本實驗獲得CYP3A酶動力學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)比較發(fā)現(xiàn)，其CYP3A29的Vmax、S50和Clint與文獻(xiàn)[22]的人肝微粒體睪酮代謝特征最接近，說明本實驗結(jié)果具有較高的參考性。

總之，本實驗通過重組細(xì)胞微粒體體外孵育探針底物硝苯地平和睪酮及抑制藥酮康唑，獲得的重組人CYP3A4和小型豬CYP3A29體外微粒體孵育酶代謝特征表明，巴馬小型豬HepG2-CYP3A29與HepG2-CYP3A4微粒體在硝苯地平和睪酮代謝有差異，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。酮康唑的抑制作用為：對CYP3A29的硝苯地平代謝抑制作用強于CYP3A4，對CYP3A4睪酮代謝的抑制作用強于CYP3A29。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.004

Comparison of Pharmacokinetics Between Recombinant Liver Microsomes with CYP3A4 and CYP3A29

XUE Zhengkai1,2, WEI Hong2

(1.InstituteofBiomedicalEngineering,LuzhouVocationalandTechnicalCollege,Luzhou646005,China; 2.LaboratoryAnimalCenter,CollegeofBasicMedicalScience,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To compare the pharmacokinetic characteristics of microsomes from the recombinant cell lines of HepG2 with CYP3A4 and CYP3A29 in Bama miniature pigs, and provide evidence for clinical animal testing. Methods The probe drugs nifedipine (NF), testosterone (TST) and ketoconazole (KCZ) were incubated with the recombinant microsomes of HepG2-CYP3A4 and HepG2-CYP3A29 under optimal conditions of concentration and duration.The high performance liquid chromatograph (HPLC) was utilized to detect the metabolites, and characteristics of the two types of microsomes were compared. Results There was no significant difference in the metabolic activities between CYP3A29 and CYP3A4 for both nifedipine and testosterone (P>0.05).The half inhibitory concentrations of ketoconazole for CYP3A29 and CYP3A4 were 0.090 and 0.132 μmol·L-1(P<0.05), respectively, using nifedipine as the metabolism substrate, and were 0.056 and 0.032 μmol·L-1(P<0.05), respectively, using testosterone as metabolism substrate. Conclusion There is no significant difference between cell microsomes with CYP3A29 and CYP3A4 in metabolizing nifedipine and testosterone, but ketoconazole has significantly different inhibitory activity towards the two types of microsomes.

Recombinant cell lines; Microsomes; CYP3A4; CYP3A29; Pharmacokinetics

2013-07-09

2014-01-08

薛正楷(1968-)，男，重慶人，副教授，博士，研究方向：分子代謝與工程，電話：(0)13909087693，E-mail：zk.xue988@163.com。

R969.1

A

1004-0781(2015)01-0015-07