劉文倩，趙雅寧，李建民

(河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，唐山 063000)

葡萄籽原花青素對(duì)慢性間歇性低氧大鼠空間工作記憶和5-羥色胺的影響*

劉文倩，趙雅寧，李建民

(河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，唐山 063000)

目的 探討葡萄籽原花青素(GSPE)對(duì)慢性間歇性大鼠空間工作記憶和5-羥色胺(5-HT)的影響。方法 健康雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、GSPE小劑量組(100 mg·kg-1)和GSPE大劑量組(200 mg·kg-1)，每組20只。正常對(duì)照組暴露于空氣中，模型對(duì)照組和GSPE小、大劑量組暴露于低氧(50 mL·L-1)條件下，暴露時(shí)間每天8 h，持續(xù)6周；Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間記憶能力；應(yīng)用蘇木精-伊紅染色觀察腦組織形態(tài)變化；用高效液相色譜法測(cè)定大腦皮質(zhì)內(nèi)5-HT的含量。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示大鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)明顯減少；皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，5-HT含量明顯降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，GSPE小、大劑量組水迷宮檢測(cè)大鼠逃避潛伏期時(shí)間縮短、穿臺(tái)次數(shù)增多，皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，5-HT含量明顯增多(P<0.05)；上述變化在GSPE大劑量組更為顯著(P<0.05)。結(jié)論 GSPE可增加5-HT含量，改善間歇性低氧大鼠空間工作記憶能力。

葡萄籽原花青素；低氧，間歇性；5-羥色胺；記憶

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS) 可造成患者記憶障礙，并出現(xiàn)執(zhí)行能力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)方面的認(rèn)知問題[1-2]。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與許多功能調(diào)節(jié)有關(guān)，如睡眠、性行為、情感行為以及學(xué)習(xí)和記憶等[3]。原花青素是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，以葡萄籽中含量最為豐富。研究表明，葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)具有抗氧化、清除自由基、心血管保護(hù)、降血脂、抗腫瘤等功能[4-5]，但目前有關(guān)GSPE對(duì)睡眠呼吸暫停及工作記憶影響研究少見報(bào)道。筆者采用濃度結(jié)合時(shí)間切換的方式模擬臨床睡眠呼吸暫停狀態(tài)的低氧，建立慢性間歇性低氧模型，探討GSPE對(duì)間歇性低氧大鼠空間記憶與5-HT的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 清潔級(jí)雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠80只(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物資源中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：中科動(dòng)管第003號(hào)，動(dòng)物使用合格證號(hào)：0127011)，體質(zhì)量210～230 g，飼養(yǎng)于河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%；測(cè)氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；低氧控制程序(河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)院呼吸科)；純氮(唐山六方氣體高科技有限公司)；低氧艙(天津醫(yī)科大學(xué)研制)。GSPE由天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供(純度95%，批號(hào)：20060705)。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備 雄性SD大鼠80只，采用抽簽法隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組，GSPE大、小劑量組，各組動(dòng)物20只。正常對(duì)照組：向艙內(nèi)循環(huán)注入壓縮空氣30 s，流速3 L·min-1；空氣90 s流速3 L·min-1，氧濃度維持在21%；模型對(duì)照組：模擬臨床呼吸暫停事件，每天8：00～16：00將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于模型艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)?0 s，流速為10 L·min-1，空氣40 s，流速為10 L·min-1(復(fù)氧時(shí)間)，空氣50 s流速為5 L·min-1(常氧維持時(shí)間)，每2 min為1個(gè)循環(huán)，使得艙內(nèi)氧濃度在5%～21%間循環(huán)[6]，每天實(shí)驗(yàn)8 h，持續(xù)時(shí)間為6周。干預(yù)組在動(dòng)物進(jìn)入低氧模型艙前2周開始每天灌胃給藥1次，持續(xù)給藥6周，GSPE大、小劑量分別為200，100 mg·kg-1。用數(shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)艙內(nèi)氧濃度變化，使艙內(nèi)氧濃度維持在各自的氧濃度內(nèi)，使其氧濃度波動(dòng)范圍在±0.5%以內(nèi)。

模型對(duì)照組抽簽法隨機(jī)取大鼠2只，分別在連續(xù)12個(gè)低氧暴露周期內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)采血。以剛開始充入氮?dú)庾鳛榱銜r(shí)間采血點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)分析第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該是大鼠體內(nèi)血氧分壓開始下降點(diǎn)。依次在下一個(gè)周期內(nèi)采血，每個(gè)采血點(diǎn)都較前一個(gè)采血周期點(diǎn)推后10 s，一個(gè)周期內(nèi)2 min，正好為12個(gè)采血時(shí)間點(diǎn)，采取的動(dòng)脈血在10 min內(nèi)送至血?dú)夥治鍪覝y(cè)定，記錄大鼠動(dòng)脈血?dú)庋醴謮?、二氧化碳分壓之間的變化情況，以判斷模型是否成功。

1.3 記憶功能檢測(cè) 采用Morris水迷宮檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將安全島置于水迷宮第二象限中，加水至高過安全島2～3 cm，水溫保持在22～25 ℃，由攝像機(jī)及計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤、攝相和統(tǒng)計(jì)大鼠分別由四個(gè)象限入水后尋找到安全島的軌跡、潛伏值和穿臺(tái)次數(shù)。如在90 s內(nèi)未找到安全島，則潛伏期值記為90 s。在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死前晨起訓(xùn)練5次后，分別在上午、下午各測(cè)試3次，共6次納入統(tǒng)計(jì)，記錄各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間及撤去平臺(tái)后穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)，取總均值。

1.4 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及病理組織學(xué)檢測(cè) 動(dòng)物用4%多聚甲醛灌注固定后取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織，常規(guī)石蠟包埋。Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，蘇木精-伊紅染色。在有測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡(200倍)下觀察額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化并計(jì)數(shù)該視野下的存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量(有明顯細(xì)胞膜、細(xì)胞核、核仁為存活神經(jīng)細(xì)胞)。具體方法：將每個(gè)標(biāo)本取4張切片，在額葉皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)選取視野4個(gè)，在有測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡(200倍)下觀察額葉皮質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞變化并計(jì)數(shù)，以每個(gè)視野下平均細(xì)胞百分率(皮質(zhì)區(qū)存活細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量比值/%)表示。

1.5 高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)腦內(nèi)5-HT HPLC Column C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保護(hù)柱DIKMA(4 mm×8 mm，5 μm)。柱溫20 ℃，流動(dòng)相選用檸檬酸、檸檬酸三鈉、甲醇-離子對(duì)試劑-依地酸二鈉混合液(pH4.2)，經(jīng)孔徑0.22 μm的濾膜過濾后使用，梯度洗脫：0～5 min 97.5%A；～12 min 97.5%→88.0%A；12～16 min 85.0%A；～30 min 85.0%A；～35 min 85.0%→97.5% A。流速1.0 mL·min-1。檢測(cè)器設(shè)定電壓為350 mV。取凍存大鼠腦皮層準(zhǔn)確稱質(zhì)量，用預(yù)冷的高氯酸(內(nèi)含0.15 μg·mL-12，3-二羥基甲酸)制備10%的組織勻漿，離心15 min，上清液經(jīng)孔徑0.22 μm的濾膜過濾后取10 μL自動(dòng)進(jìn)樣，在上述色譜條件下，采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定5-HT含量，以ng·g-1腦組織濕質(zhì)量表示，樣本處理液：0.01%半胱氨酸加0.2 mol·L-1高氯酸鈉加0.5 mmol·L-1依地酸。標(biāo)準(zhǔn)液配制：0.1 mol·L-1制備成0.35 mg·mL-1對(duì)照品儲(chǔ)存液，按上述色譜條件下處理。

2 結(jié)果

2.1 GSPE對(duì)慢性間歇性低氧大鼠空間記憶能力的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠逃避潛伏期時(shí)間均延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)均減少；與模型對(duì)照組比較，GSPE組大鼠逃避潛伏期時(shí)間顯著縮短，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯增加(P<0.05)。見圖1和表1。

與正常對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*1P<0.05；與模型對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*2P<0.05；與GSPE小劑量組同時(shí)間點(diǎn)比較，*3P<0.05

Compared with normal control group at the same time point，*1P<0.05；compared with model control group at the same time point，*2P<0.05；compared with low-dose GSPE group at the same time point，*3P<0.05

2.2 GSPE對(duì)慢性間歇性低氧大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組大鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊。模型對(duì)照組大鼠在間歇性低氧2，6周均可見變性壞死神經(jīng)細(xì)胞，胞體收縮呈三角形，細(xì)胞質(zhì)嗜色性減弱，核皺縮濃染，細(xì)胞周圍出現(xiàn)空隙；視野內(nèi)可見核溶解及神經(jīng)細(xì)胞空泡樣變，細(xì)胞間隙顯著增寬，存活神經(jīng)細(xì)胞均明顯減少(P<0.05)；GSPE組中皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷減輕，大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，存活神經(jīng)細(xì)胞顯著增多(P<0.05)，見圖2。

2.3 GSPE對(duì)慢性間歇性低氧腦組織5-HT含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腦皮質(zhì)中5-HT含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，GSPE組中腦組織5-HT含量都有不同程度升高(P<0.05)。見表2。

3 討論

工作記憶包括負(fù)責(zé)加工位置、距離等空間信息的視空間模板和處理語(yǔ)音方面的信息語(yǔ)音環(huán)路以及中央執(zhí)行系統(tǒng)，其核心系統(tǒng)位于前額葉[7]。神經(jīng)影像學(xué)顯示OSAHS患者大腦的多個(gè)部位和功能區(qū)受損如大腦皮質(zhì)灰質(zhì)丟失、含海馬區(qū)在內(nèi)的腦實(shí)質(zhì)萎縮等；應(yīng)用事件相關(guān)電位評(píng)測(cè)睡眠呼吸暫?；颊?，發(fā)現(xiàn)反映信息加工的事件電位N270電位(前額及枕部)波幅降低，患者工作記憶降低[8]。筆者在本研究利用水迷宮評(píng)測(cè)動(dòng)物記憶行為，其中逃避潛伏期反映大鼠尋找平臺(tái)位置的能力，即有效獲取及有效處理信息的能力；穿越原平臺(tái)位置次數(shù)反映記憶的保持能力。結(jié)果顯示GSPE可改善OSAHS低氧導(dǎo)致的工作記憶損傷。研究認(rèn)為OSAHS造成的間歇性低氧類似于缺血-再灌注，可造成腦內(nèi)生成大量氧自由基，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、丟失，引起記憶功能損害[9]；而GSPE抗氧化能力極強(qiáng)，是維生素E的50倍、維生素C的20倍，與超氧化物歧化酶相當(dāng)[10]，因此可改善睡眠呼吸暫停大鼠記憶能力，能增強(qiáng)其信息的獲取、加工及保持能力。

表2 4組大鼠皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞密度和5-HT含量比較

Tab.2 Comparison of the density of viable nerve cell and 5-HT content in cortex among four groups of rats

與正常對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*1P<0.05；與模型對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*2P<0.05；與GSPE小劑量組同時(shí)間點(diǎn)比較，*3P<0.05

Compared with normal control group at the same time point，*1P<0.05；compared with model control group at the same time point，*2P<0.05；compared with low-dose GSPE group at the same time point，*3P<0.05

5-HT是腦內(nèi)存在的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)記憶的調(diào)節(jié)以及腦功能的維持有重要作用。MAZER等[11]給成年大鼠腦中灌注酪氨酸羥化酶抑制劑對(duì)氯苯丙氨酸以耗竭5-HT，結(jié)果出現(xiàn)大鼠學(xué)習(xí)能力缺損。學(xué)習(xí)記憶能力下降的大鼠其腦內(nèi)5-HT亦顯著降低[12]。研究發(fā)現(xiàn)迷迭香對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有改善作用，且這種作用與腦內(nèi)5-HT的改變有關(guān)[13]。睡眠呼吸暫?；颊唧w內(nèi)5-HT水平發(fā)生變化，且這種變化與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，隨間歇性低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠腦內(nèi)5-HT的含量降低，說明5-HT參與OSAHS模式間歇性低氧對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理進(jìn)程。睡眠OSAHS模式的間歇低氧造成的反復(fù)低氧后再?gòu)?fù)氧，可引起神經(jīng)細(xì)胞能量代謝障礙、氧自由基損傷，導(dǎo)致單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT等合成、攝取和釋放紊亂，腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)5-HT含量降低[15]。本研究中，給予GSPE干預(yù)后，模型大鼠腦內(nèi)5-HT含量明顯改善，其表達(dá)水平呈劑量依賴性顯著增加，說明GSPE對(duì)睡眠呼吸暫停間歇性低氧大鼠腦內(nèi)5-HT水平有一定調(diào)節(jié)作用。這可能是GSPE改善OSAHS致工作記憶損傷的機(jī)制之一。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSPE可調(diào)節(jié)OSAHS模式低氧大鼠腦內(nèi)5-HT水平，減輕睡眠OSAHS模式低氧大鼠空間工作記憶能力。鑒于GSPE具有多種藥理活性，其改善OSAHS神經(jīng)損傷及調(diào)控5-HT的機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.003

Effects of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Spatial Working Memory and 5-Hydroxytryptamine in the Rat Model of Intermittent Hypoxia

LIU Wenqian,ZHAO Yaning,LI Jianmin

(NursingandRehabilitationCollegeofHebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the effects of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) on 5-hydroxytryptamine (5-HT) and spatial working memory after intermittent hypoxia in rats. Methods Eighty male Sprague Dawley (SD) rats were divided randomly into four groups (n=20 in each group)：the normal control, model control, GSPEs at small (100 mg·kg-1) and high (200 mg·kg-1) dose groups.Rats in the normal control group were exposed in air and the model controls suffered from intermittent hypoxia (50 mL·L-1, 8 hours daily for 6 weeks).The spatial memory ability of rats in each group was assessed with the Morris water maze (MWM).The morphological changes of neuronal cell were observed by HE staining.The concentration of 5-HT in brain was detected by high performance liquid chromatography. Results Compared with the normal control group, the MWM test showed that the latency was prolonged and the frequency of crossing the platform was higher than that in model control group (P<0.05).The survival cells and the concentration of 5-HT significantly decreased in the model control group (P<0.05).Compared with the model control group, MWM test showed that the escaping latency was shortened and the frequency of crossing the platform was increased in the GSPE treatment groups compared with the model control group (P<0.05).The above observations are more significant in GSPE high dose group that the low dose group.The survival cells and the concentration of 5-HT significantly increased in the GSPE treatment groups (P<0.05). Conclusion GSPE can regulate the concentration of 5-HT and improve learning memory function under intermittent hypoxia.

Grape seed proanthocyanidin extract; Hypoxia, intermittent; 5-Hydroxytryptamine; Memory

2013-12-11

2014-05-31

*河北省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目(ZH2012046)

劉文倩(1988-)，女，河北唐山人，碩士，從事神經(jīng)外科工作。電話：0315-3726234，E-mail：liuwenqian1988@126.com。

李建民(1974-)，女，河北唐山人，教授，博士，從事腦損傷與腦保護(hù)研究工作。電話：0315-3726234，E-mail：zyning789@126.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)01-0011-05