楊慶良，夏永華，何巖，張廣云，宋歌

(1.河南省安陽(yáng)市人民醫(yī)院泌尿外科，安陽(yáng) 455000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，新鄉(xiāng) 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新鄉(xiāng) 453100)

LHRHa與八聚精氨酸共修飾載氟尿嘧啶靶向脂質(zhì)體的構(gòu)建及其抗前列腺癌作用

楊慶良1，夏永華2，何巖3，張廣云1，宋歌1

(1.河南省安陽(yáng)市人民醫(yī)院泌尿外科，安陽(yáng) 455000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，新鄉(xiāng) 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新鄉(xiāng) 453100)

目的 構(gòu)建促黃體激素釋放激素類似物(LHRHa)與八聚精氨酸(R8)共修飾載氟尿嘧啶(5-FU)脂質(zhì)體(LHRHa/R8-LP-5-FU)，對(duì)其前列腺癌靶向性以及治療效果進(jìn)行初步研究。方法 采用薄膜分散法制備LHRHa/R8-LP-5-FU，考察其形態(tài)、粒徑、電位，并通過(guò)PC-3前列腺癌細(xì)胞定性和定量攝取實(shí)驗(yàn)考察其前列腺癌細(xì)胞靶向性。采用噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)以及腫瘤球?qū)嶒?yàn)考察LHRHa/R8-LP-5-FU對(duì)PC-3細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果 所制備LHRHa/R8-LP-5-FU粒徑為(115.0±15.2) nm，電位為(11.00±2.15) mV，5-FU的包封率(84.5±5.1)%。體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明，PC-3細(xì)胞對(duì)LHRHa/R8-LP攝取效率分別是R8修飾脂質(zhì)體(R8-LP)和LHRHa修飾脂質(zhì)體(LHRHa-LP)2.8和3.2倍(P<0.01)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以0.9%氯化鈉溶液為對(duì)照，LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制率分別為(26.4±4.5)%，(39.5±4.2)%，(48.6±3.5)%和(82.5±4.3)%(P<0.01)。LHRHa/R8-LP-5-FU對(duì)腫瘤球的生長(zhǎng)抑制作用明顯高于其他脂質(zhì)體。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論 LHRHa與細(xì)胞穿膜肽共修飾載5-FU脂質(zhì)體具有良好的前列腺腫瘤細(xì)胞靶向性和抗腫瘤作用，是一種潛在的治療前列腺癌的高效給藥系統(tǒng)。

促黃體激素釋放激素類似物；八聚精氨酸；脂質(zhì)體；癌，前列腺

前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，在西方國(guó)家，前列腺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，居西方國(guó)家男性所有惡性腫瘤死亡率的首位，發(fā)病率的第2位[1]。促黃體激素釋放激素受體在前列腺癌和卵巢癌表面高度表達(dá)[2-3]。脂質(zhì)體是一種被廣泛研究的靶向給藥系統(tǒng)，脂質(zhì)體可以進(jìn)行表面修飾，可以引入聚乙二醇延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)的效果，也可以連接配體成為主動(dòng)靶向脂質(zhì)體[4]。筆者將促黃體激素釋放激素類似物(luteinizing hormone-releasing hormone analogues，LHRHa)和細(xì)胞穿膜肽八聚精氨酸(R8)共同連接到脂質(zhì)體的表面，以氟尿嘧啶(5-FU)為模型藥物，進(jìn)行前列腺癌的腫瘤靶向治療研究。

1 材料與方法

1.1 試劑 生物素修飾LHRHa(上海強(qiáng)耀生物公司，含量98.5%，批號(hào)：130602P)；R8(上海強(qiáng)耀生物公司，含量99.9%，批號(hào)：131121R)；大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司)；生物素修飾DSPE-PEG2000(美國(guó)Avanti polar lipids公司)；鏈霉親和素(北京博奧森生物公司)；膽固醇(Cho，美國(guó)Sigma公司)；達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM，美國(guó)GIBCO公司)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記磷脂(美國(guó)Avanti polar lipids公司)；DSPE-PEG2000-MAL(美國(guó)Sigma公司)；其余試劑為分析純。前列腺腫瘤細(xì)胞(PC-3，ATCC)。

1.2 儀器 Sizer Nano ZS90型激光粒度儀及Zeta電位分析儀(英國(guó)Malvern instruments Ltd.)；H-600IV型透射電子顯微鏡(日本Hitachi)。

1.3 方法

1.3.1 脂質(zhì)體的制備及表征 參照文獻(xiàn)[3]方法制備LHRHa-LP-5-FU。取大豆磷脂9.96 mg、膽固醇2.0 mg、生物素修飾DSPE-PEG2000(摩爾比為90：5：5)和5-FU 1.05 mg溶于三氯甲烷溶液。抽干成膜，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)水化得到生物素修飾脂質(zhì)體。取生物素修飾脂質(zhì)體與過(guò)量的LHRHa混合，4 ℃震蕩反應(yīng)30 min，過(guò)CL4B柱，得到LHRHa-LP-5-FU。參照文獻(xiàn)[5-6]方法合成DSPE-PEG2000-R8。取處方量的大豆磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000-R8(摩爾比為94.5：5：0.5)和5-FU溶于三氯甲烷溶液。抽干成膜，用PBS 2 mL水化得到R8-LP-5-FU。

取相同量的大豆磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000-R8、生物素修飾DSPE-PEG2000(摩爾比為89.5：5：0.5：5)和5-FU溶于三氯甲烷溶液，采用同于制備LHRHa-LP-5-FU的方法制備得到LHRHa/R8-LP-5-FU。

取適量樣品用磷鎢酸染色，置于透射電鏡下觀察脂質(zhì)體的表觀構(gòu)象。取適量脂質(zhì)體用粒度儀測(cè)定其粒徑及電位，采用葡萄糖凝膠柱色譜法分離脂質(zhì)體與未包載的5-FU，用高效液相色譜(HPLC)法在波長(zhǎng)273 nm處檢測(cè)5-FU含量。按照包封率(%)=W包/W投×100%計(jì)算5-FU的包封率。

1.3.2 PC-3細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體的攝取考察 按照“1.3.1”項(xiàng)下方法，用FITC-PE取代適量大豆磷脂，制備FITC標(biāo)記的脂質(zhì)體。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)的密度接種于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入適量LHRHa-LP、R8-LP和LHRHa/R8-LP使孔中脂質(zhì)體濃度為0.15 mg·mL-1，37 ℃分別孵育2 和4 h后除去含脂質(zhì)體培養(yǎng)液，冷PBS清洗3次，0.25%胰酶消化后離心，PBS清洗3次，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞熒光值。

為了定性觀察PC-3細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取情況，將脂質(zhì)體與PC-3細(xì)胞共同孵育4 h后，將細(xì)胞用PBS漂洗3次，加入2 μg·mL-14'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)溶液，室溫孵育20 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛溶液固定15 min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞攝取。

1.3.3 噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法分析檢測(cè)不同脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率 培養(yǎng)PC-3細(xì)胞并接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入無(wú)菌過(guò)濾后的LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU。將孔板移入37 ℃、二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng)24和48 h后取出，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入二甲亞砜溶液200 μL，37 ℃避光振搖15 min，用熒光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔的吸光度(A)。

1.3.4 腫瘤球生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培養(yǎng)液中和胰酶，并將細(xì)胞吹打下來(lái)后離心，棄去上清液，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后接種于用低熔點(diǎn)瓊脂糖預(yù)處理的96孔板中，將96孔板移入37 ℃ 、CO2孵箱中培養(yǎng)。7 d后成長(zhǎng)為腫瘤球。加入無(wú)菌過(guò)濾后的LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU。以0.9%氯化鈉溶液為陰性對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)腫瘤球體積大小變化情況。

2 結(jié)果

2.1 LHRHa/R8-LP-5-FU的粒徑、電位以及包封率 LHRHa/R8-LP-5-FU磷鎢酸染色后在電鏡下觀察(圖1)，呈現(xiàn)大小比較均一的球狀。激光粒度儀測(cè)得LHRHa/R8-LP-5-FU的粒徑為(115.0±15.2) nm，電位為(11.00±2.15) mV，多分散系數(shù)<0.3。3種不同脂質(zhì)體粒徑范圍接近，說(shuō)明靶頭的引入對(duì)脂質(zhì)體的粒徑?jīng)]有影響。見(jiàn)表1。

圖1 LHRHa/R8-LP-5-FU的透射電鏡圖(×5 000)

Fig.1 Transmission electron microscopy image of the LHRHa/R8-LP-5-FU(×5 000)

表1 不同脂質(zhì)體的粒徑與電位

2.2 LHRHa/R8-LP的體外細(xì)胞攝取 在PC-3細(xì)胞表面有促黃體激素釋放激素受體高度表達(dá)。細(xì)胞攝取的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。PC-3細(xì)胞對(duì)LHRHa/R8-LP的攝取效率分別是R8修飾脂質(zhì)體(R8-LP)和LHRHa修飾脂質(zhì)體(LHRHa-LP)的2.8和3.2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.5，20.3，均P<0.01)。定性的激光共聚焦熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖3。綠色是脂質(zhì)體的FITC熒光，藍(lán)色是DAPI染色細(xì)胞核。LHRHa/R8-LP組熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于R8-LP和LHRHa-LP，且3組脂質(zhì)體的熒光強(qiáng)度都強(qiáng)于普通脂質(zhì)體組。這與定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 PC-3細(xì)胞在不同時(shí)間對(duì)不同脂質(zhì)體的攝取

與LP比較，*1P<0.01；與R8-LP 和LHRHa-LP 比較，*2P<0.01

Fig.2 Uptake of different liposomes by PC-3 cells at different time points

Compared with LP，*1P<0.05；compared with R8-LP and LHRHa-LP，*2P<0.01

2.3 LHRHa/R8-LP-5-FU對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 PC-3細(xì)胞給藥48 h后，以0.9%氯化鈉溶液組為對(duì)照，LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LP-5-FU對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制率分別為(26.4±4.5)%，(39.5±4.2)%，(48.6±3.5)%和(82.5±4.3)%。與0.9%氯化鈉溶液組比較，各脂質(zhì)體給藥組均能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 LHRHa/R8-LP-5-FU對(duì)腫瘤球的生長(zhǎng)抑制作用 腫瘤球生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0.9%氯化鈉溶液組比較，各組脂質(zhì)體均能抑制腫瘤球的生長(zhǎng)。給藥8 d后，0.9%氯化鈉溶液組腫瘤球持續(xù)生長(zhǎng)，體積增大到原體積的1.43倍，而LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU分別使腫瘤體積減小到原體積的83%，65%，71%和44%。與0.9%氯化鈉溶液組比較，各脂質(zhì)體給藥組均能有效抑制腫瘤球的生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

3 討論

理想的腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng)不僅需要在全身給藥后將藥物濃集在腫瘤組織，而且還需要能夠特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞，將藥物高效地傳遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而將治療作用最大化，并減少抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)[7]。研究表明，促黃體激素釋放激素受體在前列腺癌表面大量表達(dá)[2]，從而成為靶向治療前列腺癌的潛在靶點(diǎn)。將LHRH修飾到載體微粒表面，制成腫瘤靶向遞藥微粒，通過(guò)實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention,EPR)使微粒能夠在腫瘤部位靶向性聚集，提高靶向目標(biāo)的藥物濃度、生物利用度以及療效，同時(shí)降低藥物在非腫瘤部位的不良反應(yīng)[8-9]。然而，單純依靠LHRH修飾載體，通過(guò)被動(dòng)靶向到達(dá)腫瘤部位后，可能出現(xiàn)受體飽和等問(wèn)題。R8是由8個(gè)精氨酸組成的直鏈肽，能夠穿過(guò)與之相接觸的任何細(xì)胞的細(xì)胞膜[10]，這一特點(diǎn)限制了R8在全身系統(tǒng)給藥中的應(yīng)用。筆者將細(xì)胞穿膜肽R8與LHRH共同修飾到脂質(zhì)體表面，首先通過(guò)腫瘤組織的EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤組織，然后依靠LHRH識(shí)別腫瘤組織表面高度表達(dá)的LHRH受體，再利用LHRH受體介導(dǎo)以及R8的穿膜作用使脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞的二級(jí)靶向。

Fig.3 Uptake of FITC-labeled different liposomes by PC-3 cells by confocal laser scanning microscopy(CLSM)(×200)

Fig.4 Inhibitory effect of different liposomes on PC-3 tumor ball

采用生物素-親和素橋接系統(tǒng)將LHRH連接到脂質(zhì)體表面，能夠有效保持LHRH的生物活性。制備得到的共修飾脂質(zhì)體的粒徑約120 nm。納米載體的粒徑范圍在10～150 nm，能夠有效避開(kāi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，通過(guò)EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤組織[11]。在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，與普通脂質(zhì)體相比，經(jīng)過(guò)LHRHa或者R8修飾都能夠顯著增強(qiáng)PC-3前列腺癌細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取，其中對(duì)共修飾脂質(zhì)體的攝取效率顯著高于LHRHa或者R8單獨(dú)修飾的脂質(zhì)體，這說(shuō)明二者具有協(xié)同作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，LHRHa/R8-LP-5-FU對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，這是由于LHRH和R8共同修飾脂質(zhì)體后，脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力和入胞能力顯著增強(qiáng)，進(jìn)而增強(qiáng)了入胞的藥物量，增強(qiáng)細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞增殖。研究表明在某些實(shí)體腫瘤組織中，由于腫瘤組織致密生長(zhǎng)，腫瘤內(nèi)部壓力高且血管少，因此給藥系統(tǒng)很難進(jìn)入腫瘤組織深部[12]。本研究構(gòu)建了體外腫瘤球模型模擬脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤組織后對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制能力，結(jié)果與細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，相比于其他脂質(zhì)體，共修飾脂質(zhì)體能夠顯著抑制腫瘤球的生長(zhǎng)。

綜上所述，LHRHa/R8-LP-5-FU是一種很有前景的前列腺腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。LHRHa/R8-LP能夠更加有效地將抗腫瘤藥物遞送至LHRH高度表達(dá)的腫瘤組織，并通過(guò)LHRHa和R8的共同作用，促進(jìn)入胞，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。該給藥系統(tǒng)的體內(nèi)靶向性和體內(nèi)療效研究正在進(jìn)行中。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.007

Preparation of LHRHa and R8 Co-modified 5-FU Loaded Liposome and Its Anti-prostate Cancer Effect

YANG Qingliang1, XIA Yonghua2, HE Yan3, ZHANG Guangyun1, SONG Ge1

(1.DepartmentofUrinarySurgery,People'sHospitalofAnyang,HenanProvince,Anyang455000,China; 2.DepartmentofDermatology,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China; 3.DepartmentofUrinarySurgery,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China)

Objective To prepare luteinizing hormone-releasing hormone analogues (LHRHa) and R8 co-modified 5-FU loaded liposome (LHRHa/R8-LP-5-FU) and investigate therapeutic effect towards prostate cancer. Methods The co-modified liposome was prepared by film-ultrasonic method.The appearance, particle size and Zeta potential were evaluated.The cellular uptake by PC-3 cellsinvitrowas used to evaluate the targeting efficiency.The anti-proliferation activity of LHRHa/R8-LP-5-FU was evaluated by MTT assay.Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of LHRHa/R8-LP-5-FUinvitro. Results The particle diameter of the co-modified liposome was (115.0±15.2) nm with the Zeta potential of (11.00±2.15) mV.The embedding ratio of LHRHa/R8-LP-5-FU was (84.5±5.1)%.The result demonstrated that the ratio of co-modified liposome uptaken by PC-3 were 2.8 and 3.2 times higher than that of R8-LP and LHRHa-LP(P<0.01), respectively, and the cell inhibition of LP-5-FU, R8-LP-5-FU, LHRHa-LP-5-FU and LHRHa/R8-LP-5-FU were (26.4±4.5)%, (39.5±4.2)%, (48.6±3.5)% and (82.5±4.3)% (P<0.01), respectively.The inhibition of the growth of tumor sphere by LHRHa/R-LP-5-FU was obviously higher than that of the other liposome groups. The experimental results of cell toxicity were consistent with the experimental results of cell uptake. Conclusion The co-modified liposome may serve as a promising prostate cancer delivery system for antitumor agents.

Luteinizing hormone-releasing hormone analogues; R8; Liposome; Cancer, prostate

2013-11-11

2014-05-15

楊慶良(1977-)，男，山東陽(yáng)谷人，主治醫(yī)師，在讀碩士，研究方向：泌尿道腫瘤。電話：0372-3335638，E-mail：751195651@qq.com 。

R979.1；R965

A

1004-0781(2015)01-0030-05