張紅霞

(勝利油田中心醫(yī)院腎內(nèi)科，東營 257034)

京尼平對糖尿病腎病小鼠腎臟的保護(hù)作用

張紅霞

(勝利油田中心醫(yī)院腎內(nèi)科，東營 257034)

目的 探討京尼平對糖尿病腎病(DN)小鼠腎臟的保護(hù)作用。方法 昆明種小鼠30只，隨機(jī)分為正常對照組、聚乙二醇組和京尼平組，每組10只。后兩組使用鏈脲佐菌素腹腔注射制作小鼠DN模型。京尼平組每天給予溶解于聚乙二醇的京尼平50 mg·kg-1灌胃。聚乙二醇組只給予聚乙二醇灌胃。檢測小鼠血糖、體質(zhì)量、腎超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)，通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測小鼠尿清蛋白、腎腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及血清肌酐、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的含量。采用Western blot檢測小鼠腎臟核因子-κB(NF-κB)p65、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 正常對照組、聚乙二醇組和京尼平組24 h尿清蛋白分別為(11.40±0.98)，(120.30±9.57)，(56.20±4.07) mg；血清肌酐分別為(54.3±9.7)，(130.6±21.3)，(87.3±10.1) μmol·L-1；腎臟SOD活性分別為(2 430±1 010)，(2 260±370)，(3 060±400) U·L-1；腎TNF-α分別為(683.50±54.88)，(961.40±39.52)，(531.70±15.84) pg·mg-1；血清IL-6分別為(74.40±16.70)，(686.60±12.38)，(196.30±62.50) pg·mg-1。免疫印跡顯示京尼平組NF-κB p65、iNOS和caspase-3的表達(dá)均降低(P<0.01)。結(jié)論 京尼平對DN小鼠腎臟具有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其抗氧化和抗炎癥作用有關(guān)。

京尼平；糖尿病腎??；氧化應(yīng)激；炎癥因子

中國2010年糖尿病和前驅(qū)糖尿病發(fā)病率分別為9.7%和15.5%，總?cè)藬?shù)超過2億人[1]，其中，9%～36%的糖尿病患者最終會發(fā)展為糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)。DN是導(dǎo)致終末期腎病和腎移植的重要因素之一。DN患者腎小球濾過率增高，出現(xiàn)清蛋白尿、蛋白尿、腎小球基底膜增厚和基底膜基質(zhì)出現(xiàn)沉積，最終造成腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致進(jìn)行性腎功能障礙[2]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和炎癥是導(dǎo)致DN發(fā)生的重要因素。高血糖可導(dǎo)致活性氧簇的產(chǎn)生增加，并同時通過對抗氧化酶的非酶糖基化降低抗氧化作用。DN患者的炎癥標(biāo)志物水平高于正常人群[3]。京尼平是梔子果實提取物中的活性化合物，是梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，可以緩解高血糖導(dǎo)致的β胰島細(xì)胞的功能障礙，增加胰島素的分泌[4]。本研究旨在探討京尼平是否對DN小鼠的腎臟具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 選用體質(zhì)量18～22 g的無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級雄性昆明種小鼠30只，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(魯)2012-0014，合格證號：魯實動字0038號，由專業(yè)人員統(tǒng)一進(jìn)行適應(yīng)性平衡飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，批號：2012S0130)購自美國Sigma-Aldrich公司，-20 ℃保存，無菌檸檬酸緩沖液購自上海前塵生物有限公司，STZ溶解于pH 4.5的無菌檸檬酸緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)購于美國Sigma-Aldrich公司。尿清蛋白檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)定量試劑盒(美國，Bethyl Laboratories，批號：20120805)。腎組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性通過水溶性四唑鹽總SOD活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號：20120126)測定。腎組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)通過脂質(zhì)氧化檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號：20110910)測定。腎組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量采用ELISA定量試劑盒(美國eBioscience公司，批號：ZH20120902)測定。京尼平購自中國食品藥品檢定研究院(含量98%，批號：110850-201210)

1.3 主要儀器與環(huán)境 血糖檢測應(yīng)用歐姆龍血糖儀及其試紙，生化自動分析儀為德國邁瑞公司，SPF級動物飼養(yǎng)室。

1.4 方法

1.4.1 模型建立及分組 小鼠隨機(jī)分為3組，京尼平組、PEG組和正常對照組，每組10只。前2組小鼠均腹腔注射STZ 50 mg·kg-1，連續(xù)注射5 d。DN小鼠模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)為：①隨機(jī)血糖≥16.7 mmol·L-1；②出現(xiàn)蛋白尿、腎功能異常。造模成功后，京尼平組每天給予溶解于PEG的京尼平(50 mg·kg-1)灌胃。PEG組只給予PEG灌胃。所有動物自由飲水。給藥觀察12周。

1.4.2 樣本采集與檢測 STZ 注射后的第12周所有動物頸動脈取血測定血糖(glucose，Glu)，分離血清測定血清肌酐(serum creatinine，SCr)，并用代謝籠收集 24 h尿液測定尿總蛋白(serum total protein，TP)、內(nèi)生尿肌酐清除率( creatinine clearance rate，Ccr)。由于Ccr受體表面積的影響，本研究用Ccr/體質(zhì)量(kg)加以校正。Ccr(mL·min-1·kg-1)=尿肌酐(1 μmol·L-1)×每分鐘尿量(mL·min-1) /[血肌酐(μmol·L-1)×體質(zhì)量(kg)]。同時取小鼠腎臟，測量腎皮質(zhì)組織 SOD、 MDA、TNF-α及血清 IL-6的水平。所有處死的小鼠及生物樣品滅菌后無害化處理，對不符合標(biāo)準(zhǔn)的動物和死亡的動物數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4.3 Western blot檢測 在第12周，剪取小鼠腎皮質(zhì)，勻漿并用含10%苯甲基磺酰氟的放射免疫沉淀裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)在4 ℃裂解細(xì)胞30 min。然后10 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液以二辛可酸法測定蛋白濃度。取蛋白50 μg加入上樣緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。12% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳60 min后將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上(Pall corporation，USA)。在含5%脫脂奶粉的TBST(Tris-buffered saline containing 0.05% Tween-20)緩沖液中室溫封閉2 h，兔抗核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)p65多克隆IgG(1 500，Santa Cruz，USA)、兔抗誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)多克隆IgG(11 000，Chemicon，USA)、兔抗caspase-3多克隆IgG(1：250，Cell Signaling Technology，USA)以及小鼠抗β-actin單克隆IgG(1：1 000，Santa Cruz Biotechnology，USA)4 ℃孵育后過夜。TBST沖洗3次，每次8 min，然后在室溫分別與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(1：5 000，Abcam，UK)或山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶(1：4 000，Santa Cruz Biotechnology，USA)孵育2 h。TBST沖洗3次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore corporation，USA)曝光，圖像采用AlphaView SA軟件分析。目的蛋白的量以其與β-actin的比值來表示。

2 結(jié)果

2.1 DN建模結(jié)果 在第12周，正常對照組血糖正常，其余20只隨機(jī)血糖≥16.7 mmol·L-1，且腎功能異常，說明DN模型成功。到實驗結(jié)束時PEG組和京尼平組共死亡動物4只。

2.2 京尼平對小鼠血糖、體質(zhì)量及腎功能影響 PEG組血糖顯著高于正常對照組(P<0.01)，京尼平組血糖降低(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.01)。PEG組小鼠體質(zhì)量較正常對照組降低(P<0.01)，京尼平組小鼠體質(zhì)量較PEG組增高(P<0.05)，見表1。腎功能方面，PEG組尿清蛋白、Scr及Ccr較正常對照組均顯著增高(均P<0.01)；京尼平組與PEG組相比，尿清蛋白、SCr及CCr水平明顯降低(均P<0.01)。

2.3 京尼平對小鼠腎SOD活性和MDA含量影響 與正常對照組比較，PEG組小鼠腎SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；京尼平組和PEG組相比，SOD活性增加(P<0.05)，MDA降低(P<0.01)。見表1。

2.4 京尼平對小鼠腎TNF-α和血清IL-6含量影響 PEG組小鼠腎組織中TNF-α含量升高(P<0.01)，京尼平可抑制這種改變(P<0.01)。PEG組小鼠血清IL-6的含量也顯著升高(P<0.01)，京尼平也可抑制這種改變(P<0.01)。見表1。

2.5 Western blot檢測NF-κB p65、iNOS和促凋亡斷裂caspase-3的表達(dá) 見圖1。結(jié)果顯示，與正常對照組比較，NF-κB p65、iNOS和caspase-3在PEG組小鼠腎組織中表達(dá)量顯著升高(t=5.03，3.91，6.17，均P<0.01)，京尼平可顯著降低DN小鼠腎組織中這3種蛋白的表達(dá)(t=2.72，2.69，3.05，均P<0.01)。

3 討論

氧化應(yīng)激和炎癥對于DN的發(fā)生發(fā)展起重要作用。糖尿病患者SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、維生素C等抗氧化因子活性或含量降低。MDA、共軛二烯(反映脂蛋白氧化情況)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products，AOPP)、蛋白質(zhì)羰基含量和羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG)在糖尿病患者中升高。與沒有血管并發(fā)癥的糖尿病患者比較，DN患者的以上指標(biāo)升高更加明顯[5]。對于培養(yǎng)的足細(xì)胞，高糖可導(dǎo)致活性氧簇的產(chǎn)生，激活促凋亡p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)，進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞的凋亡。在小鼠1型和2型糖尿病模型中，足細(xì)胞的凋亡早于足細(xì)胞的耗盡、尿清蛋白排泄和系膜基質(zhì)增生，導(dǎo)致DN的早期病理改變[6]。

2型糖尿病和DN患者炎癥標(biāo)志物明顯升高。IL-6可在系膜細(xì)胞和足細(xì)胞水平影響細(xì)胞外基質(zhì)的變化，刺激系膜細(xì)胞的增生和纖連蛋白的表達(dá)，并增加內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性。TNF-α對于DN早期階段出現(xiàn)的鈉潴留和腎臟肥大具有重要作用。腎臟可以產(chǎn)生TNF-α，多因素分析顯示尿TNF-α的水平與蛋白尿有顯著關(guān)聯(lián)[7]。NF-κB信號通路對DN中腎纖維化和炎癥的發(fā)展起重要作用[8]。糖尿病使得活化的NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中并促進(jìn)iNOS等靶基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生并導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)的纖維化[9]。研究表明，高血糖還可通過Bcl-2、p53、caspase-3等信號通路引起足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、近端小管上皮細(xì)胞的凋亡[10-12]。

表1 3組小鼠第12周時觀察指標(biāo)比較

與正常對照組比較，*1P<0.01，*4P<0.05；與PEG組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01，*4P<0.05；compared with PEG group ，*2P<0.05，*3P<0.01

與正常對照組比較，*1P<0.01；與PEG組比較，*2P<0.01

圖1 3組小鼠腎組織中NF-κB p65、iNOS和caspase-3表達(dá)的比較

Compared with the normal group,*1P<0.01；compared with PEG group，*2P<0.01

Fig.1 Comparion of the expression of NF-κB p65，iNOS and caspase-3 in renal tissue among three groups of mice

京尼平是羥自由基清除劑，可劑量依賴地抑制亞鐵離子/抗壞血酸鹽誘導(dǎo)的大鼠腦組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。京尼平長時效衍生物IPRG001[(1R)-isopropy-loxygenipin]可誘導(dǎo)抗氧化酶HO-1(heme oxygenase-1)、NQO[NAD(P)H：quinine oxidoreductase-1]和GCLC(glutamate cysteine ligase catalytic subunit)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-5(retinal ganglion cells -5，RGC-5)細(xì)胞中的活性。Nrf 2(NF-E2-related factor 2)是在氧化應(yīng)激情況下誘導(dǎo)抗氧化酶活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。IPRG001在RGC-5細(xì)胞中誘導(dǎo)HO-1抗氧化的作用是通過Nrf 2/ARE(antioxidant response element)通路進(jìn)行的[13]。缺血-再灌注可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)超氧自由基、過氧化氫、羥自由基的產(chǎn)生增加。京尼平可減輕大鼠心臟缺血導(dǎo)致的自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[14]。在炎癥性疾病中，iNOS生成的一氧化氮增加并導(dǎo)致細(xì)胞損傷。京尼平可通過抑制NF-κB的活性來降低脂多糖/干擾素-γ誘導(dǎo)的鼠巨噬細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生和iNOS的表達(dá)[15]。京尼平與氨基酸生成的食用藍(lán)色素可以通過下調(diào)NF-κB的活性來抑制iNOS、環(huán)氧化酶-2、IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)[16]。京尼平可通過抑制caspase-3/7的活化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來保護(hù)鈣離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[17]。研究顯示，給予糖尿病小鼠京尼平可延緩DN的發(fā)展，減小腎小球基底膜的厚度，增加足細(xì)胞對podocin和WT1的表達(dá)。京尼平對高糖導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與其抑制解耦聯(lián)蛋白2的上調(diào)有關(guān)[2]。

本研究顯示，京尼平可降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖并減少體質(zhì)量的降低，減少尿清蛋白的漏出，對DN小鼠腎臟具有保護(hù)作用。由于給予京尼平的DN小鼠腎臟SOD活性升高，MDA和TNF-α含量減少，NF-κB和iNOS表達(dá)減少，血清IL-6的含量減少。因此，筆者推斷京尼平對DN小鼠腎臟的保護(hù)作用可能與其抗氧化和抗炎癥作用有關(guān)。對京尼平或其衍生物作用機(jī)制的進(jìn)一步研究可能對延緩和治療DN具有重要意義。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.006

Protective Effects of Genipin on Diabetic Nephropathy in Mice

ZHANG Hongxia

(DepartmentofKidneyMedicine,ShengliOilfieldCentralHospital,Dongying257034,China)

Objective To explore the kidney protective effects of genipin on diabetic nephropathy (DN) in mice. Methods ThirtyKunmingmice were randomly divided into normal control group, polyethylene glycol (PEG) group and genipin group (n=10).The diabetic mice model was established by intravenous injections of streptozotocin.The body weight, blood glucose concentration, kidney superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) were detected.Urinary albumin, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and serum interleukin-6 (IL-6) levels in kidney were measured by ELISA method.The expression of nuclear factor-κB( NF-κB), p65, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and caspase-3 were detected by Western blotting. Results In the normal control, PEG and genipin groups, the level of urinary albumin was (11.40±0.98)，(120.30±9.57) and (56.20±4.07) mg, respectively.Serum creatinine was (54.3±9.7) , (130.6±21.3) and (87.3±10.1) μmol·L-1, repectively .The renal SOD activity was (2 430±1 010), (2 260±370), and (3 060 ± 400) U·L-1, respectively.The renal TNF-α level was (683.50±54.88) , (961.40±39.52) and (531.70±15.84) pg·mg-1, respectively.Serum IL-6 level was (74.40±16.70) , (686.60±12.38) and (196.30±62.50) pg·mg-1, repectively.The expression of NF-κBp65, iNOS and caspase-3 in the kidney of genipin group were all decreased(P<0.01). Conclusion Genipin protects kidneys in DN mice through antioxidation and anti-inflammation effects.

Genipin; Diabetic nephropathy; Oxidative stress; Inflammation factor

2013-11-18

2014-05-21

張紅霞(1975-)，女，山東東營人，副主任醫(yī)師，碩士，研究方向：腎臟病學(xué)。電話：(0)13864780209，E-mail：zhanghxdy@163.com。

R282.71；R285.5

A

1004-0781(2015)01-0026-05