左鵬，王愛利，王正云，徐國鵬，胡瓊潔，邵冰，徐西琳，熊維寧，熊盛道

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430030)

·抗感染用藥專欄·

環(huán)丙沙星與乳鐵蛋白多肽嵌合體聯(lián)用對銅綠假單胞菌生物膜及密度感知系統(tǒng)信號分子生成的抑制作用*

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430030)

目的 比較環(huán)丙沙星(CIP)、乳鐵蛋白多肽嵌合體(LFchimera)單用及二者聯(lián)用對銅綠假單胞菌生物膜及密度感知(QS)系統(tǒng)信號分子(AHL)生成的抑制作用。方法 以銅綠假單胞菌野生菌株P(guān)AO1為實驗菌株，分為對照組(未干預(yù)的銅綠假單胞菌野生菌株P(guān)AO1)、CIP(0.04 μg·mL-1)組、LFchimera(0.25 μmol·L-1)組、LFchimera(1.00 μmol·L-1)組、CIP(0.04 μg·mL-1)+LFchimera(1.00 μmol·L-1)組，分別定量測定并比較各組PAO1生物被膜和QS系統(tǒng)信號分子表達。結(jié)果 與對照組PAO1生物膜定量表達(A590)(1.511 3±0.031 8)及QS系統(tǒng)信號分子表達(A420)(0.502 5±0.028 3)比較，CIP(0.04 μg·mL-1)組(1.073 3±0.010 9，0.245 3±0.014 0)、LFchimera(0.25 μmol·L-1)組(1.065 5±0.011 4，0.235 9±0.010 7)、LFchimera(1.00 μmol·L-1)組(0.665 3±0.012 9，0.108 6±0.007 0)和CIP(0.04 μg·mL-1)+ LFchimera(1.00 μmol·L-1)組(0.122 1±0.013 0，0.048 2±0.005 4)均下降(均P<0.05)；CIP(0.04 μg·mL-1)組和LFchimera(0.25 μmol·L-1)組比較，PAO1生物膜定量表達和QS系統(tǒng)信號分子表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LFchimera(1.00 μmol·L-1)組PAO1的生物膜定量表達和QS系統(tǒng)信號分子表達較LFchimera(0.25 μmol·L-1)組和CIP(0.04 μg·mL-1)組均降低(均P<0.05)；CIP(0.04 μg·mL-1)+LFchimera(1.00 μmol·L-1)組和各單獨用藥組比較，PAO1生物膜的定量表達和QS系統(tǒng)信號分子表達均下降(均P<0.05)。結(jié)論 亞抑菌濃度的CIP 和LFchimera都對銅綠假單胞菌生物膜的形成和QS系統(tǒng)信號分子的生成有抑制作用，且提高LFchimera濃度可加強抑制作用；CIP與LFchimera聯(lián)用能增強抑制作用，這種作用可能是通過抑制QS系統(tǒng)信號分子的生成實現(xiàn)。

環(huán)丙沙星；乳鐵蛋白；銅綠假單胞菌；生物膜；密度感知系統(tǒng)

銅綠假單胞菌是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌[1]，其致病機制與細胞相關(guān)性毒力因子和分泌性毒力因子有關(guān)，例如其產(chǎn)生的彈性蛋白酶、胞外酶S、磷脂酶C和綠膿菌素等[2- 3]，它們的表達都受密度感知(quorum sensing，QS)系統(tǒng)調(diào)控。銅綠假單胞菌耐藥機制包括多個方面，其中之一是銅綠假單胞菌可以在細菌表面形成一層生物膜，不易被抗菌藥物滲透和殺滅，從而引起感染反復(fù)發(fā)作，而生物膜的形成也與QS系統(tǒng)密切相關(guān)。乳鐵蛋白多肽嵌合體(lactoferrin-derived peptides chimera，LFchimera)對銅綠假單胞菌具有殺菌作用，同時可以抑制生物膜及QS系統(tǒng)相關(guān)毒力因子的生成[4]，那么在臨床上被公認的具有抗銅綠假單胞菌作用的喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)與LFchimera聯(lián)用是否也有類似的甚至更強的的作用，目前國內(nèi)外報道甚少。因此，筆者以LFchimera為對照進一步研究CIP與LFchimera聯(lián)用對銅綠假單胞菌生物膜及QS系統(tǒng)信號分子?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserinelactone，AHL)生成的影響，為臨床治療銅綠假單胞菌感染提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 本研究所用銅綠假單胞菌野生菌株P(guān)AO1來自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院檢驗科微生物室；Escherichia coli(E.coli)MG-4(pKDT17)由本實驗室保存(系由華盛頓大學(xué)的 Greenberg教授惠贈)。

1.2 試劑 LFchimera(杭州中肽生化有限公司合成)；CIP、鄰硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)購自美國Sigma公司；胰蛋白胨、細菌蛋白胨、蛋白胨、胰酶大豆肉湯、酵母提取物均購自美國BD公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。本實驗室自行配制：溶菌肉湯(lysogeny broth,LB)培養(yǎng)液(10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1氯化鈉)；LB固體培養(yǎng)基(10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1氯化鈉，15 g·L-1瓊脂)；1 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(0.140 g·L-1磷酸氫二鉀，0.052 g·L-1磷酸二氫鉀)。

1.3 儀器 高速冷凍離心機(Centrifuge 5810R，德國Eppendorf公司；Universal 32R，德國Hettich Zentrifugen公司)；臺式恒溫振蕩器(培英THZ-D型，江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠)；Sunrise酶標儀(瑞士Tecan公司)；Elx800酶標儀(美國Bio-Tek公司)；細菌培養(yǎng)箱(WGP-350型隔水恒溫培養(yǎng)箱，上海安亭科學(xué)儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；紫外分光光度計(DU-640型，美國Beckman公司)；低溫冰箱(MDF U50V 型，日本Sanyo公司)。

1.4 方法 以銅綠假單胞菌野生菌株P(guān)AO1為實驗菌株，分為對照組(未干預(yù)的銅綠假單胞菌野生菌株P(guān)AO1)、CIP(0.04 μg·mL-1)組、0.25 μmol·L-1LFchimera組、1.00 μmol·L-1LFchimera組、CIP(0.04 μg·mL-1)+LFchimera(1.00 μmol·L-1)組，然后分別定量測定各組PAO1的生物膜和QS系統(tǒng)信號分子的表達，并進行比較。

1.4.1 生物膜定量檢測 生物膜的形成是通過檢測細菌在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)培養(yǎng)板表面生長黏附的能力進行定量的[5-6]：取-80 ℃凍存PAO1菌株100 μL接種于新鮮LB培養(yǎng)液5 mL，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜；將菌液涂布于LB平板上，37 ℃孵育約20 h，挑單克隆接種于新鮮LB培養(yǎng)液，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，然后用新鮮LB培養(yǎng)液洗滌、懸浮至A600為0.05，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用新鮮LB培養(yǎng)液稀釋至A600為0.05。在96孔PVC板中完成各組配液，于各組中分別加入細菌懸液95 μL，使CIP、LFchimera及CIP+LFchimera達到所需終濃度。37 ℃孵育24 h。每孔無菌純化水200 μL洗滌3次去除浮游細菌，靜置風(fēng)干后，每孔加入0.1%結(jié)晶紫150 μL在室溫靜置15 min，然后用無菌純水漂洗3次去除剩余結(jié)晶紫。再每孔加入95%乙醇200 μL洗脫生物膜上的結(jié)晶紫，靜置15 min。最后酶標儀檢測A590。

1.4.2 QS系統(tǒng)信號分子檢測 E.coli MG-4自身不能產(chǎn)生AHL分子，也不能合成β-半乳糖苷酶(lacZ)。質(zhì)粒pKDT17含有一個lasR lasB'-lacZ報告基因系統(tǒng)，lasR是銅綠假單胞菌密度感知系統(tǒng)的順式調(diào)控元件，只有當(dāng)AHL信號分子與lasR結(jié)合后才能啟動lasB'-lacZ基因的表達[7-9]。因此AHL檢測菌株E.coli MG-4(含有質(zhì)粒pKDT17)菌體內(nèi)β-半乳糖苷酶活性高低由外界AHL調(diào)控，能夠反應(yīng)所在環(huán)境中的AHL水平。β-半乳糖苷酶活性檢測采用鄰硝基酚β-D-半乳糖苷(ortho-nitrophenol beta-D-galactose glucoside,ONPG)法：β-半乳糖苷酶能將無色的ONPG水解為黃色的鄰位硝基苯酚(orho-nitrophenol,ONP)，然后通過分光光度計檢測產(chǎn)物ONP。操作步驟如下：挑取MG4單克隆37 ℃ 、200 r·min-1振搖12 h，稀釋至A600為0.1的細菌懸液；取-80 ℃凍存PAO1菌株100 μL接種于新鮮LB培養(yǎng)液5 mL，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，將菌液涂布于LB平板上，37 ℃孵育約20 h，挑單克隆接種于新鮮LB培養(yǎng)液，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，然后用新鮮LB培養(yǎng)液洗滌、懸浮至A600為0.05；于各組中分別加入銅綠假單胞菌細菌懸液5 mL，使CIP、LFchimera及CIP+LFchimera達到所需終濃度，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱200 r·min-1振蕩孵育24 h；1%(體積比)乙酸酸化的乙酸乙酯5 mL從各組銅綠假單胞菌過夜培養(yǎng)物10 mL中萃取AHL信號分子，分裝于離心管中干燥；在各組離心管中加入反應(yīng)緩沖液100 μL，反應(yīng)1min后加入LB培養(yǎng)液800 μL，加入MG4細菌懸液100 μL，30 ℃、200 r·min-1振搖5.5 h；12 000 r·min-1離心2 min后收集細菌，加入細菌裂解液裂解細菌，12 000 r·min-1離心10 min收集上清液；在總體積為1 mL的檸檬酸反應(yīng)緩沖液(0.1 mol·L-1檸檬酸用氫氧化鈉調(diào)至pH 4.5)中含0.8 μmol·L-1的ONPG，37 ℃孵育30 min后，用0.5 mol·L-1冷碳酸鈉1 mL終止反應(yīng)，用紫外分光光度計于420 nm波長處測定ONP的A值。

2 結(jié)果

生物膜定量表達及QS系統(tǒng)信號分子表達情況見表1。與對照組比較，CIP組、0.25 μmol·L-1LFchimera組、1.00 μmol·L-1LFchimera組、CIP+ LFchimera組的PAO1生物膜定量表達及QS系統(tǒng)信號分子表達均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。CIP組和0.25 μmol·L-1LFchimera組比較，PAO1生物膜的定量表達和QS系統(tǒng)信號分子表達的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。1.00 μmol·L-1LFchimera 組的PAO1生物膜定量表達及QS系統(tǒng)信號分子表達較0.25 μmol·L-1LFchimera組和CIP組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 CIP+LFchimera組和單獨用藥組比較，PAO1生物膜的定量表達及QS系統(tǒng)信號分子表達均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組銅綠假單胞菌的生物膜定量和QS系統(tǒng)信號分子的表達

與對照組比較，*1P<0.05；與1.00 μmol·L-1LFchimera組比較，*2P<0.05；與CIP+ LFchimera組比較，*3P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05；Compared with 1.00 μmol·L-1LFchimera group，*2P<0.05；Compared with CIP plus LFchimera group，*3P<0.05

3 討論

近年來人們對抗菌藥物的過分依賴和濫用，使得很多細菌對抗菌藥的敏感性不斷降低甚至消失，導(dǎo)致相關(guān)感染性疾病的臨床治療越來越棘手。銅綠假單胞菌是常見條件致病菌，多見于慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張等慢性肺部感染，是常見的醫(yī)院獲得性感染病原菌。生物膜的生成、多種毒力因子的產(chǎn)生是銅綠假單胞菌感染難治性的主要原因。由于生物膜可以保護細菌抵御抗菌藥物的殺傷和逃逸宿主的免疫，同時膜內(nèi)的細菌在適宜的條件下又可以從膜內(nèi)擴散、游離，引起機體的再次感染，給臨床治療帶來困難[10]。生物膜菌是一個群體組織，它由很多微菌落組成，并且各個細胞間有著嚴密的信號傳導(dǎo)來交流信息。銅綠假單胞菌主要依賴AHL作為信號分子。QS有兩種主要信號系統(tǒng)：las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)。其中l(wèi)asI和rhlI編碼AHL合成酶，進而催化AHL的合成[11]。QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)細菌群體的許多生理功能，如游動能力、顫搐運動、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、生物膜形成、毒力因子產(chǎn)生等[12]。因此，QS系統(tǒng)已成為控制生物膜相關(guān)性感染的新靶點。

CIP具有良好的藥動學(xué)特點和強大的殺銅綠假單胞菌活性，多年來一直是臨床上常用的抗銅綠假單胞菌藥物。研究表明，亞抑菌濃度的抗菌藥物對細菌可能有多方面的作用，并且完全不同于高濃度的抗菌藥物，如亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星、頭孢他啶、阿奇霉素均能降低由銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)調(diào)控的毒力因子的表達[13]。抗菌肽是一類具有廣泛的抗微生物作用的多肽，被稱之為 “自然抗菌藥物”。 乳鐵蛋白多肽(lactoferrin-derived peptides)是乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)經(jīng)胃蛋白酶水解產(chǎn)生的分子片段，具有比母分子LF更強的殺菌活性[14-16]。LF通過與鐵結(jié)合，抑制細菌生物膜形成，破壞細胞膜穩(wěn)定性，降解細菌毒力蛋白，防止致病菌入侵等多種方式發(fā)揮其廣譜抗菌作用[17]。Lactoferricin(LFcin)和Lactoferrampin(LFampin)是從牛乳鐵蛋白N端區(qū)域獲得的，具有抗多種革蘭陽性和革蘭陰性細菌活性的抗菌肽[16，18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，用賴氨酸將LFcin和LFampin連接生成的新分子LFchimera具有比構(gòu)成它的多肽LFcin和LFampin以及牛乳鐵蛋白更強的殺菌活性[20-21]。筆者之前的研究也發(fā)現(xiàn)LF、LFcin、LFampin和LFchimera可以抑制生物膜的形成，尤其是LFchimera的作用更明顯[4]。LFchimera還可能通過抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)減弱其毒力因子(綠膿菌素、彈性蛋白酶和蛋白水解酶)的表達[22]。而CIP和LFchimera聯(lián)用在抗銅綠假單胞菌毒力因子方面有協(xié)同作用[23]。

本次研究將亞抑菌濃度的CIP和LFchimera聯(lián)合作用于銅綠假單胞菌，觀察其對PAO1生物膜形成及QS系統(tǒng)信號分子生成的影響。結(jié)果顯示亞抑菌濃度(0.04 μg·mL-1)CIP、LFchimera都能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成。隨著濃度的提高，LFchimera對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用增強。亞抑菌濃度CIP對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用與低濃度LFchimera(0.25 μmol·L-1)相當(dāng)，但弱于較高濃度LFchimera(1.00 μmol·L-1)。CIP聯(lián)合LFchimera(1.00 μmol·L-1)組的生物膜定量表達較各自單獨用藥時有明顯降低，提示兩者聯(lián)用能增強對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用，說明兩者在抗銅綠假單胞菌生物膜形成方面有協(xié)同作用。由于銅綠假單胞菌生物膜的形成受QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)，因此CIP、LFchimera及兩者聯(lián)用對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用有可能是通過影響QS系統(tǒng)來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果也證實了CIP、LFchimera及兩者聯(lián)用能抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)信號分子的生成，且隨著濃度的提高，LFchimera對銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)信號分子生成的抑制作用增強，而CIP與LFchimera聯(lián)用的抑制作用更明顯。這為臨床上聯(lián)合運用抗菌藥物和抗菌肽治療銅綠假單胞菌感染提供了實驗依據(jù)。

綜上所述，LFchimera、CIP能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，LFchimera對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用隨著濃度的提高而增強，CIP與LFchimera聯(lián)用能增強對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用，提示兩者有協(xié)同作用。并且這種作用可能是通過抑制QS系統(tǒng)信號分子的生成來實現(xiàn)的。為進一步明確其機制，筆者將繼續(xù)深入研究CIP與LFchimera聯(lián)用后銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)相關(guān)基因的表達情況，為臨床用藥提供更明確的證據(jù)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.008

Inhibitory Effect of Ciprofloxacin Combined with Lactoferrin-derived Peptides Chimera on the Biofilm Formation and Production of the Signal Molecules of Quorum Sensing System inPseudomonasaeruginosa

ZUO Peng, WANG Aili，WANG Zhengyun，XU Guopeng, HU Qiongjie, SHAO Bing, XU Xilin, XIONG Weining，XIONG Shengdao

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030 ,China)

Objective To compare the inhibitory effect of single use of ciprofloxacin (CIP)，lactoferrin-derived peptides chimera (LFchimera) and combination of CIP plus LFchimera on the biofilm formation and production of the signal molecules of quorum sensing(QS) system inPseudomonasaeruginosa. Methods The wild type strain ofP.aeruginosa-PAO1 was used as test strain,which was divided into the control group , CIP(0.04 μg·mL-1)group, LFchimera(0.25 μmol·L-1and 1.00 μmol·L-1), CIP(0.04 μg·mL-1) plus LFchimera(1.00 μmol·L-1)one.The expression of biofilm and the signal molecules of QS in PAO1 were quantitatively determined respectively, and were compared among groups. Results Compared with those in the control group(1.511 3±0.031 8，0.502 5±0.028 3), the quantitative expression of biofilm and the signal molecules of QS in CIP group(1.073 3±0.010 9，0.245 3±0.014 0),LFchimera low dose group(1.065 5±0.011 4，0.235 9±0.010 7),LFchimera high dose group(0.665 3±0.012 9，0.108 6±0.007 0)and the combination group(0.122 1±0.013 0，0.048 2±0.005 4)were all significantly reduced (P<0.05).The quantitative expression of biofilm and the signal molecules of QS had no significant differences between the CIP group and LFchimera low dose group(P>0.05), were significantly lower in the LFchimera high does group compared to the LFchimera low dose group and the CIP group(P<0.05), and were remarkably lower in the combination group compared to single drug groups (P<0.05). Conclusion Both of CIP and LFchimera at sub-MICs could inhibit biofilm formation and the production of signal molecules of QS inPseudomonasaeruginosa.The inhibition effect of LFchimera is dose-dependent.This inhibitory effect could be further enhanced when CIP is combined with LFchimera, which indicats they have synergistic effect on the resistance of biofilm formation inPseudomonasaeruginosaby suppressing the production of the signal molecules of QS.

Ciprofloxacin；Lactoferrin；Pseudomonasaeruginosa；Biofilm；Quorum sensing system

2014-06-16

2014-08-08

*國家自然科學(xué)基金資助項目(30770946)；中國呼吸道感染優(yōu)化治療協(xié)作組(CROTC)科研專項基金資助項目(2009042)；國家“十二五”支撐課題(2012BAI05B01)

左鵬(1977-)，男，湖北武漢人，副主任醫(yī)師，碩士，從事呼吸道感染性疾病的研究。電話：027-83663615，E-mail：zuopeng1123@163.com。

熊盛道(1946-)，女，主任醫(yī)師 教授，博士生導(dǎo)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的臨床、科研、教學(xué)工作。電話：027-83662898，E-mail：xiongshengdao@sina.com。

R969；R965

A

1004-0781(2015)01-0035-05