程巧鴛，郭增喜，陳碧蓮

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004)

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定香丹注射液中5-羥甲基糠醛和酚酸類成分的含量*

程巧鴛，郭增喜，陳碧蓮

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004)

目的 建立同時(shí)測(cè)定香丹注射液中5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法。方法 采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.05%三氟乙酸溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1。外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果 5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的進(jìn)樣量與峰面積分別在0.002 73～1.364 00 μg(r=1.000 0)、0.274 80～13.740 00 μg(r=0.999 9)、0.034 64～1.732 00 μg(r=1.000 0)、0.053 59～2.680 00 μg(r=1.000 0)及0.105 30～5.264 00 μg(r=1.000 0)呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率依次為100.93%，101.36%，100.54%，105.14%，102.31%；RSD依次為1.00%，0.87%，0.51%，0.39%，1.91%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便快速，重復(fù)性好，適合于同時(shí)測(cè)定香丹注射液中5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和迷迭香酸的含量。

香丹注射液；5-羥甲基糠醛；丹參素鈉；原兒茶醛；迷迭香酸；丹酚酸B；色譜法，高效液相，反相

香丹注射液為臨床常用的中藥制劑，由丹參水提取液和降香經(jīng)水蒸氣蒸餾后的飽和溶液制備而成，具有擴(kuò)張血管、增進(jìn)冠狀動(dòng)脈血流量等作用，臨床上主要用于治療心絞痛、心肌梗死等?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》第17冊(cè)，“含量測(cè)定”項(xiàng)下僅控制原兒茶醛的含量[1]。研究表明，丹參的水溶性酚酸類$成分如丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B等均具有抗心肌缺血和缺氧的作用[2]。5-羥甲基糠醛是葡萄糖或果糖在高溫或酸性等條件下脫水產(chǎn)生的一個(gè)醛類化合物，普遍存在于中藥復(fù)方中，可導(dǎo)致橫紋肌損害和內(nèi)臟損傷等不良反應(yīng)[3-4]。筆者從中藥注射劑的有效性和安全性角度出發(fā)，建立同時(shí)測(cè)定香丹注射液中5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，以更好地控制制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，配備紫外檢測(cè)器。

1.2 試藥 5-羥甲基糠醛對(duì)照品(批號(hào)：111626-200804，純度>98%)，丹參素鈉對(duì)照品(批號(hào)：110855-200809，供含量測(cè)定用)、原兒茶醛對(duì)照品(批號(hào)：110810-200506，供含量測(cè)定用)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)：111562-200807，供含量測(cè)定用)、迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào)：111871-201001，含量98.8%)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余為分析純。香丹注射液樣品來(lái)源于全國(guó)11家生產(chǎn)企業(yè)，共20批。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉對(duì)照品、原兒茶醛對(duì)照品、迷迭香酸對(duì)照品和丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加0.2%醋酸的10%甲醇溶液制成每毫升含5- 羥甲基糠醛 2 μg、丹參素鈉0.20 mg、原兒茶醛50 μg、迷迭香酸50 μg和丹酚酸B 100 μg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液及缺丹參陰性對(duì)照溶液的制備 精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加0.2%醋酸的10%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。另取降香藥材，制備缺丹參陰性樣品溶液，精密量取上述溶液2 mL，同供試品溶液制備法制備缺丹參陰性對(duì)照溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%三氟乙酸水溶液(B)為流動(dòng)相，線性梯度洗脫(0～65 min，2%→30%A，98%→0%B；～66 min，30%→2%A，70%→98%B)；檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm；柱溫40 ℃；流速0.8 mL·min-1；進(jìn)樣體積5 μL。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液(每毫升含5-羥甲基糠醛2.728 μg、丹參素鈉0.274 8 mg、原兒茶醛34.64 μg、迷迭香酸53.59 μg、丹酚酸B 105.3 μg)1，2，5，10，20，30，50 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以最小二乘法計(jì)算得回歸方程，見表1。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

2.5.1 儀器精密度 精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，所得5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B峰面積的RSD依次為1.25%，0.07%，0.05%，0.11%和0.34%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一批樣品(批號(hào)110908s-1)各6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算得5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的RSD分別為0.58%，0.46%，0.45%，0.44%和0.36%。

A.缺丹參陰性對(duì)照溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.5- 羥甲基糠醛；2.丹參素鈉；3.原兒茶醛；4.迷迭香酸；5.丹酚酸B

圖1 3種溶液的HPLC圖

A.negative control solution withoutSalviamiltiorrhiza；B.mixed reference solution；C.test solution；1.5- hydroxymethyl furfural；2.sodiumdanshensu；3.protocatechuic aldehyde；4.rosmarinic acid；5.salvianolic acid B

Fig.1 HPLC chromatogram of three kinds of solutions

表1 5種對(duì)照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

Tab.1 Regression equations，correlation coefficient and linear range of five kinds of reference substance

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，18和24 h進(jìn)樣5 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算得5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的RSD分別為1.76%，0.13%，0.46%，0.15%和0.49%。

2.7 準(zhǔn)確度 采用加樣回收率實(shí)驗(yàn)法，精密量取已知含量樣品(批號(hào)110908s-1)1 mL，共6份，精密加入對(duì)照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，見表2。

表2 5種對(duì)照品加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定 取不同企業(yè)生產(chǎn)的樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)置了230，254，270，288，320 nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B在288 nm波長(zhǎng)處的紫外吸收較強(qiáng)，且基線平穩(wěn)，因此選擇288 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[5]。

3.2 流動(dòng)相選擇 實(shí)驗(yàn)中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-醋酸、乙腈-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸體系，最后確定乙腈-0.03%磷酸體系對(duì)注射液中5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B分離效果較好。但國(guó)家藥典委員會(huì)要求將丹參系列品種的流動(dòng)相進(jìn)行統(tǒng)一，故對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，由乙腈-0.03%磷酸溶液改為乙腈-0.05%三氟乙酸溶液[6]。

3.3 耐用性考察 實(shí)驗(yàn)中比較了不同酸度、不同流速、不同柱溫、不同儀器及不同色譜柱，包括不同品牌及同品牌不同批號(hào)色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，所得色譜圖基線平穩(wěn)，分離效果較好，表明所建立的色譜條件耐用性較好。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了香丹注射液中5種成分的含量，結(jié)果顯示該方法靈敏度高，重復(fù)性好，樣品處理方法簡(jiǎn)單，可作為香丹注射液質(zhì)量控制的方法。從測(cè)定結(jié)果看，不同企業(yè)生產(chǎn)的樣品中5-羥甲基糠醛的含量差異顯著。由于不同企業(yè)采用的原藥材及規(guī)格均為每支10 mL生產(chǎn)工藝均有所不同，且5-羥甲基糠醛會(huì)隨著加熱時(shí)間、酸度、溫度、儲(chǔ)藏而發(fā)生變化，因此亟需對(duì)其制定合理的限度以降低安全風(fēng)險(xiǎn)[7]。此外，不同企業(yè)生產(chǎn)的樣品其有效成分丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的含量差異也較顯著，因此亟待提高現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.025

Simultaneous Determination of 5-Hydroxymethylfurfural and Phenolic Acids inXiangdanInjection by RP-HPLC

CHENG Qiaoyuan,GUO Zengxi, CHEN Bilian

(ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl,Hangzhou310004,China)

Objective To establish a method for content determination of 5-hydroxymethylfurfural, sodiumdanshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinci acid and salvianolic acid B inxiangdaninjection by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) . Methods The analysis was performed on a Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column with acetonitrile-0.05% water solution of trifluoroacetic acid as mobile phase at the gradient elution mode with the flow rate of 0.8 mL·min-1.The column temperature was kept at 30 ℃ and the detector wavelength was set at 288 nm.The content was calculated with external standard method. Results The linear relationships between the concentration and peak area of 5-hydroxymethylfurfural, sodiumdanshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinci acid and salvianolic acid B were 0.002 73-1.364 00 μg(r=1), 0.274 80-13.740 00 μg(r=0.999 9),0.034 64-1.732 00 μg(r=1.000 0), 0.053 59-2.680 00 μg(r=1.000 0), and 0.105 30-5.264 00 μg(r=1.000 0), respectively.The average recovery and the RSD of the five components were 100.93%(1.00%)，101.36%(0.87%)，100.54%(0.51%)，105.14%(0.39%)，and 102.31%(1.91%), respectively. Conclusion This method has been proven to be simple, fast, reliable and reproducibile, which can be applied to the content determination of the five components inxiangdaninjection.

Xiangdaninjection; 5-Hydroxymethylfurfural; Sodiumdanshensu;Protocatechuic aldehyde; Rosmarinci acid; Salvianolic acid B; Chromatography,high performance liquid,reversed phase

2014-01-03

2014-06-16

*浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ12H28001)

程巧鴛(1981-)，女，浙江永康人，副主任藥師，博士，主要從事中藥質(zhì)量及其安全性研究。電話：0571-86459425，E-mail：cqy_427@126.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)01-0095-04