張任，陳琴華，，朱軍，余飛，

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院1.腎病內(nèi)科；2.藥物分析與篩選研究所，十堰 442008)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定蛇床子超臨界二氧化碳流體提取物中蛇床子素含量*

張任1，陳琴華1，2，朱軍2，余飛1，2

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院1.腎病內(nèi)科；2.藥物分析與篩選研究所，十堰 442008)

目的 建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定蛇床子超臨界二氧化碳(CO2)流體提取物中蛇床子素的含量。方法 樣品采用CO2超臨界流體萃取，萃取液用乙酸乙酯溶解，選擇監(jiān)測離子法測定蛇床子素的含量。色譜條件：DB-5MS(30 m×0.32 mm，0.25 μm)石英毛細(xì)管色譜柱；柱流速2.0 mL·min-1，柱溫60 ℃保持2 min，以10 ℃·min-1到280 ℃，保持6 min；進(jìn)樣口和接口溫度為280 ℃。結(jié)果 蛇床子素在5～1 000 μg·mL-1線性關(guān)系良好，r=0.999 1，平均回收率為98.97%，檢測限1.0 ng·mL-1。結(jié)論 該方法穩(wěn)定可靠，適用于蛇床子藥材的質(zhì)量控制。

蛇床子；蛇床子素；色譜-質(zhì)譜，氣相

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HA220-50-06超臨界萃取裝置(南通市華安超臨界萃取有限公司)；GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，工作站為GCMSsolution 2.10，DB-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細(xì)管氣相色譜柱(安捷倫公司)；SK-1型快速混勻器(江蘇國華儀器廠)；AS3120超聲儀。

1.2 試藥 蛇床子素(中國食品藥品檢定研究院，批號：110822 - 20040)；蛇床子購置西安市中藥材公司，傘形科植物蛇床(CnidiummonnieriL.Cuss.)的干燥果實；高純氦氣(昆山普克萊斯實用氣體有限公司，其純度≥99.999%)；乙酸乙酯(分析純，西安化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 DB-5(30 m×0.32 mm，0.25 μm)毛細(xì)管氣相色譜柱為分析柱；以高純氦氣為載氣，流速2.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度280 ℃，程序升溫：起始溫度60 ℃，保持2 min，以10 ℃·min-1速率升溫至280 ℃，保持6 min；進(jìn)樣量為1 μL，接口溫度280 ℃，EI源溫度200 ℃，電子轟擊能量為70 eV，采集延時2.5 min；定性分析：進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比為50：1，定量分析：進(jìn)樣方式不分流進(jìn)樣，質(zhì)荷比(m/z)為244(蛇床子素)。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取蛇床子素對照品20 mg，置于10 mL量瓶中，用乙酸乙酯溶解，并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。配制蛇床子素對照品貯備液，濃度均為1.0 mg·mL-1，按要求稀釋成一系列濃度分別為5，10，50，100，500，1 000 μg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取干燥的蛇床子藥材，粉碎后過孔徑1.18 mm篩。稱取藥材1 250 g，投入萃取釜(5 L)，對萃取釜、分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ分別加熱，并啟動冷機(jī)制冷。當(dāng)溫度分別達(dá)到萃取釜45 ℃、分離釜Ⅰ40 ℃、分離釜Ⅱ36 ℃時，CO2經(jīng)冷機(jī)儲罐冷凝后，通過高壓泵打入萃取釜和兩個分離釜，流速45～50 L·h-1。當(dāng)萃取釜和分離釜的壓力分別達(dá)到30，5，5 MPa時，開始循環(huán)萃取。并保持恒溫恒壓，萃取2.0 h后，從分離釜Ⅰ出料口放出黃棕色液體[4]。總萃取率為6.4%。精密稱取其超臨界提取物100 mg，置100 mL量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 色譜條件的確立 在上述色譜條件下，蛇床子素對照品進(jìn)樣分析，其全離子掃描色譜圖見圖1，在18.3 min對應(yīng)的質(zhì)譜圖見圖2，經(jīng)GCMSsolution 2.10版軟件里的NIST147檢索，其為蛇床子素，相似度達(dá)98%。從質(zhì)譜圖可見，其碎片質(zhì)譜離子有m/z244，229，213，189，159，131和115。蛇床子素相對分子質(zhì)量為244，從圖2看見，m/z244和229豐度較高，考慮樣品中碎片離子的干擾，選擇分子離子峰m/z244作為定量監(jiān)測離子進(jìn)行分析。

Fig.1 Total ion current chromatogram of osthole by GC-MS full scan

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.2” 項下的系列濃度的對照品，按上述分析條件進(jìn)樣1 μL，以蛇床子素的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，蛇床子素：Y=9 895.7X-16 459，r=0.999 1。結(jié)果表明蛇床子素在5～1 000 μg·mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，S/N=3時，測得蛇床子素的檢測限為0.1 ng·mL-1。

2.4.3 精密度實驗 取“2.2” 項下3個濃度的對照品溶液5 μg·mL-1(低濃度)、100 μg·mL-1(中濃度)和1 000 μg·mL-1(高濃度)，按上述分析條件進(jìn)樣1 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，計算蛇床子素的峰面積的RSD，蛇床子素高、中、低濃度的RSD分別為1.42%，1.31%，2.18%，精密度均良好。

2.4.4 重復(fù)性實驗 按“2.3” 項下分別制備供試品溶液6份，按上述分析條件進(jìn)樣1 μL，以蛇床子素含量計算RSD為1.45%，表明重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性實驗 取樣品溶液，分別于0，1，2，4，8 h進(jìn)樣，計算蛇床子素的RSD，其RSD為1.80%，被分析化合物在8 h為穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率實驗 精密量取同一樣品(20.12 μg·mL-1)0.5 mL，共6份，每份加入濃度26.6 μg·mL-1對照品溶液0.5 mL，按供試品溶液的處理方法提取得供試品溶液，進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計算回收率見表1。其平均回收率為98.97%，RSD為1.24%。

表1 蛇床子素加樣回收率結(jié)果

2.5 樣品的測定 取“2.3” 項下制備的3個樣品，按照“2.4.1” 項下色譜條件進(jìn)行測定，其含量分別12.9，12.7和13.2 mg·g-1，平均含量為12.9 mg·g-1。

3 討論

超臨界萃取法尤其適用于中草藥的提取精制，而且超臨界提取得到目標(biāo)物純凈，無需太多處理就可直接進(jìn)樣。筆者采用GC-MS選擇離子監(jiān)測法測定蛇床子中蛇床子素的含量，從色譜圖可以看出，其專一性強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)和回收率達(dá)到了含量測定的要求，而且檢測限低(1.0 ng·mL-1)，可以用來測定蛇床子素含量。

[1] 吳芳，劉新宇，范國榮.等.蛇床子有效成分的RP-HPLC測定及其1種提取方法的比較研究[J].中國野生植物資源，2000，20(6)：32-33.

[2] 李鵬，陳琴華，朱軍，等.高效液相色譜法測定利夫康洗液中蛇床子素的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，30(6)：785-786.

[3] 陳琴華，胡文姬，王眾勤，等.反相高效液相色譜法測定潔爾陰洗液中蛇床子素含量[J].中國藥業(yè)，2010，19(19)：29-30.

[4] 宮竹云，張高勇，聶永亮，等.超臨界CO2萃取工藝對蛇床子素提取物提取率的影響[J].中成藥，2006，28(8)：1102-1105.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.027

Quantitative Determination of Osthole in Supercritical CO2Fluid Extracts ofCnidiummonnieriby Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHANG Ren1, CHEN Qinhua1,2, ZHU Jun2, YU fei1,2

(1.RenalMedicine; 2.InstituteofPharmaceuticalAnalysisandDrugScreening,AffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442008,China)

Objective To establish a method for content determination of osthole fromCnidiummonnieriin supercritical fluid CO2(SFE-CO2) extract by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Methods The sample was extracted fromCnidiummonnieriby SFE-CO2and solved by acetic ether.The content of ostholei determined by GC-MS with selected ion monitor(GC-MS/SIM).Separation was performed on DB-5MS capillary column (30 m×0.32 mm，0.25 μm) at the flow rate of 2.0 mL·min-1.The column temperature was started at 60 ℃ for 2 min, then increased to 280 ℃ at 10 ℃·min-1and maintained at 280 ℃ for 6 min.The temperature of both interface and inlet was kept at 280 ℃. Results The linear range of osthole was within 5-1 000 μg·mL-1(r=0.999 1).The mean extraction recovery was 98.97% and limit of detection was 1.0 ng·mL-1. Conclusion The method is reliable and stable,which can be applied to quality control of Cndium monnieri.

Cnidiummonnieri; Osthole; Chromatography-mass spectrometry, gas

2013-11-28

2014-03-21

*湖北省衛(wèi)生廳青年科技人才項目(QJX2012-45)；湖北省教育廳科研計劃項目(D20132106)

張任(1981-)，男，湖南衡陽人，主治醫(yī)師，學(xué)士，研究方向：腎病學(xué)與藥學(xué)。電話：0719-8272348，E-mail：113830202@qq.com。

陳琴華(1976-)，男，湖北荊門人，副主任藥師，博士，研究方向：藥物分析學(xué)。電話：0719-8272351，E-mail：cqh77@163.com。

R282.71；R927.2

B

1004-0781(2015)01-0102-03